基于BODIPY的Cu2+荧光探针及其制法和用途的制作方法

本发明涉及含有功能基团的bodipy类荧光探针及其在生物细胞内铜离子的检测中的应用。

背景技术：

铜元素存在于自然界和人体中，对于人体器官的正常运作和新陈代谢至关重要。铜是人体中酶的重要组成部分，人体中铜离子含量的过多或过少都会带来疾病，甚至死亡。因此，准确及时地检测人体内铜离子的含量非常有意义。[参见：burdojr,connorjr.biometals,2003,16:63-75]目前检测铜离子的方法有很多，例如原子吸收、耦合等离子质谱法、电化学法、荧光分析法。[参见：(a)soylakm,unsalye.foodchemtoxicol,2010,48:1511-1515.(b)aydinfa,soylakm.jhazardmater,2010,173:669-674.(c)shervedanipk,hatefi-mehrjardia,asadi-farsania.analchimacta,2007,601:164-171.(d)liuhz,johnm,shenz,etal.chem.comm.,2011,47:12092-12094.]荧光分析法作为一种新型发展起来的检测方法，具有操作简单方便、检测速度快、无破坏性等优点，已经成为一种十分实用的检测方法。[参见：quxy,licj,chenhc,etal.chem.commun.,2013,49:7510-7512.]荧光分析法中一个急需解决的问题为，合成灵敏度高、选择性好、溶解性好的荧光探针。硼氟二吡咯亚甲基(bodipy)类荧光染料具有许多优良的光物理性质，例如，摩尔吸光系数高，荧光量子产率高，结构易修饰等，被广泛的应用到设计合成cu²⁺荧光探针。

2006年首次报道一种bodipy类荧光增强型的cu²⁺荧光探针，利用乙酰基的水解达到检测cu²⁺的目的。[参见：qi,x.；jun,e.j.；xu,l.；kim,s.j.；hong,j.s.j.；yoon,y.j.；yoon,j.y.j.org.chem.2006,71,2881.]随后，文献相继报道了两种能够检测cu²⁺的bodipy类荧光探针，通过在bodipy母核的中位引入n-(2-苯酚基)苯胺基团和n,n-二(2-吡啶甲基)苯胺基团，利用光诱导电子转移(pet)机理达到荧光强度改变的目的来检测离子。[参见：(a)wang,d.p.；shiraishi,y.；hirai,t.chem.commun.2011,47,2673.(b)l.zhou,c-c.zhu,y-s.xue,w-j.he,h-b.du,x-z.you,y-z.li,inorg.chem.commun,2013,35,355]

本发明选用荧光量子产率高的bodipy类化合物作为荧光基团，选用4-(吡啶-2-甲酸)苯酚酯基和对羟基苯基作为功能基团，合理的将功能基团修饰到bodiipy母核的中位，得到荧光探针q1-q3。

技术实现要素：

本发明内容是设计并提供了一系列含有功能基团4-(吡啶-2-甲酸)苯酚酯基或对羟基苯基的硼氟二吡咯亚甲基(bodipy)类的荧光探针及其制备方法和用途。

本发明的技术方案如下：

一类bodipy类荧光探针，它有如下结构：取代基r对应化合物如下

一种制备上述的基于硼氟二吡咯亚甲基(bodipy)化合物q1-q3的方法，它可以按如下反应制备，

它包括下列步骤：

1、bodipy类化合物q1的制备：

250ml的圆底烧瓶中，加入(0.4540g，2mmol)相对应的醛，(0.3800g，4mmol)2,4-二甲基吡咯，0.01ml的三氟乙酸和100ml无水二氯甲烷，室温搅拌过夜，然后加入(0.4500g，2mmol)2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，氧化反应1h，依次加入3ml的三乙胺和3ml的三氟化硼乙醚溶液，反应5h，加水淬灭反应，待反应结束后，用二氯甲烷萃取，减压旋干，柱层析，用二氯甲烷比石油醚为1:2的展开剂过柱，得到相应的q1产物。

化合物q1的核磁数据如下，¹hnmr(cdcl3,600mhz):8.87(d,1h,j＝6hz),8.31(d,1h,j＝12hz),7.96(t,1h,j＝12hz),7.59(t,1h,j＝6hz),7.44(d,2h,j＝6hz),7.42(d,2h,j＝6hz),6.00(s,2h),2.57(s,6h),1.46(s,6h).

2、bodipy化合物q2和q3的制备：

在100ml的两颈烧瓶中，加入(0.0710g，0.16mmol)的bodipy化合物q1，(0.0430g，0.32mmol)对甲氧基苯甲醛，0.4ml无水哌啶，0.4ml冰醋酸和50ml无水乙腈，氩气保护下，使用分水器，加热到90℃，反应过程用tlc监测，至q1原料点全部消失。反应结束后，冷却至室温，减压旋干，柱层析，用二氯甲烷比石油醚为1:2的展开剂过柱，得到相应的产物q2和q3。

化合物q2的核磁数据如下，¹hnmr(cdcl3,600mhz):7.55(m,4h),7.21(d,1h,j＝18hz),7.16(d,2h,j＝12hz),6.96(t,2h,j＝6hz),6.91(d,1h,j＝12hz),6.59(s,1h),5.99(s,1h),3.84(s,3h),2.59(s,3h),1.49(s,3h),1.45(s,3h).

化合物q3的核磁数据如下，¹hnmr(cdcl3,600mhz):7.65(d,2h,j＝18hz),7.61(d,4h,j＝6hz),7.24(d,2h,j＝12hz),7.21(d,2h,j＝12hz),6.99(d,2h,j＝6hz),6.96(d,2h,j＝12hz),6.63(s,2h),3.88(s,6h),1.53(s,6h).

检测所用仪器为：brukerarx600mhz型核磁共振仪(tms为内标，氘代cdcl3为溶剂)，瑞利tu-1901紫外－可见分光光度计(扫描范围350～700nm，光路狭缝1nm)，caryeclips型荧光光谱仪。

本发明的有益效果

本发明与现有技术相比，其显著优点是：首次选用4-(吡啶-2-甲酸)苯酚酯基作为功能基团，连接到bodipy母核的中位，达到检测生物体系中铜离子的目的。化合物q1-q3的吸收峰和荧光峰均位于可见光区，具有优良的光物理性质，化合物q1能够高效高选择性的识别cu²⁺。探针q1为中位吡啶-2-甲酸苯酚酯基团bodipy类探针，具有许多有利的性质，例如大的可见吸收光谱、高的荧光量子产率、对cu²⁺离子选择性高、生物毒性弱、能高效的检测生物细胞中的cu²⁺离子。本研究对设计合成高效、高选择性的荧光探针具有重要的意义。

附图说明

图1探针q1的晶体结构；

图2探针q1在dmso水溶液中随cu²⁺浓度不同得到的吸收光谱图

图3探针q1在dmso水溶液中加入常见金属离子得到的吸收光谱图。

图4探针q1在raw细胞中共聚焦荧光成像图片、明场下图片及交叠图片。(a)为温度为37℃下探针q1在细胞中孵育30min的图片；(d)为温度为37℃下，细胞中补加100μm的cu²⁺孵育1h的图片；(b)和(e)分别是细胞在明场下的图片；(c)和(f)分别为细胞在交叠下的图片。

具体实施方式

实施例1.化合物q1的合成：

250ml的圆底烧瓶中，加入(2mmol)相对应的醛，(4mmol)2,4-二甲基吡咯，0.01ml的三氟乙酸和100ml无水二氯甲烷，室温搅拌过夜。然后加入(2mmol)2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，氧化反应1h，依次加入3ml的三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，反应5h，加水淬灭反应。待反应结束后，用二氯甲烷萃取，减压旋干，柱层析，用二氯甲烷比石油醚为1:2的展开剂过柱，得到相应的bodipy产物。化合物q1的单晶谱图见图1。

实施例2.化合物q2，q3的合成：

100ml的两颈烧瓶中，加入(0.16mmol)的简单bodipy化合物，(0.32mmol)对应的醛，0.4ml无水哌啶，0.4ml冰醋酸和50ml无水乙腈，氩气保护下，使用分水器，加热到90℃，反应过程用tlc监测，至原料点全部消失。反应结束后，冷却至室温，反应后有大量的固体析出，直接抽滤，得到固体为产品。滤液分别用水，饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，减压得到粗产物，柱层析，用二氯甲烷比石油醚为1:2的展开剂过柱，得到相应的产物。

实施例3.探针q1作为金属离子的探针

探针q1可以选择性的识别cu²⁺，探针q1溶解到dmso和水的混合溶液中(v/v，4:1)，浓度为10μm，逐渐滴加不同浓度的cu²⁺到该溶液中，然后得到相应荧光发射光谱，发现随着cu²⁺浓度的增加，探针的荧光光谱发生规律的变化(图2)。在相同条件下，另取一份溶液分别加入常见的金属离子(al³⁺、ca²⁺、cd²⁺、hg²⁺、k⁺、mg²⁺、na⁺、fe³⁺、ni²⁺、zn²⁺、co²⁺)，结果表明探针的荧光光谱基本没有变化(图3)。

实施例4.探针q1在生物成像中应用。

探针q1可以成功应用到细胞成像并检测细胞中cu²⁺的存在。温度控制在37℃下，探针q1在raw细胞中孵育30min，用460nm的光激发，可以看到细胞有绿色荧光(a)；补加100μm的cu²⁺到细胞中，孵育1小时，用460nm的光激发，没有看到荧光(d)。同时从明场[(b)和(e)]和交叠场[(c)和(f)]可以进一步证明探针q1可以检测细胞中的铜离子(图4)。