一种RAGE拮抗多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及一种rage拮抗多肽及其应用。

背景技术：

乳腺癌(breastcancer)是指发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。4％～6％乳腺癌诊断时即为转移性乳腺癌，接受辅助治疗的早期患者30％～40％可发展为转移性乳腺癌，患者5年生存率约20％。而手术、放疗和化疗等传统治疗方式，作用的特异性和专一性不佳，不可避免的会对正常细胞和组织产生杀伤性作用，给患者带来极大的副作用。因此，寻找高效特异性的靶向药物，将极大提高乳腺癌的治疗效果。

乳腺癌分子的靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的信号通路及其癌基因相关表达产物进行治疗。晚期糖化终产物受体(receptorforadvancedglycationendproducts，rage)是一种多配体受体，是免疫球蛋白超家族成员之一。rage最早是在研究糖尿病中发现，因其与糖尿病的主要致病因子晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，age)结合，从而对组织造成伤害，故命名为晚期糖化终产物受体(rage)。rage结构分为n端和c端，n端为细胞外段，用来识别不同的配体，包含1个v区和2个c区，v区主要部分用来与配体结合，而c区用来稳定受体与配体的结合；中间包括跨膜段；c端为细胞内段，主要参与信号传导通路。rage在哺乳动物组织中的分布非常广泛，如淋巴细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、神经元等。在正常生理状态下，rage除了在肺组织中高表达外，在各种生理组织中均呈低水平表达。在很多炎症或慢性疾病中，如糖尿病、类风湿性关节炎、创伤、阿尔海默茨病等病理环境下及生长发育期，细胞表面的rage表达及配体明显增强。rage还在许多类型的癌症中过度表达，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌以及黑色素瘤等，并且与肿瘤细胞的增殖、运动、侵袭转移能力及肿瘤临床分期、预后等密切相关。近年来研究表明，不同亚型的乳腺癌细胞系中下调rage表达对癌细胞的增殖具有深远的影响，特异性靶向rage的sirna可下调乳腺癌细胞的rage表达水平，能有效降低体内的乳腺癌增殖。但是sirna治疗有着较为明显的缺点，就是sirna进入人体内容易被机体降解，从而导致作用时间极大的降低。而多肽药物治疗，不仅靶向性更高，而且作用时间长，毒副作用小。以rage为治疗靶点是可以作为乳腺癌治疗的一种新策略。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新的rage拮抗多肽及其衍生物与应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种rage拮抗多肽，所述rage拮抗多肽包括氨基酸序列hpmsapr(seqno.:1)。

进一步地，所述rage拮抗多肽通过噬菌体展示随机肽库筛选得到。噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。

进一步地，所述rage拮抗多肽可以是获自于天然蛋白中的多肽片段，也可以利用公知的肽合成方法来获得。

进一步地，所述rage拮抗多肽与rage特异性结合。

本发明还提供一种rage拮抗多肽的衍生物，为上述rage拮抗多肽氨基酸侧链基团上、上述rage拮抗多肽片段的氨基端或羧基端经修饰得到的产物，或上述rage拮抗多肽连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得的产物。

进一步地，所述修饰包括氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰或固定化修饰；所述的标签为his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc或profinityexact。

进一步地，所述rage拮抗多肽的衍生物，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。

本发明还提供一种编码上述rage拮抗多肽的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有上述核苷酸序列。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述表达载体。

本发明还提供一种产生能够结合rage的蛋白质的方法，包括在宿主细胞中表达包含hpmsapr(seqno.:1)氨基酸序列的载体。

本发明还提供一种药物组合物，包括上述rage拮抗多肽或上述rage拮抗多肽的衍生物。

进一步地，所述药物组合物还包括能杀伤癌细胞的制剂；优选地，所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、纳米药物、生物药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物中的至少一种；优选地，所述制剂为化学药物或生物药物。

进一步地，所述药物组合物还包括药物学上可接受的载体；优选地，所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

本发明还提供一种上述rage拮抗多肽在制备靶向识别rage的组合物中的应用。

本发明还提供一种上述rage拮抗多肽或上述rage拮抗多肽的衍生物或上述药物组合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

进一步地，所述癌症为rage过表达癌症。

进一步地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、直肠癌、结肠癌和胰腺癌。

进一步地，所述癌症为三阴性乳腺癌。

进一步地，所述药物还包括药物学上可接受的载体。

进一步地，所述药物可制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂。

本发明还提供一种上述rage拮抗多肽的衍生物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种rage拮抗多肽，以rage为靶标筛选得到；与rage结合，从而阻断其介导的信号通路，抑制了癌细胞的增殖，可用于制备预防和/或治疗rage过表达的癌症，例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、直肠癌、结肠癌和胰腺癌等，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1示出了qpcr检测不同细胞中的rage表达水平；

图2示出了hplc检测rage拮抗多肽的纯度；

图3示出了ms质谱鉴定rage拮抗多肽的大小；

图4示出了共聚焦检测rage拮抗多肽与rage的特异性结合；

图5示出了mtt法检测rage拮抗多肽对于不同癌细胞增殖能力的影响；

图6示出了mtt法检测rage拮抗多肽在不同时间对mda-mb-231细胞增殖能力的影响；

图7示出了edu染色检测rage拮抗多肽对于mda-mb-231细胞增殖能力的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1qpcr检测不同癌细胞中rage蛋白表达水平

取正常乳腺细胞mcf-10a，雌激素阳性(er+)细胞mcf-7以及三阴性细胞mda-mb-231细胞。

rna提取：以6cm的培养皿为例，当细胞生长状态良好，细胞汇合度达到80-90％时，将细胞培养液弃掉，加入1×pbs清洗细胞去除残存的培养液。然后在6cm的培养皿中加入300-500μl的trizol(根据细胞密度多少决定trizol的加入量)，使用移液枪反复吹吸直到细胞破裂且裂解液中没有明显的沉淀。将其置于1.5ml的ep管中(注意使用无rna酶的枪头和ep管，且最好配戴口罩)；放置在冰上5min，然后按trizol与氯仿5:1的比例加入氯仿，剧烈震荡15s，氯仿可以有效地使有机相和无机相分离，使rna进入水相；冰上静置2-3min后4度离心机12000g，离心15min；将上层水相小心加入新的ep管中，加入同等体积的异丙醇沉淀rna，放置在冰上10min；离心机4℃，12000g，10min，离心去除上清，使用75％的无水乙醇清洗rna沉淀，用无rna酶的枪头吹吸，然后4度，7500g，离心5min，然后去掉上清，放置在安全柜中开口风干大概3-4min，最后根据沉淀的多少决定使用的depc水的量，混合均匀后，测定rna的浓度，进行琼脂糖凝胶电泳验证rna的质量。最后储存在-80℃的冰箱中储存备用。

cdna第一条链的合成：首先在ep管中将成分混合。总rna的模板使用量一般在1-5μg之间，将以上样品混匀，离心后，放置65℃的水浴锅中5min，然后迅速放置在冰上2min。加入引物混合后，混匀后放置在42℃的水浴锅中1小时，然后放置在70℃中保温15min，最终得到cdna可用于下一步的pcr实验。

将待测样品检测指标和其内参(gapdh)按反应体系进行加样，每个样品需要做三个复孔。操作时可以先将cdna、sybrgreen1mix、水三者进行混匀，且保证每个样品做三个复孔，两个检测的指标，所以在上述体系中，需要在原来剂量的基础上做出6份的量。同理，上下游引物按剂量要求混合均匀，最后将两种混合液每孔20μl的体系依次加入pcr八联管中，离心，上机。然后循环35-40，然后进行溶解曲线绘制。然后将测得的ct值计算待测目标的表达量。

rage的引物信息：

fw5’-tgctgtactttggaagcgaac-3’(seqidno.：2)

rv5’-ccgagggttgacatggaactg-3’(seqidno.：3)

gaphd引物信息：

fw5’-tgtgggcatcaatggatttgg-3’(seqidno.：4)

rv5’-acaccatgtattccgggtcaat-3’(seqidno.：5)

结果如图1所示，可以看出rage受体在正常乳腺细胞mcf-10a，雌激素阳性(er+)细胞mcf-7中低表达，而在三阴性细胞mda-mb-231细胞中高表达。

实施例2rage拮抗多肽的筛选、合成和鉴定

1、rage拮抗多肽的筛选

(1)建立永久高表达rage的293t细胞系：293t-rage^+/+/lrh

①选取生长旺盛的人源293t细胞，在转染前一天以5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；

②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μl的opti-mem培养基稀释3μgrage表达质粒，另以200μl的opti-mem培养基稀释6μl脂质体lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；

③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μl的opti-mem培养基；

④将待转染的细胞用pbs轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；

⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3ml完全培养基；

⑥48小时后选用含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达rage的293t细胞系。

⑦用trizol提取总rna，定量2μgrna进行逆转录(逆转录试剂盒，购于promega公司)，并用特异引物序列进行qpcr。

所用特异引物序列为：

fw5’-tgctgtactttggaagcgaac-3’(seqidno.:2)

rv5’-ccgagggttgacatggaactg-3’(seqidno.:3)

⑧与转染了psm2c-hu-scramblerna的做比较，检测rage的高表达水平，并命名为：293t-rage^+/+/lrh，即可以用于阳性噬菌体筛选。

(2)rage拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成。

①er2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μllb-tet液体培养基于1.5ml灭菌离心管中，再从e.colier2738的甘油冻存物中取0.2μl菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于lb-tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3mllb-tet液体培养基的10ml灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10ml灭菌离心管，无菌操作加入3mllb-tet液体培养基，取30μl过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(od600～0.5)。

②rage拮抗肽的淘选：将高表达rage细胞按10⁵个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60×15mm²培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达rage的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μl测滴度，剩下的将其加入到20mllb培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于-20℃保存。

③测定噬菌体的滴度：取4支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(agarosetop)，每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块lb/iptg/xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将od600～0.5的e.colier2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μl/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5ml离心管，分别盛有100μl、90μl、90μl、90μllb-tet培养基，将待测噬菌体吸取1μl入100μllb-tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μle.colier2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的lb/iptg/xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

④洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250ml的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至20mllb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50ml离心管中，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃10,000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的peg/nacl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃，12,000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1mltbs重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2ml离心管中，4℃10,000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的peg/nacl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12,000rpm离心20min，去掉上清；用200μltbs重悬沉淀，4℃10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括⑴按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至2mllb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10，000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。

⑤琼脂糖凝胶电泳鉴定m13噬菌体ssdna：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取dna电泳用琼脂糖1g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml1×tae缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1×tae缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用加样缓冲液(loadingbuffer)稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。

⑥ssdna测序及序列分析：将提取的m13噬菌体ssdna送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行dna测序。测序以后用bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为hpmsapr(seqno.:1)，最后rage拮抗多肽由上海强耀生物公司合成。

2、rage拮抗多肽的合成和鉴定

采用cs936多肽合成仪(美国csbio公司)，fmoc固相合成法合成(由上海强耀生物公司合成)，合成过程包括下述步骤：

(1)去保护：用哌啶(piperidine，上海紫一试剂厂)溶液去除氨基的保护基团；

(2)激活与交联：下一个氨基酸的羧基被激活剂hbtu(hctu/hitu)+nmm所激活溶解，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；

(3)循环：(1)、(2)两步反应反复循环直到整条肽链合成完毕；

(4)洗脱和脱保护：根据肽链所含的残基不同，用不同的脱树脂溶剂从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂(tfa)洗脱和脱保护；

(5)合成好的短肽经过varianprostar210纯化柱(美国varian公司)纯化，纯化的过程中采用uv-vis-detector:varianprostar345(美国varian公司)检测；

(6)采用systemgoldhplc(美国贝克曼公司)验证纯度达到98％以上；

(7)采用thermofinniganlcqdecaxpplus(美国thermo公司)检测合成短肽的分子量。

图2为hplc检测合成的rage拮抗多肽的纯度，结果表明，合成的rage拮抗多肽的纯度高达98.03％。

图3为ms质谱鉴定rage拮抗多肽的大小，结果表明，合成的rage拮抗多肽的大小为794.94da。

实施例3

rage拮抗多肽与rage的特异性结合

对rage拮抗多肽进行fitc标记(上海强耀生物公司)，共聚焦板接种mda-mb-231细胞，然后pbs洗三次，多聚甲醛固定15min，再用pbs洗3次，bsa封闭1.5h，孵育rage抗体过夜后，使用alexa594连接的抗兔荧光二抗室温孵育1小时，然后用终浓度为100μmol/ml的fitc标记的rage拮抗多肽室温孵育2h，pbst洗三次，dapi核染，激光共聚焦扫描显微镜(德国蔡斯公司)观察，结果见图4。

其中，图4a为dapi核染的荧光共聚焦显微镜图片(原荧光彩图中显示为蓝色)；

图4b为rage抗体孵育mda-mb-231细胞后，使用alexa594连接的抗兔荧光二抗显色的共聚焦显微镜图片(原荧光彩图中显示为红色)；

图4c为经fitc标记的rage拮抗多肽标记的荧光共聚焦显微镜图片(原荧光彩图中显示为绿色)；

图4d为图4a、4b和4c的合并图像(原荧光彩图中显示为紫色)。

可见fitc标记的rage拮抗多肽与特异性结合rage的抗体共定位，这表明rage拮抗多肽能够特异性结合rage。

实施例4

rage拮抗多肽对不同乳腺细胞增殖能力的影响

①将正常乳腺细胞mcf-10a，雌激素阳性(er+)细胞mcf-7以及三阴性细胞mda-mb-231细胞分别以5ⅹ10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(100μm，10μm，1μm，0.1μm，0.01μm，0.001μm)的rage拮抗多肽培养48小时；

③每孔加入20μl的mtt工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μldmso(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

图5为mtt法检测rage拮抗多肽对不同乳腺细胞增殖能力的影响，可以看出，rage拮抗多肽可以显著抑制rage高表达细胞mda-mb-231细胞的增殖，而对低表达rage受体的细胞mcf-10a和mcf-7的增殖有没有明显抑制作用。

实施例5

rage拮抗多肽在不同时间对乳腺癌细胞增殖能力的影响

①将三阴性细胞mda-mb-231细胞以5ⅹ10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(100μm，10μm，1μm，0.1μm，0.01μm，0.001μm)的rage拮抗多肽分别培养24、48、72小时；

③每孔加入20μl的mtt工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μldmso(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

图6为mtt法检测rage拮抗多肽在不同时间对乳腺癌细胞增殖能力的影响，可以看出，rage拮抗多肽在24，48，72小时的时候都可以显著抑制细胞增殖，尤其在48小时的时候，抑制效果最为明显。

实施例6

edu染色法检测rage拮抗多肽对mda-mb-231细胞增殖的影响

(1)细胞培养：取对数生长期细胞，以每孔4×10³～1×10⁵细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段；

(2)药物处理：加入10μm短肽作用48小时；

(3)edu标记：

1)用细胞培养基按1000：1的比例稀释edu溶液(试剂a)，制备适量50μmedu培养基；

2)每孔加入100μl50μmedu培养基孵育2小时，弃培养基；

3)pbs清洗细胞1～2次，每次5分钟。

(4)细胞固定化

1)每孔加入50μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟，弃固定液；

2)每孔加入50μl2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

3)每孔加入100μlpbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs；

4)(加强)每孔加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床孵育10分钟；pbs清洗1次，5分钟。

(5)apollo染色

1)每孔加入100μl的1x染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

2)加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；

3)(加强)每孔每次加入100μl甲醇清洗1～2次，每次5分钟；pbs清洗1次，每次5分钟。

(6)dna染色

1)用去离子水按100：1的比例稀释试剂f，制备适量1xhoechst33342反应液，避光保存；

2)每孔加入100μl1xhoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

3)每孔每次加入100μlpbs清洗1～3次；

4)每孔加入100μlpbs保存待用。

图7a为edu染色荧光试验：从左到右为：dapi核染(原荧光彩图中显示为蓝色)；edu标记dna(原荧光彩图中显示为绿色)；前面dapi核染和edu染色的合并图(原荧光彩图中显示为紫色)

图7b为edu染色统计图

图7可以看出短肽在浓度为10μm，作用时间为48小时的时候，可以显著抑制细胞dna的合成，从而抑制细胞的增殖。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

sequencelisting

<110>清华大学深圳研究生院

<120>一种rage拮抗多肽及其应用

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