一种超临近流体提取鸡骨香根提取物及其方法、应用与流程

本发明属于药物提取技术领域，具体涉及一种超临近流体提取鸡骨香根提取物及其方法、应用。

背景技术：

巴豆属是大戟科，在全球拥有超过1300种，是广泛分布于热带和亚热带地区的一个大属。中国大约生长有21种巴豆属植物，其中一些长期以来被用于缓解痛经和中医治疗消化不良和疟疾。巴豆属的植物以其多种萜类化合物而闻名，具有广泛的生物活性。此外，还获得了生物碱，黄烷酮，木脂素，多酚化合物，苯基丁酸和肽。

crotoncrassifoliusgeisel是巴豆属的一种，主要分布于中国南部和东南亚其他地区。作为一种名为“鸡骨香”的中药材，其根已被用于治疗癌症，胃痛，喉咙痛和风湿病。现有的植物化学研究表明，c.crassifolius中的主要植物化学物质是萜类化合物，包括倍半萜，二萜和三萜。二萜被认为是c.crassifolius中的主要和特征化合物，具有各种生物活性，如抗病毒和抗血管生成活性。

目前，关于c.crassifolius的大多数研究都关注其根提取物在医学中的应用，并且很少研究其低极性部分的利用。现有技术中，据报道该草药的低极性部分含有丰富的活性化合物，但是具体的研究较少。尚未有本发明化合物提取的相关记载。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种超临近流体提取鸡骨香根提取物，该提取物具有高的抗肿瘤活性，具有抗增殖和诱导细胞凋亡的作用。

本发明还提供了一种超临近流体提取鸡骨香根提取物的提取方法。

本发明另一目的在于提供了一种上述鸡骨香根提取物的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

一种超临界流体提取鸡骨香根提取物，所述提取物的结构式如下：

本发明还提供了一种超临界流体提取鸡骨香根提取物的方法，包括以下步骤：

（1）取鸡骨香干燥根，粉碎，过40目筛，称取样品，装入超临界co2流体萃取仪的反应釜中，首先静态提取，接着动态提取，以甲醇为夹带剂，获得深黄色浸膏，将浸膏用温水冲散，以二氯甲烷充分萃取，得萃取物；

（2）配制洗脱剂，极性梯度为石油醚/丙酮(50:1~1:2)，每个比例洗脱5.0l，将萃取物经薄层色谱分析，选择石油醚-丙酮分离体系，用100-200目硅胶干法装柱，进行粗分；薄层色谱检测合并，获得5个组分a1～a5；

（3）将a4用200-300目硅胶细分；配制石油醚-乙酸乙酯体系洗脱液进行梯度洗脱，极性梯度为8:1-5:1，将薄层色谱检测合并为6个部分a4a-a4f；a4f部分先经sephadexlh-20柱层析，以二氯甲烷-甲醇反复洗脱，取中间段经c18柱并65-85%ch3oh/h2o(2ml/min,20min)梯度洗脱，紫外检测器210nm处检测，将14.600min馏分浓缩后继续以55%ch3cn/h2o(2ml/min)等度洗脱，获得鸡骨香提取物，命名为化合物j-1。

进一步的，所述静态提取为在压力25mpa，温度35℃条件下提取30min。

进一步的，所述动态提取时，co2流速5.0l/min，以甲醇为夹带剂，甲醇的流速为5.4ml/min。

进一步的，所述a1为石油醚/丙酮=50:1-30:1部分；a2为石油醚/丙酮=15:1部分；a3为石油醚/丙酮=10:1-8:1部分；a4为石油醚/丙酮=6:1-2:1部分；a5为石油醚/丙酮=1:1-1:2部分。

进一步的，所述a4a-a4f分别为：0-800ml;800-2000ml;2000-2800ml;2800-4000ml;4000-52000ml;5200-6000ml。

进一步的，步骤（3）中，所述二氯甲烷-甲醇的体积比为1：1。

本发明还提供了一种上述提取方法提取的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明从鸡骨香中提取的化合物具有抑制a549细胞增殖并将a549细胞周期阻滞于g2/m期。化合物增加了a549细胞中bax/bcl-2的比例，导致线粒体膜电位崩溃，随后细胞色素c的释放和caspase级联反应的激活，导致parp的裂解和最终的细胞凋亡。通过主动追踪方法分离天然二萜类化合物1，并且抗增殖评价证明其作为未来抗癌疗法候选物的潜力。

本发明的有益效果为：

（1）本发明提取的化合物药物原料易得，易于产业化，可以根据需要制备成不同的剂型，具有巨大的社会效益。

（2）本发明提取的化合物，纯度高，且抗肿瘤活性高，具有抗增殖和诱导细胞凋亡的作用，具有作为抗癌疗法候选物的潜力。

附图说明

图1为化合物j-1的hmbc和rorsy的谱图，以及ecd光谱。

图2为不同浓度的化合物j-1对a549细胞迁移的影响图。

图3为不同浓度的化合物j-1处理肺癌细胞a549细胞后，用hoechst33258染色图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

（1）材料和方法

crassifolius根于2017年10月在中国安徽亳州的中草药市场购买。该物种由山东省农业科学院农产品研究所单成钢教授鉴定（iast，saas），济南，中国。凭证样本（no.17-10-29）保存在saas的iast生物活性物质和功能食品实验室。

（2）提取过程：

取鸡骨香干燥根，中药粉碎机粉碎，过40目筛(450μm)。称取2.0kg样品，分10次装入超临界co2流体萃取仪的反应釜(650ml)中，每次200g。在25mpa、35^oc下静态提取30分钟，接着动态提取30分钟(co2流速5.0l/min)，以甲醇为夹带剂(流速5.4ml/min)。共获得深黄色浸膏100.4g，将浸膏用500ml温水冲散，以二氯甲烷r(500ml×5次)充分萃取，共得到萃取物77.0g；

经薄层色谱分析，选择石油醚-丙酮分离体系。用100-200目硅胶干法装柱，进行粗分。配制洗脱剂，极性梯度为石油醚/丙酮(50:1~1:2)，每个比例洗脱5.0l，薄层色谱检测合并，获得5个组分a1~a5。

a4(石油醚/丙酮=6:1-2:1部分，7.3g)用200-300目硅胶细分。配制石油醚-乙酸乙酯体系洗脱液进行梯度洗脱，极性梯度为8:1-5:1，在8:1部分析出无色块状晶体，薄层色谱检测不纯，甲醇溶解后以半制备液相进一步纯化，经c18柱并65-85%ch3oh/h2o(2ml/min,20min)梯度洗脱，紫外检测器210nm处检测，获得化合物j-11(4.1mg,tr16.800min)；将母液再次薄层色谱检测合并为6个部分a4a-a4f；a4f部分先经sephadexlh-20柱层析，以二氯甲烷-甲醇(1:1)反复洗脱，取中间段经c18柱并65-85%ch3oh/h2o(2ml/min,20min)梯度洗脱，紫外检测器210nm处检测，将14.600min馏分浓缩后继续以55%ch3cn/h2o(2ml/min)等度洗脱，获得化合物j-1(2.4mg,tr23.492min)，具体结构式如下：

（3）实验程序

室温下在autopolvi旋光仪上测量旋光度。利用nicoletir200ft-ir分光光度计记录红外辐射（ir）光谱。在shimadzuuv-2550分光光度计上获得uv数据。ecd数据在jasco810分光光度计上获得。利用brukeravancedrx-400光谱仪在600mhz（¹h）和150mhz（¹³c）下记录nmr光谱。hr-esi-ms在agilenttechnologies6224toflc-ms装置上进行。用硅胶（200-300目，qingdaomarinechemical，inc。）和ods（siliaspherec18s03230g-a，silicycle）进行柱色谱（cc）。半固定化hplc在agilenttechnologies1260infinity上与agilentg1321bdad检测器和silgreengh0525010c18a柱（250×10mm，5μm，120å）偶联进行。

（4）细胞系和细胞培养

a549肺癌细胞系和hela宫颈癌细胞系购自中国科学院（中国上海）的细胞库类型培养物保藏中心。将a549细胞在含有10％胎牛血清（gibco）和100u/ml青霉素-链霉素（hyclone）的rpmi-1640（hyclone）中培养。将hela细胞在含有10％胎牛血清（gibco）和100u/ml青霉素-链霉素（hyclone）的dmem（hyclone）培养基中培养。所有细胞在37℃，95％空气和5％co2的气氛下在潮湿条件下培养。

（5）结果讨论

①本发明分离的化合物j-1，为白色粉末，其分子式c21h22o7通过hr-esi-ms在m/z下测定：387.1311[m+h]⁺（cal.[c21h22o7+h]⁺：387.1366），包括11个不饱和度。ir吸收带1对应于呋喃环（3142,1452,863cm^-1）和典型内酯（1753,1194cm^-1）吸收的存在。

1的¹h-nmr光谱显示甲基[δh1.15（3h,d,j=7.2hz）]，甲氧基[δh3.79（3h,s）]和特征β-取代呋喃环[δh7.49（1h,m）,δh7.47（1h,m）,δh6.42（1h，m）]。

¹³c-nmr谱中有21个碳信号，δc134.2和δc132.0显示为不饱和键。δc176.1，δc172.4和δc168.2表明三个酯基连接于化合物1上。在hsqc光谱的帮助下，碳信号被指定为一个甲基（δc16.1），一个甲氧基（δc53.2）和呋喃环在δc144.4，δc139.6，δc124.6，δc108.0。h-14（δ6.42,1h，m）与c-13（δ124.6），c-15（δ144.4）和c-16（δ139.6）的hmbc相关性（图1）进一步证实了呋喃环的存在。从h-12（5.48,1h,t,j=8.64hz）到c-13（δ124.6），c-14（δ108.0）和c-16（δ139.6）的hmbc相关性表明呋喃环位于在c-12。h-17（δ1.15，3h，d，j=7.20hz）与c-7（δ32.4）和c-9（δ53.0）相关，表明甲基（δ34.8）位于c-8位。与c-19相关的δh3.79（3h,s）表明甲氧基与该结构连接。此外，h-3（δ1.38）与c-19相关，表明该甲基甲氧基位于c-4。所有分配的质子和碳信号汇总于表1中。

表1

通过ecd和roesy实验确定1的构型（图1）。在ecd光谱中观察到220-240nm的负吸收效应与9r和12s构型一致。h-6（δ5.19）/h-8（δ1.97）/h-12（δ5.48）的roe相关性表明这些质子是α-取向的，表明位于c-8的甲基和在c-4处连接的甲氧基位于平面的的另一侧。确认j-1的绝对构型为4s，6r，8s，9r和12s，化合物j-1最终命名为crassifoliusp。

②化合物j-1的细胞毒活性

本发明提取的化合物对抗a549和hela具有与阳性对照药物苦参碱类似的细胞毒活性，具体见表2，本发明提取的化合物对a549细胞显示出高的细胞毒活性。hl-7702是一种正常的人肝细胞系，用于评估我们所分离化合物的细胞毒性作用，结果是肝细胞对受试化合物的细胞毒性作用不太敏感，ic50值高达100μm。这些结果表明，化合物j-1对癌细胞系，特别是a549具有非常明显的选择性。

表2

ι划痕实验

将对数生长期a549细胞接种在6孔板中，37°培养箱中孵育过夜，待细胞达到单层融合时，用200μl枪头进行划痕，立即置于倒置显微镜下随机选取视野进行拍照，记录0h时的划痕宽度。随后将不同浓度的化合物j-1（0,15,25,35μm）加入到细胞中，在药物作用不同的时间点时进行拍照，观察细胞的迁移距离。并用imagej及graphpad软件进行量化。

通过划痕实验检测不同浓度的本发明提取的化合物对a549细胞迁移的影响，如图2所示。结果显示，与对照组0μm相比，随着药物浓度的增加，细胞迁移的速度逐渐减弱。定量结果显示，在35μm时，细胞的迁移能力下降了50%。以上结果表明，化合物j-1以浓度依赖的方式能够抑制a549人肺癌细胞迁移。

ⅱ化合物j-1能够促进a549细胞凋亡

将对数生长期a549细胞接种在12孔板中，37°培养箱中孵育过夜，弃掉孔中原有培养基，将含有不同浓度化合物j-1（0,15,25,35μm）的培养基加入到细胞中，待化合物作用48h。弃掉孔中培养基，pbs洗涤一次，加入4%多聚甲醛固定15min，pbs洗涤三次，随后加入hoechst3328染液，37℃孵育15min，弃掉上清，pbs洗涤2-3遍，随后置于荧光显微镜下观察，进行拍照。正常细胞的细胞核会出现淡染的现象，当细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈深染亮然，或呈碎块状致密浓染及凋亡小体的出现。

hoechst33258是针对细胞核进行染色的染料，从一个侧面可以反映细胞凋亡的数量。本发明在不同浓度的化合物j-1（（0,15,25,35μm）处理肺癌细胞a549细胞后，用hoechst33258进行染色，如图3所示，结果发现，与对照组相比，随着浓度的升高，深染细胞增多，细胞核浓缩并且有凋亡小体的出现）。说明穿化合物j-1能够诱导a549人肺癌细胞凋亡，并且随着药物浓度的升高，凋亡率上升。