高血压性脑出血的早期诊断标志物的制作方法

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于诊断高血压性脑出血的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-setd6基因在制备诊断高血压性脑出血的产品中的应用。

背景技术：

高血压性脑出血(hypertensivecerebralhemorrhage，hch)系由脑内动脉、静脉或毛细血管破裂引起脑实质内的一种自发性脑血管病，具有高血压特性，又称高血压性脑出血。高血压性脑出血是一种高发病率、高致残率和高致死率的全球性疾病，是危害人类健康既常见又严重的疾病。

高血压病常导致脑底的小动脉发生病理性变化，突出的表现是在这些小动脉的管壁上发生玻璃样或纤维样变性和局灶性出血、缺血和坏死，削弱了血管壁的强度，出现局限性的扩张，并可形成微小动脉瘤。高血压性脑出血即是在这样的病理基础上，因情绪激动、过度脑力与体力劳动或其它因素引起血压剧烈升高，导致已病变的脑血管破裂出血所致。其中豆纹动脉破裂最为多见，其它依次为丘脑穿通动脉、丘脑膝状动脉和脉络丛后内动脉等。因此，高血压性脑出血有其特别的好发部位，据大宗病例统计，55％在壳核(外囊)区，15％在脑叶皮层下白质内，10％在丘脑，10％中桥脑，10％在小脑半球。而发生于延髓或中脑者极为少见。有时血肿扩大可破入脑室内，但一般不会穿破大脑皮层引起蛛网膜下腔出血。病理方面，血肿造成周围脑组织受压、缺血、脑梗塞、坏死、同时伴以严重脑水肿，易由此发生急剧的颅内压增高与脑疝。

高血压性脑出血不等同于脑出血(cerebralhemorrhage，ch)，脑出血又称脑溢血，系指脑实质内的血管破裂引起大块性出血所言，约80％发生于大脑半球，以底节区为主，其余20％发生于脑干和小脑。高血压和动脉硬化是脑出血的主要因素，还可由先天性脑动脉瘤、脑血管畸形、脑瘤、血液病(如再生障碍性贫血、白血病、血小板减少性紫癜及血友病等)、感染、药物(如抗凝及溶栓剂等)、外伤及中毒等所致。

目前临床上，头颅ct平扫为首选检查，可以迅速明确脑内出血的部位、范围和血肿量，以及血肿是否破入脑室，是否伴有蛛网膜下腔出血等，也可鉴别脑水肿和脑梗死。血肿的占位效应可通过侧脑室的受压移位、大脑镰的移位及基底池的丧失来推测，这有助于治疗方案的选择和预后的判断，还可根据血肿部位和增强后的ct表现来鉴别其他病因，如血管畸形、动脉瘤、肿瘤等。在2000年以前的观点中认为头颅ct是诊断脑出血最有价值的检查手段，ct的检出比mri高，有效。在很长一段时间内ct都成为神经内科比较重要的检查手段，比mri的应用范围广，但是在6小时内这一时期中患者的检出率并不是很高，这就造成了在临床上对于脑梗死和脑出血患者的治疗结果很多并不满意，患者甚至在治疗后出现了疾病加重的情况。

当怀疑引起脑出血的病因是高血压以外的因素时，进行mri检查是有价值的，可以鉴别诊断脑血管畸形、肿瘤、颅内巨大动脉瘤等。但mri检查费时较长，病情较重的急性病例在检查时，必须对病人的生命体征和通气道进行监护，以防意外。另外，不同时期血肿的mri表现也较为复杂，有时反而给诊断带来困难。

因此亟待开发一种在高血压性脑出血早期通过简单检测即可诊断高血压性脑出血发生的方法。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于高血压性脑出血早期诊断的分子标志物。相比传统的高血压性脑出血的诊断方法，使用基因标志物来诊断高血压性脑出血具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测setd6基因表达的产品在制备诊断高血压性脑出血的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测setd6基因表达的产品包括：通过反转录-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测setd6基因表达水平以诊断高血压性脑出血的产品。

进一步，所述用反转录-pcr诊断高血压性脑出血的产品至少包括一对特异扩增setd6基因的引物；所述用实时定量pcr诊断高血压性脑出血的产品至少包括一对特异扩增setd6基因的引物；所述用免疫检测诊断高血压性脑出血的产品包括：与setd6蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断高血压性脑出血的产品包括：与setd6基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断高血压性脑出血的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与setd6蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与setd6基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断高血压性脑出血的产品至少包括一对特异扩增setd6基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测setd6基因表达的产品可以应用于该平台实现对setd6基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知setd6基因的异常与高血压性脑出血相关也属于setd6基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断高血压性脑出血的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测setd6基因转录水平的针对setd6基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的setd6蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括setd6基因在内的多个基因(例如，与高血压性脑出血相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括setd6蛋白在内的多个蛋白质(例如与高血压性脑出血相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与高血压性脑出血的标志物同时检测，可大大提高高血压性脑出血诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测setd6基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括setd6蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测setd6基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对setd6基因的引物和/或探针。根据setd6基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测setd6基因表达水平的引物和探针。

与setd6基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测setd6基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测setd6基因的转录水平。

进一步，所述setd6蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述setd6蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与setd6蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对setd6基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。

用于诊断高血压性脑出血的setd6基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断高血压性脑出血的setd6基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“setd6基因”包括setd6基因以及setd6基因的任何功能等同物的多核苷酸。setd6基因(chromosome16,nc_000016.10(58515479..58521990))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

在本发明的上下文中，setd6基因表达产物包括setd6蛋白以及setd6蛋白的部分肽。所述setd6蛋白的部分肽含有与高血压性脑出血相关的功能域。

“setd6蛋白”包括setd6蛋白以及setd6蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括setd6蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与setd6的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是setd6蛋白的融合蛋白。对于与setd6蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留setd6蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断高血压性脑出血”既包括判断受试者是否已经患有高血压性脑出血、也包括判断受试者是否存在患有高血压性脑出血的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了setd6基因表达与高血压性脑出血相关，通过检测受试者中setd6的表达，可以判断受试者是否患有高血压性脑出血、或者判断受试者是否存在患有高血压性脑出血的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-setd6基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现高血压性脑出血的早期诊断，从而降低高血压性脑出血的死亡率。

附图说明

图1显示利用qpcr检测setd6基因在高血压性脑出血患者和正常人中的差异表达情况的柱状图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达基因

1、研究对象

研究对象临床信息见表1。

2、血液中总rna的提取

(1)匀浆处理(homogenization)

直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol。

(2)分层(phaseseparation)

a.样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

b.每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

(3)rna沉淀(rnaprecipitation)

a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。

b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。

(4)rna漂洗(rnawash)

a.rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。

b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。

(5)溶解rna(redissolvingtherna)

沉淀中加入50-100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-70℃保存。

3、rna浓度与质量检测

rna浓度：使用nanodrop进行rna浓度检测。

rna质量：可通过rna完整性(rin)来表示，也可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×tbe电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。

检测结果如表2所示。

表2rna浓度与质量检测结果

4、建库及测序流程

1)dnaseⅰ消化：取一定量在总rna样品，配制消化体系，在thermomixer中适温反应一定时间，利用dnasei消化totalrna样品中存在的dna片断。沉淀回收反应产物，最后溶解于depc水；

2)mrna的分离：取消化的总rna样品，先在thermomixer上适温变性，打开其二级结构，再利用oligo(dt)磁珠分离出mrna后使用缓冲液对分离出的mrna进行洗脱；

3)mrna的打断：将上一步得到的mrna置于冰上，加入打断试剂，在thermomixer中适温反应一定时间后，沉淀回收打断产物，溶解于depc水中；

4)反转录一链的合成：向打断后的mrna中加入适量引物，充分混匀后在thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系，在pcr仪上按相应程序合成一链cdna；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在thermomixer上适温反应一定时间，合成二链cdna，反应产物用试剂盒进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cdna双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用试剂盒进行纯化回收，最后将样品溶于ebsolution；

7)cdna3’末端加“a”：配制加“a”反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cdna的3’末端加上a碱基。加“a”产物用试剂盒进行纯化回收；

8)cdna5’adapter的连接：配制接头连接酶反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与a碱基连接，产物用试剂盒进行纯化回收；

9)连接产物胶回收：对连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶选择所需的dna片段大小，用试剂盒进行纯化回收；

10)pcr反应及产物回收：配制pcr反应体系，选择适当的pcr反应程序，对上步骤得到的连接产物进行扩增。对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶选择所需的dna片段大小，用试剂盒进行纯化回收。回收产物溶于eb溶液中。贴上标签，文库制备至此完成；

11)文库质量检测：使用agilent2100bioanalyzer和abisteponeplusreal-timepcrsystem对文库质量进行检测；

12)上机测序：使用illuminahiseqx-ten平台进行测序，pe150策略。测序数据见表3所示。

表3测序数据

5、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

5.1原始测序数据质量剪切

由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、n率较高序列及长度过短序列的数据，这将严重影响后续组装的质量。为保证后续生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(cleandata)。具体步骤如下：

1)去除reads中的adapter序列；

2)剪切前去除5’端含有非agct的碱基；

3)修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于q20)；

4)去除含n的比例达到10％的reads；

5)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。

然后对质量修剪前后的序列进行数据量统计。

分析软件：cutadapt，版本为v1.16，http://cutadapt.readthedocs.io，参数为-q20-m20。fastqstat.jar，版本为v1.0，自定义脚本，参数为默认参数。

5.2比对分析

将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，研究物种为人，参考基因组来自于ensembl数据库，基因组版本grch38，基因注释信息为ensemble92。

分析软件：hisat2，版本为v2.1.0，https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml，参数为-p10--rna-strandnessrf。

5.3mrna表达量评估

转录本的丰度体现了基因的表达水平，转录本丰度越高，则基因表达水平越高。在rna-seq分析中，通过比对到参考基因组区域的序列(cleanreads)的数量来计算基因的表达水平。stringtie根据hisat2软件的比对结果，结合mrna的基因注释信息，计算每个基因/转录本在样本中的fpkm值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。

分析软件：stringtie，版本为v1.3.3b，http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/。ballgown，版本为v2.14.0，

http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ballgown.html。

5.4差异表达mrna分析

r包deseq2比较各组mrna的表达差异。

deseq2(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/deseq2.html)。该软件是一个从rna-seq数据中识别差异基因的r软件包，其基于二项分布模型集成了fisher检验和似然比检验进行差异表达检验，也提供基因标准化的表达量给其他软件进行检验。

差异表达mrna筛选标准为：pvalue<0.05&|log2foldchange|>1。共得到1649(上调1034，下调615)个差异表达mrna。其中，相比正常人而言，高血压性脑出血患者血液中setd6基因表达显著下调。

实施例2大样本验证差异表达基因

1、研究对象：

筛选标准同实施例1，高血压性脑出血患者和正常人各30例。

2、血液中总rna的提取

步骤同实施例1。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、qpcr

(1)引物设计

根据genbank中setd6基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

setd6基因：

正向引物为5’-aattgtcttcggatggta-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-ttgtcaggatatggttca-3’(seqidno.2)，

gapdh基因：

正向引物为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

(2)按照表1配制pcr反应体系：

其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。

表1pcr反应体系

(3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃10s，52℃40s)*40个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果显示，与30例正常人平均水平相比，30例高血压性脑出血患者中有29例患者血液中setd6基因mrna水平显著下调，其中1例无明显变化排除在统计之外。统计结果如图1所示，相比正常人，高血压性脑出血患者血液中setd6基因mrna水平显著下调，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同测序实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国人民解放军联勤保障部队第九八0医院

<120>高血压性脑出血的早期诊断标志物

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aattgtcttcggatggta18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttgtcaggatatggttca18

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tttaactctggtaaagtggatat23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggtggaatcatattggaaca20