一种深红/近红外多功能聚集诱导发光材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及多功能有机小分子合成技术领域，尤其涉及一种深红/近红外多功能聚集诱导发光材料及其制备方法和应用。

背景技术：

荧光成像技术以其灵敏度高、响应快速、时空分辨率高、操作简单以及非侵入性等诸多优势，已经成为疾病研究、医疗实践和临床实验中一个不可或缺的工具。更重要的是，荧光成像技术能够作为可视化的工具，对研究目标进行无损原位实时跟踪，对于细菌等病原菌的及时、快速检出和鉴别具有天然优势。

开发不受细菌耐药性影响的，简单、快速的新型抗菌体系对于克服细菌耐药性、提高抗菌效果具有重要意义。光动力治疗(photodynamictherapy,pdt)近年来受到国内外研究者越来越多的关注。与具有特定作用靶点的抗生素相比，光敏剂产生的活性氧在细菌外部和内部均可对细菌产生毒性作用，不需要光敏剂必须透过细菌细胞膜，进入细菌内部，因此具有与传统抗生素不同的杀菌机制。同时，光动力抗菌是基于光、光敏剂和氧气三种因素协同作用的氧化损伤机制，所以不会因为单一用药、光敏剂的浓度、曝光时间不足等因素产生耐药问题。

基于荧光成像技术和光动力抗菌原理，开发兼具革兰氏阳性细菌检测与光动力抗菌功能的“oneforall”多功能体系，事实上，作为光动力灭菌的核心，多数光敏剂都具有荧光发射性质，具有用于荧光成像介导的灭菌的能力，然而这些光敏剂大多是疏水性的，在生理环境下与细菌接触后容易形成聚集体，受聚集诱导淬灭(acq)效应的影响，容易出现荧光强度减弱和活性氧产生效率减弱的问题，导致光动力灭菌效果较低。

目前聚集诱导发光材料在细菌领域已经有一些应用，兼具革兰氏阳性细菌选择性成像和光动力杀伤能力于一体的聚集诱导发光材料目前寥寥无几。近红外发光的荧光分子在生物应用中具有诸多优势，如穿透力强、对生物体的光损伤较小，可以避免生物体自发荧光对信号收集的干扰，且能够大大减小光散射。但目前兼具革兰氏阳性细菌选择性成像和光动力抗菌能力于一体的诊疗一体化深红/近红外聚集诱导发光材料未见报道；其他深红/近红外聚集诱导发光分子的报道也较少，已报道的为数不多的实例中，它们的合成途径十分复杂，通常需要数步反应和繁琐的分离纯化步骤。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有深红/近红外发射的聚集诱导发光材料及其制备方法和在革兰氏阳性细菌成像和光动力灭菌中的应用，旨在解决现有的近红外发射聚集诱导发光材料合成途径复杂的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

第一方面，一种深红/近红外多功能聚集诱导发光材料，选自分子结构式(i)-(iv)中的任一种：

其中，r¹、r²各自独立地选自h、中的一种；

x^-独立地选自i^-、pf6^-、bf4^-、sbf6^-、sbf5^-、ch3coo^-、cf3coo^-、co3^2-、so4^2-、so3^2-、cf3so2^-、tso^-、clo4^-、f^-、cl^-、br^-、(f3cso2)n^-、po4^3-中的一种。

一种上述所述的分子结构式为(i)的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述方法包括步骤：

步骤11、将4-(二苯基氨基)苯甲醛与1,4-二甲基吡啶-1-碘化物加入到反应容器中，在氮气保护下，加入无水乙醇，并加入哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，得到橙色固体粉末；

步骤12、将所述橙色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到橙色固体tpy，所述tpy的分子结构式为

优选地，所述的聚集诱导发光材料的制备方法，所述第一反应条件为温度70-85℃。

一种上述所述的分子结构式为(ii)的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述方法包括步骤：

步骤21、将4-溴三苯胺，4-甲酰基苯硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾加入到反应容器中，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第一中间产物；

步骤22、将所述第一中间产物与1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，得到第一红色固体粉末；

步骤23、将所述第一红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第一红色固体tppy，所述tppy的分子结构式为

优选地，所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述第二反应条件为在温度60-80℃条件下回流反应15-18小时。

一种上述所述的分子结构式为(iii)的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述方法包括步骤：

步骤31、将4-溴三苯胺，5-醛基-2-噻吩硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾相混合，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第二中间产物；

步骤32、将第二中间产物和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，将反应液倒入无水乙醚中，得到第二红色固体粉末；

步骤33、将所述第二红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第二红色固体ttpy，所述ttpy的分子结构式为

一种上述所述的分子结构式为(iv)的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述方法包括步骤：

步骤41、将4-溴-4',4'-二甲氧基三苯胺，5-醛基-2-噻吩硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾相混合，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第三中间产物；

步骤42、将第三中间产物和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，将反应液倒入无水乙醚中，得到第三红色固体粉末；

步骤43、将所述第三红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第三红色固体meottpy，所述meottpy的分子结构式为

优选地，所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，所述甲苯和甲醇混合溶剂中甲苯和甲醇的体积比为1:1。

一种上述所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的应用，用于革兰氏阳性细菌特异性标记和/或用于革兰氏阳性细菌动力杀伤。

优选地，所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的应用，所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。

有益效果：本发明所提供的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料，合成方法简单，不需要复杂的合成步骤。同时具有较长的吸收和发射波长，发射波长可达到近红外光区。针对革兰氏阳性细菌具有非常高的选择性，且具有良好的生物兼容性。具有高效的活性氧(ros)产生效率，能够有效杀死革兰氏阳性菌。

附图说明

图1a为tpy、tppy、ttpy、meottpy在dmso溶液中的归一化的紫外吸收光谱。

图1b为随着甲苯(toluene)含量增加meottpy(10μm)在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光发射谱图，λex＝500nm。

图1c为随着甲苯(toluene)含量增加tpy、tppy、ttpy、meottpy(10μm)在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光增强倍数，λex＝500nm。

图1d为tpy、tppy、ttpy、meottpy在固态时归一化的荧光发射光谱。

图2为tpy、tppy、ttpy、meottpy(2μm)分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共同孵育20分钟后的clsm图。

图3为tpy、tppy、ttpy、meottpy(2μm)分别与铜绿假单胞菌和粪肠球菌共同孵育20分钟后的clsm图。

图4a为随着白光(22.1mwcm^-2)照射时间延长，tpy、tppy、ttpy、meottpy(50nm)与ros指示剂dcfh(10μm)混合液的荧光强度增强倍数。

图4b为随着白光(22.1mwcm^-2)照射时间延长，ttpy(1μm)与ros指示剂dcfh(5μm)混合液的荧光强度增强倍数。

图5a、5b分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理下的琼脂培养板菌落照片图和对应菌落数统计图。

图5c为金黄色葡萄球菌在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理下的扫描电镜图。

图6a第一行和第二行分别为金黄色葡萄球菌感染的大鼠伤口在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理后，第一天和第四天的伤口照片；第三行和第四行分别为第四天伤口组织切片的he染色图和局部放大图。

图6b、6c分别为将6a图照片中所对应伤口组织均匀混悬液涂布于琼脂板14h～16h后的琼脂板菌落照片图和对应菌落数的统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中所提供的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料，分子结构式如下述中的一种：

具体来说，其中，r¹、r²各自独立地选自h、x^-独立地选自i^-、pf6^-、bf4^-、sbf6^-、sbf5^-、ch3coo^-、cf3coo^-、co3^2-、so4^2-、so3^2-、cf3so2^-、tso^-、clo4^-、f^-、cl^-、br^-、(f3cso2)n^-、po4^3-。

本发明所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料，其分子结构中的吡啶环携带一定正电荷，细菌表面具有负电性，由于正负电荷间的静电相互作用，正电性的聚集诱导发光分子易于在细菌表面聚集，为革兰氏阳性细菌的选择性成像提供了前提条件；由于细菌的细胞膜是由磷脂双分子层构成的，合适的脂水分配系数(3<clogp<5)使得聚集诱导发光分子能够细菌的细胞膜，限制聚集诱导发光分子的运动，从而发出荧光；由于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌被膜结构存在差异，本发明所述聚集诱导发光分子在与细菌共培养时，更容易嵌插入革兰氏阳性细菌的细胞膜，实现革兰氏阳性细菌的特异性“点亮”成像。

基于相同的发明构思，本发明还提供了上述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，包括如下制备步骤：

步骤11、将4-(二苯基氨基)苯甲醛与1,4-二甲基吡啶-1-碘化物加入到反应容器中，在氮气保护下，加入无水乙醇，并加入哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，得到橙色固体粉末；所述第一反应条件为温度70-85℃

步骤12、将所述橙色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到橙色固体tpy。

合成路线如下：

具体来说，称取4-(二苯基氨基)苯甲醛(54.6mg，0.20mmol)和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物(56.4mg，0.24mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，加入15ml无水乙醇作为反应溶剂，并滴加几滴哌啶做催化剂，于78℃条件下回流反应过夜。待反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入无水乙醚中，经沉淀过滤后得到橙色固体粉末。

将上述固体粉末重新溶解在丙酮中并与饱和的kpf6(六氟磷酸钾)水溶液(3ml)混合均匀。室温搅拌1小时后，使用氮气吹扫使丙酮蒸发。经过滤，水洗涤并减压干燥得到橙色固体。以dcm/ch3oh(v/v,99/1)作为洗脱溶剂，通过100-200目中性氧化铝柱纯化分离，得到橙色粉末化合物tpy(87.0mg)，产率为86.0％。产物核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.78(d,j＝6.6hz,2h),8.13(d,j＝6.6hz,2h),7.94(d,j＝16.2hz,1h),7.64-7.59(m,2h),7.38(t,j＝7.8hz,4h),7.29(d,j＝16.3hz,1h),7.17(d,j＝7.3hz,2h),7.14-7.09(m,4h),6.95(d,j＝8.6hz,2h),4.21(s,3h)。¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:152.85,149.49,146.24,144.83,140.54,129.89,129.70,128.02,125.44,124.54,122.95,120.75,120.51,46.70。esihrms:c26h23n2[m-pf6]⁺的计算值为363.1856,实际测量值为363.1822。

如图1a所示tpy在dmso溶液中的归一化的紫外吸收光谱。如图1c所示随着甲苯(toluene)含量增加tpy在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光增强倍数，λex＝500nm。图1d为tpy在固态时归一化的荧光发射光谱。

在另一实施例中，上述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，包括如下制备步骤：

步骤21、将4-溴三苯胺，4-甲酰基苯硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾加入到反应容器中，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第一中间产物；所述第二反应条件为在温度60-80℃条件下回流反应15-18小时。

步骤22、将所述第一中间产物与1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，得到第一红色固体粉末；

步骤23、将所述第一红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第一红色固体tppy。

合成路线如下：

具体来说，(1)化合物1的合成

称取4-溴三苯胺(50.0mg，0.15mmol)，4-甲酰基苯硼酸(30.0mg，0.20mmol)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(11.3mg，0.02mmol)和碳酸钾(106.6mg，0.77mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，以1：1体积比加入20ml甲苯和甲醇混合溶剂作为反应溶剂，于75℃条件下回流反应16小时。反应结束后，减压旋蒸除去反应溶剂，加入100ml二氯甲烷作为有机相，经水、饱和氯化钠依次洗涤后，有机相经无水硫酸钠过夜干燥，减压旋干后得到粗产物。通过200-300目硅胶柱纯化分离，得到亮黄色固体化合物1(48.8mg)，产率为93.2％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:10.01(s,1h),7.93(d,j＝8.4hz,2h),7.73(d,j＝8.4hz),7.52(d,j＝8.4hz,2h),7.28(t,j＝8.0hz,4h),7.15(m,6h),7.07(t,j＝7.2hz,2h)。esihrms:c25h19no[m]⁺的计算值为349.1466,实际测量值为349.1464。

(2)化合物tppy的合成

称取化合物1(50.0mg，0.14mmol)和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物(40.0mg，0.17mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，加入15ml无水乙醇作为反应溶剂，并滴加几滴哌啶做催化剂，于78℃条件下回流反应过夜。待反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入无水乙醚中，经沉淀过滤后得到红色固体粉末。将上述固体粉末重新溶解在丙酮中并与饱和的kpf6水溶液(2.1ml)混合均匀。室温搅拌1小时后，使用氮气吹扫使丙酮蒸发。经过滤，水洗涤并减压干燥得到红色固体。通过100-200目中性氧化铝柱纯化分离，得到红色粉末化合物tppy(63.9mg)，产率为78.1％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.85(d,j＝6.4hz,2h),8.21(d,j＝6.4hz,2h),8.03(d,j＝16.3hz,1h),7.85-7.76(m,4h),7.72-7.67(m,2h),7.54(d,j＝16.3hz,1h),7.36-7.30(m,4h),7.11-7.03(m,8h),4.25(s,3h)。¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:147.34,146.85,145.06,140.21,133.65,132.51,129.66,128.80,127.66,126.57,124.42,123.53,123.43,122.87,122.81,46.87。esihrms:c32h27n2[m-pf6]⁺的计算值为439.2169,实际测量值为439.2167。

如图1a所示tppy在dmso溶液中的归一化的紫外吸收光谱。如图1c所示随着甲苯(toluene)含量增加tppy、在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光增强倍数，λex＝500nm。图1d为tppy在固态时归一化的荧光发射光谱。

在另一实施例中，上述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，包括如下制备步骤：

步骤31、将4-溴三苯胺，5-醛基-2-噻吩硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾相混合，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第二中间产物；

步骤32、将第二中间产物和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，将反应液倒入无水乙醚中，得到第二红色固体粉末；

步骤33、将所述第二红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第二红色固体ttpy。

合成路线如下：

(1)化合物2的合成

称取4-溴三苯胺(50.0mg，0.15mmol)，5-醛基-2-噻吩硼酸(31.3mg，0.20mmol)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(11.3mg，0.02mmol)和碳酸钾(106.6mg，0.77mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，以1：1体积比加入20ml甲苯和甲醇混合溶剂作为反应溶剂，于75℃条件下回流反应16小时。反应结束后，减压旋蒸除去反应溶剂，加入100ml二氯甲烷作为有机相，经水、饱和氯化钠依次洗涤后，有机相经无水硫酸钠过夜干燥，减压旋干后得到粗产物。以pe/dcm(v/v,2/1)作为洗脱溶剂，通过200-300目硅胶柱纯化分离，得到亮黄色固体化合物2(48.6mg)，产率为91.3％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:9.85(s,1h),7.71(d,j＝4hz,1h),7.52(d,j＝8.8hz,2h),7.28-7.32(m,5h),7.05-7.15(m,8h)。esihrms:c23h17nos[m]⁺的计算值为355.1031,实际测量值为355.1011。

(2)化合物ttpy的合成

称取化合物2(40.0mg，0.11mmol)和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物(30.6mg，0.13mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，加入15ml无水乙醇作为反应溶剂，并滴加几滴哌啶做催化剂，于78℃条件下回流反应过夜。待反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入无水乙醚中，经沉淀过滤后得到红色固体粉末。将上述固体粉末重新溶解在丙酮中并与饱和的kpf6水溶液(1.6ml)混合均匀。室温搅拌1小时后，使用氮气吹扫使丙酮蒸发。经过滤，水洗涤并减压干燥得到红色固体。通过100-200目中性氧化铝柱纯化分离，得到红色粉末化合物ttpy(56.1mg)，产率为86.4％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.79(d,j＝6.8hz,2h),8.14-8.21(m,3h),7.62(d,j＝68.8hz,2h),7.50(d,j＝2.0hz,2h),7.35(t,j＝8.0hz,2h),7.07-7.14(m,7h),6.98(d,j＝8.8hz,2h),4.22(s,3h)。¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:152.22,147.83,147.20,146.57,144.82,138.68,133.75,129.78,126.84,126.32,124.78,124.21,123.93,122.95,122.23,121.22,46.75。esihrms:c30h25n2s[m-pf6]⁺的计算值为445.1733,实际测量值为445.1741。如图1a所示ttpy在dmso溶液中的归一化的紫外吸收光谱。如图1c所示随着甲苯(toluene)含量增加ttpy、在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光增强倍数，λex＝500nm。图1d为ttpy在固态时归一化的荧光发射光谱。

在另一实施例中，上述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的制备方法，包括如下制备步骤：

步骤41、将4-溴-4',4'-二甲氧基三苯胺，5-醛基-2-噻吩硼酸，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和碳酸钾相混合，在氮气保护下，加入甲苯和甲醇混合溶剂，在第二反应条件下反应，反应后分离得到第三中间产物；

步骤42、将第三中间产物和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物相混合，在氮气保护下，加入无水乙醇，并滴加哌啶做催化剂，在第一反应条件下回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中，将反应液倒入无水乙醚中，得到第三红色固体粉末；

步骤43、将所述第三红色固体粉末溶解在丙酮中并与饱和的六氟磷酸钾水溶液混合，在25℃条件下搅拌0.5-2小时，过滤得到第三红色固体meottpy。

合成路线如下：

具体来说，(1)化合物3的合成

称取4-溴-4',4'-二甲氧基三苯胺(50.0mg，0.13mmol)，5-醛基-2-噻吩硼酸(26.5mg，0.17mmol)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(11.3mg，0.02mmol)和碳酸钾(90.0mg，0.65mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，以1：1体积比加入20ml甲苯和甲醇混合溶剂作为反应溶剂，于75℃条件下回流反应16小时。反应结束后，减压旋蒸除去反应溶剂，加入100ml二氯甲烷作为有机相，经水、饱和氯化钠依次洗涤后，有机相经无水硫酸钠过夜干燥，减压旋干后得到粗产物。以pe/ea(v/v,3/1)作为洗脱溶剂，通过200-300目硅胶柱纯化分离，得到红色固体化合物3(50.9mg)，产率为94.4％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:9.83(s,1h),7.69(d,j＝4hz,1h),7.46(d,j＝9.2hz,2h),7.25(d,j＝4.8hz,1h),7.10-7.08(m,4h),6.91-6.85(m,6h),3.81(s,6h)。¹³cnmr(100mhz,cdcl3):182.47,156.51,155.06,149.98,140.78,139.85,137.79,127.19,127.11,124.21,122.27,119.23,114.85,55.46.esihrms:c25h21no3s[m]⁺的计算值为415.1242,实际测量值为415.1248。

(2)化合物meottpy的合成

称取化合物3(50.0mg，0.12mmol)和1,4-二甲基吡啶-1-碘化物(33.0mg，0.14mmol)加入到50ml双口瓶中。在氮气保护下，加入15ml无水乙醇作为反应溶剂，并滴加几滴哌啶做催化剂，于78℃条件下回流反应过夜。待反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入无水乙醚中，经沉淀过滤后得到红色固体粉末。将上述固体粉末重新溶解在丙酮中并与饱和的kpf6水溶液(1.7ml)混合均匀。室温搅拌1小时后，使用氮气吹扫使丙酮蒸发。经过滤，水洗涤并减压干燥得到红色固体。通过100-200目中性氧化铝柱纯化分离，得到红色粉末化合物meottpy(65.7mg)，产率为84.2％。核磁和质谱表征如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):8.76(d,j＝6.8hz,2h),8.12-8.19(m,3h),7.53(d,j＝8.8hz,2h),7.43-7.47(m,2h),7.06-7.10(m,5h),6.94-6.96(m,4h),6.77(d,j＝8.8hz,2h),4.2(s,3h),3.76(s,6h)。¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):156.24,152.23,148.96,147.80,144.70,139.26,138.00,133.86,133.83,127.26,126.63,123.98,123.39,122.79,120.75,118.41,115.07,55.25,46.66。esihrms:c32h29n2o2s[m-pf6]⁺的计算值为505.1950,实际测量值为505.1931。

如图1a所示meottpy在dmso溶液中的归一化的紫外吸收光谱。如图1c所示随着甲苯(toluene)含量增加meottpy(10μm)在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光增强倍数，λex＝500nm。图1b为随着甲苯(toluene)含量增加meottpy(10μm)在dmso/toluene(v/v)混合溶剂中的荧光发射谱图，λex＝500nm。图1d为meottpy在固态时归一化的荧光发射光谱。

基于相同的发明构思，本发明还提供了上述所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料的应用，用于革兰氏阳性细菌特异性标记和/或用于革兰氏阳性细菌光动力杀伤。

具体来说，深红/近红外多功能聚集诱导发光分子的吡啶环携带一定的正电荷，细菌表面具有负电性，由于正负电荷间的静电相互作用，正电性的聚集诱导发光分子易于在细菌表面聚集，为革兰氏阳性细菌的选择性成像提供了前提条件；由于细菌的细胞膜是由磷脂双分子层构成的，合适的脂水分配系数(3<clogp<5)使得聚集诱导发光分子能够嵌插入细菌的细胞膜，限制聚集诱导发光分子的运动，从而发出荧光；由于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌被膜结构存在差异，本发明所述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料在与细菌共培养时，更容易嵌插入革兰氏阳性细菌的细胞膜，实现革兰氏阳性细菌的特异性“点亮”成像；聚集诱导发光分子本身较强的供电子(d)-吸电子(a)效应，导致分子的吸收和发射波长红移，具有深红/近红外荧光发射以及较强的ros产生能力。

本发明所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料与革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌分别共培养一定时间后，在显微镜下观察或检测荧光强度，根据有无荧光信号即可判断是否为革兰氏阳性细菌。

本发明所述深红/近红外多功能聚集诱导发光材料与革兰氏阳性细菌结合后能检测到强的荧光信号，但革兰氏阴性细菌均不能检测到本发明所述化合物的荧光信号。同时还具有很高的活性氧(ros)产生能力，即使在低浓度(1μm)时，ros指示剂的荧光强度已达到初始值的1000多倍。

进一步地，本发明所述的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料能够高效光动力杀伤革兰氏阳性细菌。

下面通过具体的实施例来对聚集诱导发光材料的上述特性进行进一步的解释。

革兰氏阳性细菌的特异性成像

(1)细菌培养和细菌成像液准备

将固体琼脂板上的单个细菌菌落转移至10ml相应的液体培养基中，并在37℃，200rpm条件下培养6～8小时(培养基：lb用于大肠杆菌和铜绿假单胞菌，nb用于金黄色葡萄球菌和tsb用于粪肠球菌)。离心(7100rpm，2分钟)，弃上层培养液，下层为细菌，然后用pbs洗涤两次。除去上清液后，将剩余的细菌用pbs重悬，并在稀释至600nm下光密度为1.0(od600＝1.0，约10⁸cfuml^-1)。

(2)细菌染色和成像

通过上述步骤，得到500μl细菌(od600＝1.0)，再次离心(7100rpm，2分钟)，除去上清液，向剩余细菌中加入50μl上述合成化合为(2mμ)的pbs溶液，涡旋分散，孵育20分钟。将约2μl染色后的细菌溶液转移到载玻片上，然后盖上盖玻片进行成像。在荧光显微镜(uprightbiologicalmicroscopeni-u)下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行成像，具体设置如下：激发滤光片＝460-490nm，二向色镜＝505nm，发射滤光片＝515nm长通；使用荧光共聚焦显微镜(fv1200-ix83，olympus，japan)对铜绿假单胞菌和粪肠球菌进行成像，激发波长为488nm，并收集530-700nm范围内的荧光信号。

图2a-2d为tpy、tppy、ttpy、meottpy(2μm)分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共同孵育20分钟后的clsm图。

图3为tpy、tppy、ttpy、meottpy(2μm)分别与铜绿假单胞菌和粪肠球菌共同孵育20分钟后的clsm图。从图中可以看出，与tpy、tppy、ttpy、meottpy(2μm)共同孵育后，革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌均发出明亮的荧光，具有较高信噪比；革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌则几乎无荧光发出。以上结果表明，tpy、tppy、ttpy、meottpy可以选择性的对革兰氏阳性细菌成像。

革兰氏阳性细菌的光动力杀伤

(1)溶液中活性氧的检测

使用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为ros指示剂检测白光(22.1mwcm^-2)照射下聚集诱导发光分子在溶液中的ros产生情况。

首先，将dcfh-da的乙醇溶液(1mm，0.5ml)加入到2mlnaoh溶液(0.01m)中，并在室温下搅拌30分钟，使dcfh-da水解为dcfh，后用10mlph7.4的1×pbs中和水解产物，得到已活化的ros指示剂(40μm,12.5ml)，4℃，避光保存，备用。

然后，将已活化的ros指示剂(40μm)与聚集诱导发光分子混匀在pbs中，使得ros指示剂和聚集诱导发光分子的终浓度分别为10μm/5μm，50nm/1μm，在白光照射不同时间后，用荧光光谱仪(edinburghfs5)检测由聚集诱导发光分子产生ros触发的2'，7'-二氯荧光素的荧光强度，反应ros产生情况。激发波长为488nm，并收集490-600nm范围内的荧光信号。

图4a为随着白光(22.1mwcm^-2)照射时间延长，tpy、tppy、ttpy、meottpy(50nm)与ros指示剂dcfh(10μm)混合液的荧光强度增强倍数；4b为随着白光(22.1mwcm^-2)照射时间延长，ttpy(1μm)与ros指示剂dcfh(5μm)混合液的荧光强度增强倍数。从图4a可以看出，单独的dcfh几乎无荧光，加入了tpy、tppy、ttpy、meottpy后，随着白光照射时间延长，dcfh荧光逐渐增强，证明tpy、tppy、ttpy、meottpy均能在白光照射下有效产生ros。如图4b所示，当ttpy浓度为1μm时，白光照射30s后，dcfh的荧光强度即增强为初始值的1000多倍，表明其高效的ros产生能力。

(2)光动力杀伤革兰氏阳性细菌

通过传统的平板培养和菌落计数法评估聚集诱导发光分子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

对于聚集诱导发光分子在暗处的抗菌活性的考察，聚集诱导发光分子(2μm)分别与大肠杆菌/金黄色葡萄球菌(～2×10⁷cfuml^-1)的pbs混悬液共孵育20分钟(37℃)。接下来，用pbs将孵育后的细菌悬浮液连续稀释10⁴倍。将100μl稀释的细菌涂布在相应的固体琼脂平板上，37℃下孵育14-16小时。根据减少的菌落比例评估聚集诱导发光分子对细菌的抗菌活性。计数琼脂平板上的细菌菌落，并根据方程式[(a-b)/a]×100％计算菌落数降低的比例，其中a是对照样品中的细菌菌落的平均数目(无聚集诱导发光分子)，b是与聚集诱导发光分子一起培养和/或光照处理后的平均细菌菌落数。结果重复三次。

关于聚集诱导发光分子在光照下的抗菌活性，细菌与聚集诱导发光分子在暗处孵育5分钟，然后在白光(60mwcm^-2)下照射15分钟。其余实验操作与暗处相同。

图5a、5b分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理下的琼脂板照片和对应菌落数统计图。从图中可以看出，无ttpy处理组，在暗处和光照条件下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在琼脂板上生长状态良好；单独ttpy处理对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显抗菌作用；ttpy和光照共同处理组，琼脂板上已几乎无金黄色葡萄球菌可见菌落生长，菌落数下降比例接近100％，而琼脂板上大肠杆菌菌落数无明显变化，表明ttpy能够通过光动力作用特异性杀伤革兰氏阳性细菌。图5(c)为金黄色葡萄球菌在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理下的扫描电镜图。从图中可以看出，在ttpy和光照共同作用下，金黄色葡萄球菌被膜的完整性遭到破坏，从而导致了革兰氏阳性细菌的死亡。

在体抗菌抗感染

将16只6～8周普通雄性wistar大鼠随机分为4组：(1)用ttpy

和白光照射处理的细菌感染组；(2)单独用ttpy处理的细菌感染组；(3)未经治疗的细菌感染组；(4)无细菌感染的对照组。将大鼠麻醉后，去除背侧脊柱两侧的皮肤，在每只大鼠上制备两个1.5×1.5cm²的开放伤口，在大鼠的每个伤口上接种50μl金黄色葡萄球菌悬浮液(2×10⁸cfuml^-1)，建立金黄色葡萄球菌感染的伤口模型。对于ttpy治疗组，在每个伤口上加入50μlttpy(4μm)并用无菌无纺布覆盖20分钟。随后，用白光(60mwcm^-2)照射伤口30分钟或不照射。ttpy注射和白光照射的操作每天进行一次，持续4天。在感染后第1天和第4天用照相机对伤口区域成像。在感染后第4天收集所有小鼠整个伤口及相邻的正常皮肤。为了测定大鼠感染组织中细菌的量，将感染组织分离并在生理盐水中匀浆，然后用生理盐水稀释1000倍。将20μl稀释的细菌溶液涂布到lb琼脂板，在37℃下进行培养。24小时后，对平板上的细菌菌落计数，分析。将其他组织固定在4％多聚甲醛中固定，制作厚度为4mm的石蜡切片，用于组织学分析。

图6a第一行和第二行分别为金黄色葡萄球菌感染的大鼠伤口在有/无ttpy(2μm)和/或白光(60mwcm^-2)条件处理后，第一天和第四天的伤口照片；第三行和第四行分别为第四天伤口组织切片的he染色图和局部放大图。从图中可以看出，感染后第一天，所有金黄色葡萄球菌感染组均表现一定程度的伤口化脓情况；第四天，无任何处理和ttpy单独处理的金黄色葡萄球菌感染组的伤口化脓情况加重，ttpy和白光照射处理的金黄色葡萄球菌感染组大鼠的伤口化脓情况明显减轻；同时，h&e染色结果显示，ttpy和白光共同处理组的中性粒细胞较其他组明显减少，表明ttpy可以通过光动力在体杀伤金黄色葡萄球菌，有效控制伤口感染。

图6b和6c分别为将6a图照片中所对应伤口组织均匀混悬液涂布于琼脂板14h～16h后的琼脂板菌落图和对应菌落数的统计图。从图中可以看出，对照组和ttpy与白光共同处理组对应的琼脂板上几乎无金黄色葡萄球菌菌落形成，单纯光照和ttpy处理的细菌感染组对应的琼脂板琼脂板上有较多细菌菌落形成，进一步表明ttpy可以通过光动力在体杀伤金黄色葡萄球菌。

综上所述，本发明提供了一种深红/近红外多功能聚集诱导发光材料及其制备方法和应用。本发明所提供的聚集诱导发光材料，其分子结构中具有吡啶环携带一定的正电荷，有助于聚集诱导发光材料与细菌通过静电相互作用相结合。由于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌被膜结构存在差异，本发明所述分子在与细菌共培养时，能够实现革兰氏阳性细菌的特异性“点亮”成像；分子本身较强的供电子(d)-吸电子(a)效应，导致分子的吸收和发射波长红移，具有深红/近红外荧光发射以及较强的ros产生能力。

同时，本发明所提供的深红/近红外多功能聚集诱导发光材料能够高效杀伤革兰氏阳性细菌。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。