一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒及应用方法与流程

本发明涉及一种针对弓形虫核酸的恒温扩增快速检测方法，适合对弓形虫核酸的定性检测。

(二)

背景技术：

先天性弓形虫病是一种在人类优生优育中受到极大关注的寄生虫病，其病原体刚地弓形虫(toxoplasmagondii，tox)经母体胎盘传播，从而感染胎儿。在母体早孕期间可导致流产、早产、死产、畸形和无脑儿、脑积水、小头畸形等；在妊娠中、晚期，婴儿多呈隐性感染，出生后可出现精神运动障碍、脑钙化灶、视网膜脉络膜炎等先天性弓形虫病症候群。2005年，全国第2次寄生虫调查显示，孕妇感染率为6.25％-32.9％。我国每年约有5.5-9万名新生儿受弓形虫侵害，对母婴健康造成极大的危害，严重影响出生人口素质，给优生优育工作带来极大障碍。

目前，tox已被列为全球感染性致畸torch综合征的重要病因。妊娠期tox感染产前诊断直接关系到胎儿的处置，能在孕前和孕早期发现宫内感染是预防先天性弓形虫病发生的重要措施。如在孕前或孕早期检测，及时采取相应措施，可减少63％的先天性弓形虫感染。虽然tox抗体检测是我国优生优育5项检测中的项目之一，但目前病原学、免疫学、分子生物学等实验室检测方法对弓形虫病的早期诊断仍存在许多不足，不能满足优生优育中准确、快速、简便的检测需求。因此，建立一种核酸快速检测方法对弓形虫病的防治至关重要，使临床医师能及早、准确地诊断孕前与孕期的tox感染，对于指导临床用药、防止宫内感染、控制畸形胎儿出生，实现人群的优生优育具有十分重要意义。

交叉引物恒温扩增技术(crossingprimingamplification，cpa)是一项全新的恒温扩增检测技术。该技术与lamp、rca、tma、nasba等恒温扩增技术的引物设计原理不尽相同，不论是在反应系统还是产物判定上都有很大改进和创新，反应更加迅速、检测灵敏度更高。基于此，本研究拟采用交叉引物恒温扩增技术，开发一种快速、简便的弓形虫核酸检测方法，为孕前及孕期育龄妇女tox感染的早期、快速、准确诊断提供技术支持。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测弓形虫核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)dna提取试剂；

(2)pcr恒温扩增反应液；所述pcr恒温扩增反应液包括引物和探针；所述引物为外围引物和扩增交叉引物；所述探针为正向5′端biotin标记探针和反向5′端fam标记探针；

所述外围引物为正向外围引物和反向外围引物，其核苷酸序列如下：

正向外围引物为(f3)：5′-cgacatcgcattcaaggga-3′；

反向外围引物为(b3)：5′-gtggcttttctggaggtaca-3′；

所述探针的核苷酸序列为：

正向5′端biotin标记探针(lf)：

5′-biotin-tctcttgtctcgaatacacgaac-3′；

反向5′端fam标记探针(lb)：

5′-fam-tgccagaagaagggtacgt-3′；

所述扩增交叉引物为扩增正向引物和扩增反向引物，其核苷酸序列分别为：

扩增正向引物(fip)：

5′-cttcagccgtcttgtggggg-agagatccagcagatctcgt-3′；

扩增反向引物(bip)：

5′-ttgtgctgcctcctctcatgg-cagcgggaaatacagctctt-3′；

(3)阳性对照：含有弓形虫b1基因的dna质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长度为210bp的弓形虫b1基因序列的片段，所述弓形虫b1基因的核苷酸序列如下(seqidno.1)：

acgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagagatccgcccccacaagacggctgaagaatgcaacattcttgtgctgcctcctctcatggcaaatgctagaagaagggtacgtgttgcatcataacaagagctgtatttcccgctggcaaatacaggtgaaatgtacctccagaaaagccac。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的弓形虫b1基因为模板，通过两条外围引物进行pcr扩增获得目的基因；利用pcr纯化试剂盒对pcr扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过t-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。

进一步，本发明所述pcr恒温扩增反应液包括：dna、引物、探针、10×buffer(neb公司)，mgso4，dntps溶液，bstdna聚合酶(neb公司)和无菌双蒸水。

进一步，本发明所述pcr恒温扩增反应液组成为：引物2μl、bstdna聚合酶1μl、10×buffer2μl、dntp终浓度为1.4μmol/l、mgso4终浓度为10μmol/l、dna2-3μl，加水至终体积为25μl；所述引物混合物为3对引物(浓度稀释为20μmol/l)按照fip：bip：lf：lb：f3：b3＝4：4：2：2：1：1的体积比混合而成。

本发明还提供一种所述弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒的应用方法，所述应用方法为：

a)用dna提取试剂从待检测的标本中提取dna；

b)将步骤a)提取得到的dna作为模板加入到装有恒温扩增反应液的pcr管中，在65℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板(即阳性对照)加入阳性对照pcr管中，标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照pcr管中，所述标准阳性模板为含有弓形虫b1基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的pcr管放置到核酸试纸条防污染检测装置(购自杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有弓形虫核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗fam抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗fam抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。

在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠bstdna聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换dna合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的弓形虫核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了弓形虫核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可达到10⁴copies/ml，可以满足快速检测弓形虫核酸的要求，作为弓形虫病确诊的一个辅助方法，具体弓形虫病的确诊还需要结合临床诊断。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明所述弓形虫的核酸恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；灵敏度可达到10⁴copies/ml；

(2)反应速度快，恒温扩增仅需35min，核酸试纸条检测结果需1～2min，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；

(3)整个扩增和检测过程中不需要打开pcr管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。

(四)附图说明

图1为核酸检测试纸条原理示意图。

图2为特异性实验结果，图中1-7分别表示恶性疟，间日疟，卵形疟classical亚型，卵形疟wallikeri亚型，三日疟，巴贝虫，利士曼原虫。

图3为敏感性实验，图中1-6分别表示4.5×10⁷、4.5×10⁶、4.5×10⁵、4.5×10⁴、4.5×10³和4.5×10²copies/ml的实验结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1本发明弓形虫核酸恒温扩增试剂盒的组成与配制

(1)dna提取试剂，qiagen的dna提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：引物2μl、bstdna聚合酶1μl、10×buffer2μl、dntp终浓度为1.4μmol/l、mgso4终浓度为10μmol/l、dna2-3μl，加水至终体积为25μl；所述引物混合物为3对引物(浓度稀释为20μmol/l)按照fip：bip：lf：lb：f3：b3＝4：4：2：2：1：1的体积比混合而成；

所述外围引物为正向外围引物和反向外围引物，其核苷酸序列如下：

正向外围引物为(f3)：5′-cgacatcgcattcaaggga-3′；

反向外围引物为(b3)：5′-gtggcttttctggaggtaca-3′；

所述两条探针的核苷酸序列分别为：

正向5′端biotin标记探针(lf)：

5′-biotin-tctcttgtctcgaatacacgaac-3′；

反向5′端fam标记探针(lb)：

5′-fam-tgccagaagaagggtacgt-3′；

所述两条扩增交叉引物为扩增正向引物和扩增反向引物，其核苷酸序列分别为：

扩增正向引物(fip)：

5′-cttcagccgtcttgtggggg-agagatccagcagatctcgt-3′；

扩增反向引物(bip)：

5′-ttgtgctgcctcctctcatgg-cagcgggaaatacagctctt-3′；

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

(3)阳性对照：含有长约210bp的弓形虫b1基因序列，弓形虫b1基因序列如seqidno.1所示：

acgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagagatccgcccccacaagacggctgaagaatgcaacattcttgtgctgcctcctctcatggcaaatgctagaagaagggtacgtgttgcatcataacaagagctgtatttcccgctggcaaatacaggtgaaatgtacctccagaaaagccac；

阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的弓形虫b1基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行pcr扩增获得目的基因；利用pcr纯化试剂盒对pcr扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过t-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测a280定量并稀释至1个拷贝/μl，-20℃保存。

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2用本发明试剂盒检测弓形虫核酸的具体方法

a)用dna提取试剂从待检测的标本中提取dna；

b)取步骤a)获得的dna作为模板，加入到装恒温扩增反应液的pcr管中，其中模板dna3μl，反应液总体积25μl，60℃扩增反应35分钟；阳性和阴性对照pcr管中分别加入阳性模板和阴性模板。

c)将反应后的pcr管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有弓形虫核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。所述核酸试纸条防污染检测装置包括：在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线(c)和质控线(t)，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗fam抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗fam抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。

实施例3用本发明试剂盒检弓形虫的特异性

按照实施例2的方法检测恶性疟，间日疟，卵形疟classical亚型，卵形疟wallikeri亚型，三日疟，巴贝虫，利士曼原虫等原虫的核酸样本，检测均为阴性，如图2所示，提示用本发明试剂盒检测弓形虫核酸具有很强的特异性。

实施例4用本发明试剂盒检测弓形虫核酸的灵敏度

对含有弓形虫b1基因片段的质粒dna进行定量，分别稀释至浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²copies/ml，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测弓形虫核酸的灵敏度，结果如图3所示，图中1-6分别表示10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²copies/ml的实验结果，可以发现该试剂盒检测灵敏度可达10⁴copies/ml，可以满足快速检测弓形虫的要求。

序列表

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒及应用方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>212

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

acgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagag60

agatccgcccccacaagacggctgaagaatgcaacattcttgtgctgcctcctctcatgg120

caaatgctagaagaagggtacgtgttgcatcataacaagagctgtatttcccgctggcaa180

atacaggtgaaatgtacctccagaaaagccac212

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

cgacatcgcattcaaggga19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>3

gtggcttttctggaggtaca20

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>4

tctcttgtctcgaatacacgaac23

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>5

tgccagaagaagggtacgt19

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>6

cttcagccgtcttgtgggggagagatccagcagatctcgt40

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>7

ttgtgctgcctcctctcatggcagcgggaaatacagctctt41