一株拮抗果蔬采后灰霉病原菌的细菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株拮抗果蔬采后灰霉病原菌的细菌菌株及其应用。

背景技术：

水果产业是我国种植业中位列粮食、蔬菜之后的第三大产业，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，果蔬在采后贮藏运输过程中，由于病原菌侵染、呼吸和衰老等原因易导致腐烂变质，造成的损失非常巨大。据估计，发达国家每年有20-25％的果蔬在釆后过程中由于病原菌的侵染导致腐烂，而在发展中国家损失则更为严重。据统计，我国每年由水果采后腐烂造成的损耗约占总产量的30％，经济损失达数百亿元人民币。随着果蔬采后生理衰老进程得到有效地控制，越来越多的研究者们开始意识到，控制果蔬的最终损失还必须从控制致病微生物所导致的采后病害入手。因此，掌握引起果蔬采后病害的病原菌种类及侵染途径，预测它们的采后致病规律，是制定控制措施的前提条件。

目前控制果蔬采后病害的主要措施是使用化学杀菌剂。尽管化学杀菌剂防治果蔬采后病害效果明显，但化学药剂的残留以及对人体健康造成的不良影响，已逐渐被人们所共识。很多杀菌剂不能再用于果蔬菜的采后贮藏，如苯来特、多菌灵、双肌盐等。因此，迫切需要寻求一些新的、无毒高效的防腐技术，以逐步取代化学杀菌剂在采后果蔬上的使用。

微生物防治技术经过二十多年的研究己从实验室向生产应用的商业化发展，许多研究都证明利用拮抗微生物来控制病害是一项具有很大潜力的新兴技术。果实采后相对稳定的贮藏环境条件以及与田间生物量相比果实采收后体积大大下降，均有利于经济、有效地实施生物控制方法。目前，分离到的生防菌主要有小型丝状真菌、细菌和酵母菌等。迄今为止，已从柑橘、苹果、桃、梨、猕猴桃、鲜枣等10多种水果中筛选出几十种拮抗微生物。

目前市场上用于采后病害防治的微生物保鲜剂商业化产品有基于拮抗细菌pseudomonassyringae的产品(美国)(用于防治红薯和马铃薯病害)和基于拮抗酵母metschnikowiafructicola的产品shemer(以色列)(用于防治红薯和胡萝卜病害)。微生物保鲜领域进程也在积极推进，例如比利时的bionext公司和法国的leasaffreinternational公司均在研发拮抗微生物candidaoleophila产品，加拿大的neovatechnologies公司也在开发基于candidasaitoana的产品。此外，最近在西班牙，一个基于candidasake的产品gandifruit通过注册，其主要用于仁果类保鲜，目前对浆果、仁果以及核果均具有保鲜、防腐功能的微生物较少。

技术实现要素：

本发明的目的之一是针对果蔬采后存在病原菌引起果蔬腐烂、发霉的技术问题，提供一种能够拮抗果蔬采后灰霉病原菌的细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌h-1(bacillusvelezensish1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019274，保藏日期为2019年4月19日。

进一步的，所述果蔬采后灰霉病原菌为串珠镰孢菌、细极链格孢菌和灰葡萄孢霉菌。

本发明的目的之二是提供上述细菌菌株的发酵液。

进一步的，上述细菌菌株的发酵液的制备方法，包括以下步骤：

挑取贝莱斯芽孢杆菌h-1单菌落于lb液体培养基中28℃，200r/min，培养24h后，稀释1-10倍制得。

本发明的目的之三是提供上述细菌菌株为活性成分的灰霉病原菌生物抗菌剂。

本发明的目的之四是提供上述细菌菌株拮抗果蔬采后灰霉病中的应用。

进一步的，所述果蔬为梨。

本发明的目的之五是提供上述细菌菌株在抑制冬枣或葡萄采后自然腐烂中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的拮抗果蔬采后灰霉病的细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌h-1在抑制果蔬采后灰霉病方面的作用极为显著，对灰葡萄孢霉菌有很强的抑制作用，能明显抑制对灰葡萄孢霉孢子萌发和芽管的生长，并对梨采后灰霉病、冬枣采后自然腐烂和葡萄采后自然腐烂具有很好的抑制作用，为果蔬采后保鲜提供了一条环保、简单、有效的途径。

生物材料保藏信息说明

bacillusvelezensish1，在本申请中也称作贝莱斯芽孢杆菌h-1，已于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019274，保藏单位地址是中国武汉武汉大学，邮编为430072，分类命名为bacillusvelezensish1。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌h-1在lb培养基菌落形态图。

图2为贝莱斯芽孢杆菌h-1的显微形态图(1000倍)。

图3为贝莱斯芽孢杆菌h-1基于16srdna序列的系统发育树；图中拉丁名后为相应菌株在genbank的编号。

图4为贝莱斯芽孢杆菌h-1基于gyrb基因序列的系统发育树；图中拉丁名后为相应菌株在genbank的编号。

图5为不同浓度贝莱斯芽孢杆菌h-1菌悬液对3种病原菌的抑制效果。

图6为贝莱斯芽孢杆菌h-1对梨采后灰霉病的抑制作用。

图7为贝莱斯芽孢杆菌h-1对冬枣自然腐烂的抑制作用。

图8为贝莱斯芽孢杆菌h-1不同处理液在26℃对葡萄自然腐烂抑制效果影响。

图9为贝莱斯芽孢杆菌h-1不同处理液在16℃对葡萄自然腐烂抑制效果影响。

图10为贝莱斯芽孢杆菌h-1不同处理液在0℃对葡萄自然腐烂抑制效果影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1

贝莱斯芽孢杆菌h-1菌株的分离和筛选

番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢霉(botrytiscinerea)从自然发病的番茄果实表面分离得到，经纯化后接种于pda培养基上，在26℃下培养7d后，采用血球计数法用无菌水配成1×10⁶孢子ml^-1的孢子悬浮液。用于分离拮抗菌的梨果实为采自山西省原平市玉露香梨园；接种用的樱桃番茄购于太原市小店区。

贝莱斯芽孢杆菌h-1菌株的分离：分别取3个贮藏期的梨果放入盛有0.2m磷酸缓冲液中，在100r/min摇床中旋转振荡10min后，弃去洗液，再加入磷酸缓冲液，在超声波清洗器中清洗30s，进行二次洗涤。二次洗涤所得的液体经10倍、100倍和1000倍梯度稀释后，各取100μl涂布于pda培养基上，26℃培养2-3d。挑取培养皿中生长的各个不同的单菌落再在pda平板进行划线培养，进一步纯化。

筛选：从pda培养基上挑取单菌落，在lb培养基中于28℃下摇床培养24h。挑取单菌落于28℃下200r振荡培养24h后，配成1×l0¹⁰cfu/ml的悬浮液备用。将樱桃番茄用2％naclo溶液表面消毒2min后，自来水冲洗干净，无菌风吹干。用无菌接种针在樱桃番茄果实腰部刺3mm×3mm的伤口，每果刺1个伤口，先在伤口处接种50μl分离的拮抗菌悬浮液，2h后再接种15μl1×10⁶孢子/ml的病原菌孢子悬浮液，以无菌水作为对照，无菌风吹干后将果实放入塑料盒中，26℃恒温保湿培养。7d后测定果实的发病率和病斑直径。每处理10个果实，3次重复。

在梨果表面共分离48个菌株，将48个菌株发酵培养后，对樱桃番茄伤口接种，保湿培养5-7天后，发现与对照相比，有生防作用的菌株为21株，其中采用h-1菌株处理的番茄发病率为0％，而对照番茄发病率为100％。

实施例2

贝莱斯芽孢杆菌h-1菌株的鉴定

2.1菌体培养

将冻干保藏的菌种复状培养后，在平板上划线分离，培养20h后挑取单菌落接种到20ml液体培养基中，30℃200rpm培养15h。

2.2基因组dna提取

(1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在合适的温度下培养。根据细菌的生长率不同培养时间可由几小时到几天不等。

(2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13000rpm离心2min，弃上清。

(3)沉淀重悬于1.0ml0.85％nacl中。

(4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。

(5)沉淀重悬于550μl1×te中。

(6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。

(7)加3μl蛋白酶k(20mg/ml)，37℃温育30min。

(8)加30μl10％sds，37℃温育30min。

(9)加100μl5mnacl充分混匀。

(10)加80μlctab/nacl溶液，混匀，65℃水浴10min。

(11)加等体积(0.7～0.8ml)氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻振荡混匀。

(12)室温，13,000rpm离心10min。

(13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)轻轻振荡混匀。

(14)重复第(12)步。

(15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)轻轻振荡混匀。

(16)重复第(12)步。

(17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后4℃静置30min。

(18)20℃13,000rpm离心7min。

(19)弃上清，加500μl70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。

(20)4℃15,000rpm离心7min。

(21)重复洗盐两次。

(22)倒置离心管，干燥dna沉淀7min。

(23)dna沉淀溶于100μl1×te缓冲液，-20℃保存，作为模板dna备用。

3.贝莱斯芽孢杆菌h-1的16srdna的克隆

引物为：

27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(如seqidno.1所示)；

1492r：5’-acggttaccttgttacgactt-3’(如seqidno.2所示)。

16srdna反应体系为100μl：taq(5u/ml)0.8μl；10×pcrbuffer(mg²⁺plus)10μl；dntpmixture(2.5mm/each)8μl；模板dna2.5ng；引物f1(10mmol/l)2μl，引物r1(10mmol/l)2μl；ddh2o补足到100μl。

pcr反应条件为：(1)95℃预变性5min；(2)95℃下1min,57℃下退火1min,72℃下延长1min20s,30个循环；(3)72℃终止5min。

pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳、eb染色后用紫外凝胶成像系统进行分析，回收目的片段并纯化后，由上海英骏基因有限公司进行序列测定，测序结果如序列表seqidno.3。

4.贝莱斯芽孢杆菌h-1的gyrb基因克隆

引物为：

gyrb-34f：5'-ggtgtwrgkgcngtcgtaaacg-3'(如seqidno.4所示)；

gyrb-977r：5'-ccsgcagartcaccctctacg-3'(如seqidno.5所示)；

反应体系为100ul：taq(5u/μl)0.8μl；10×pcrbuffer(mg²⁺plus)10μl；dntpmixture(2.5mm/each)8μl；模板dna2.5ng；gyrb-f(10mmol/l)2μl，gyrb-r(10mmol/l)2μl；ddh2o补足到100μl。

反应程序为：(1)95℃预变性5min；(2)95℃下变性1min，55℃下退火2min15s，72℃下延长2min15s，3个循环；(3)95℃下变性35s，55℃下退火1min，72℃下延长1min15s，30个循环；(4)72℃终止7min。

pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳、eb染色后用紫外凝胶成像系统进行分析，回收目的片段并纯化后，由上海英骏基因有限公司进行序列测定，测序结果如序列表seqidno.6。

5.同源比较与系统发育树的构建

5.1贝莱斯芽孢杆菌h-1的16srdna同源性分析及系统发育树构建

16srdna扩增产物序列全长为1437bp。将所测得序列经blast进行同源性比较后，以日内瓦分枝杆菌(mycobacteriumgenavense)为外群，用mega4.1软件采用临位连接法构建该菌株的16srdna的系统发育树(图2)，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示bootstrap值大于50％数值。聚类结果显示，菌株h-1与解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)聚为一类，表明其亲缘关系较近。

5.2贝莱斯芽孢杆菌h-1与相关种的gyrb基因序列系统发育进化树

通过对持家基因gyrb进行进一步验证，扩增的片段经测序所得序列长度为892bp。为了进一步鉴定菌株h-1的种，将所测得序列经blast进行同源性比较后，以芽孢杆菌bacillussafensisfo-036b^t为外群，用mega4.1软件采用临位连接法构建该菌株h-1的gyrb基因系统发育树(图3)，菌株h-1与贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensisbcrc17467^t)聚为一类，自举支持率为100％，所以确定菌株h-1属于贝莱斯芽孢杆菌。

6.贝莱斯芽孢杆菌h-1形态鉴定

贝莱斯芽孢杆菌h-1呈杆状，有芽孢。在细菌培养基平板上菌落呈圆形，边缘不整齐，乳脂色，不透明，如图1所示。

7.贝莱斯芽孢杆菌h-1的生理生化测定

依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对贝莱斯芽孢杆菌h-1的生理生化反应进行检测，明确形态和基本生理生化特性。本发明贝莱斯芽孢杆菌h-1的形态和基本生理生化特征如表1所示：

表1贝莱斯芽孢杆菌h-1的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性，“w”表示弱阳性

实施例3

贝莱斯芽孢杆菌h-1的抑菌效果研究

1.贝莱斯芽孢杆菌h-1对病原菌的体外抑制作用

采用菌碟法，将贝莱斯芽孢杆菌h-1纯化后，挑取单菌落接种于100ml的lb液体培养基中，30℃200r振荡培养24h，用稀释平板法测定浓度后，以无菌水配制浓度分别为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹的拮抗菌悬浮液。在装有pda的培养皿(直径9cm)中，待培养基凝固后，分别加入不同浓度的拮抗菌h-1悬浮液100μl，涂布均匀后，无菌风吹干，再于中心点接入直径为5mm的灰葡萄孢霉菌饼，对照加无菌水。28℃下恒温培养，5-7d后测量菌落直径，并计算其抑制率，每次处理3次重复，实验重复3次。

抑制率(％)＝(dc-dt)/(dc-5)×100

其中：dc为对照菌落直径(mm)，dt为不同处理条件下菌落直径(mm)；

结果如图5所示，不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌h-1均可以有效抑制串珠镰孢菌(fusariumverticillioides)、细极链格孢(alternariatenuissima)和灰葡萄孢霉(botrytiscinerea)菌丝的正常生长，且拮抗菌菌液的浓度越大，其抑菌作用也越强。

2.贝莱斯芽孢杆菌h-1对灰葡萄孢霉孢子萌发和芽管伸长的影响

在灭菌的培养皿内中加铺多层灭菌滤纸，无菌水湿润，在滤纸上放置凹形载玻片。用2％蔗糖溶液配制孢子数为3×10⁵个/ml的灰葡萄孢霉孢子悬浮液，吸取悬浮液20μl于凹形载玻片上，分别加15μl培养24h的拮抗菌h-1发酵原液和稀释5，10，20，40倍的发酵液，对照加无菌水，加上盖玻片，在培养皿加盖后于25℃下保湿培养72h后，随机选取200个孢子观察孢子萌发情况并测量芽管长度，每个处理重复3次，试验重复3次。

结果：不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌h-1发酵液与病原菌灰葡萄孢霉共同培养72h后，结果显示，发酵液浓度越大，其抑制作用越强。其中对照孢子萌发率达到92.34％，且平均长度为212.17μm，而用发酵液处理后孢子萌发明显受到抑制，发酵原液和稀释5倍发酵液处理孢子完全不能萌发，而稀释10倍发酵液仅有极少孢子稍稍萌发，稀释20倍发酵液处理芽管长度大多与孢子直径相当或略长于孢子直径，而稀释40倍发酵液孢子较20倍更长，虽萌发的更多，但远远小于对照，孢子萌发率仅为32.76％(表2)。

表2不同浓度贝莱斯芽孢杆菌h-1培养液对灰葡萄孢霉孢子萌发和芽管长度的影响

3.贝莱斯芽孢杆菌h-1对梨采后灰霉病的抑制效果

取无病虫害的健康梨果，用2％naclo进行果实表面消毒，于果实腰部位刺直径为5mm深3mm的伤口，每果2个伤口。在伤口分别加1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌h-1菌悬液，对照(ck)加无菌水。2h后在伤口接1×10⁵孢子/ml的灰葡萄孢(b.cinerea)20μl，室温下保湿培养，5d后测量病斑直径并计算抑制率。每处理10个果。实验重复3次。

结果：接入不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌h-1悬浮液后，发病率统计结果如图6所示，随着浓度的升高,梨果灰霉病的发病率下降。ck灰霉病的发生率为100％；拮抗菌浓度为1×10⁸cfu/ml时，发病率为56.41％，1×10⁹cfu/ml为47.63％，1×10¹⁰cfu/ml时仅为5.24％，在最高浓度1×10¹¹cfu/ml时，可完全抑制病害的发生；且拮抗菌浓度越大，病斑直径越小。

4.贝莱斯芽孢杆菌h-1对冬枣自然腐烂的抑制效果

将贝莱斯芽孢杆菌h-1从-80℃中取出，划线培养后，于lb液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，加水定容至1l)中28℃200r/min进行摇瓶培养，用发酵原液、稀释5倍发酵液、稀释10倍发酵液分别对枣果浸泡2min后，捞起沥干后，置于0℃冷库，待果实表面水分吹干后，用pe袋保湿置于0℃条件下(对照不作浸泡处理)，90天后统计枣果的腐烂率。每处理5kg枣果，设3个重复，实验重复3次。

结果如图7所示，于0℃贮藏90天后，不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌h-1处理液均可有效抑制冬枣果实采后的自然腐烂。对照冬枣果实腐烂率为94.56％，而稀释5倍的发酵液处理腐烂率最低为46.23％，其生防效率达到51.11％，其次为发酵原液为57.34％，其生防效率为39.36％。

5.贝莱斯芽孢杆菌h-1对葡萄采后自然腐烂的抑制效果

挑取贝莱斯芽孢杆菌h-1单菌落于100/250ml的lb液体培养基中28℃，200r/min，培养24h后，进行如下处理：a.发酵原液；b.稀释5倍发酵液；c.稀释10倍发酵液；将商品成熟期的健康玫瑰香葡萄分别于以上5种溶液中浸泡2min后取出，无菌风吹干后，于26℃，16℃和0℃下，分别在贮藏15，25d和70d时检查果实和果梗的腐烂程度，根据腐烂程度将果实分级后称重，并分别计算果梗腐烂率、果实腐烂指数和防治效果。每个处理葡萄果实为5kg，每个处理做3个重复，试验重复2次。

其中果梗无霉变现象则为正常，否则视为腐烂。果实根据腐烂程度分为5个等级，分级标准：0级：果实完好，无任何腐烂；1级：果实表面现轻微斑点，腐烂面积占果实表面的1/3以下；2级：果实果面有明显腐烂，腐烂面积约占果实表面的1/3～1/2；3级：果实存在超过果实表面1/2的腐烂，果实尚有一定硬度；4级：果实整体完全溃烂。将果实分级后分别称重。果肉腐烂指数计算公式：

结果：采用拮抗菌的不同处理液对葡萄采后自然腐烂的抑制，在26℃，16℃和0℃条件下的结果分别对对应图8、图9、图10，拮抗菌不同处理液均可有效抑制葡萄果实的采后腐烂，其中，发酵液和菌悬液的防腐烂效果较好。在发酵液中，稀释5倍发酵液较发酵原液和稀释10倍的发酵液抑制效果更好。在3个温度条件下分别贮藏15d，25d和70d时，对照的果梗腐烂率分别为88.89％，100.00％和100.00％，而在相同条件下稀释5倍发酵液的果梗腐烂率分别为30.42％，25.96％和16.67％，菌悬液的果梗腐烂率分别仅为34.02％，28.33％和17.20％。在0℃下贮藏70d时，果肉腐烂指数为67.14％，而稀释5倍的发酵液和菌悬液为3.21％和6.77％。对果梗腐烂和果肉腐烂的抑制作用，均为稀释5倍的发酵液效果最好。对比3个温度的防治效果，在26，16℃和0℃下，无论是果实还是果梗，均在0℃下防治效果最好。因此，稀释5倍发酵液在0℃条件下，其防治效果可达到95.22％(表3)。

表3贝莱斯芽孢杆菌h-1不同处理液对葡萄果梗和果肉防治效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所

<120>一株拮抗果蔬采后灰霉病原菌的细菌菌株及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagtttgatcctggctcag20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acggttaccttgttacgactt21

<210>3

<211>1437

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgcctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcgga60

cgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccgggg120

ctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctacc180

acttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcga240

cgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagac300

tcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacg360

ccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgc420

cgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgc480

cagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggc540

tcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattg600

gaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatg660

cgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctg720

aggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacg780

atgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcac840

tccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcaca900

agcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacat960

cctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatg1020

gttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttg1080

atcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggagg1140

aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctaca1200

atggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctc1260

agttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggat1320

cagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgaga1380

gtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgg1437

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggtgtwrgkgcngtcgtaaacg22

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ccsgcagartcaccctctacg21

<210>6

<211>892

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tcgtaaacgccttgtcgaccactcttgacgttacggttcatcgtgacggaaaaatccact60

atcaggcgtacgagcgcggtgtacctgtggccgatcttgaagtgatcggtgatactgata120

agaccggaacgattacgcacttcgttccggatccggaaattttcaaagaaacaaccgaat180

acgactatgacctgctttcaaaccgtgtccgggaattggccttcctgacaaaaggtgtaa240

acatcacgattgaagacaaacgtgaaggacaagaacggaaaaacgagtaccactacgaag300

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