一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用与流程

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊dnmt3b基因nc_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择(mas)育种中的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但近年来羊肉、羊奶、羊绒等羊产品严重短缺。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，通过对在dna水平上筛查的与山羊产羔数性状密切相关的dna标记位点进行检测，并根据其基因多态性与产羔数性状的关联，从而可以加快建立优良产羔数性状山羊种群。

标记辅助选择(mas)是通过对目标基因所连锁的分子标记的基因型分析从而进行育种的一种方法，使用这种方法可以大幅度的缩短育种年限，针对某一性状专一选择，从而提高了育种效率。

在众多的分子标记中，天然的分子遗传标记有单核苷酸多态性(snp)、基因组结构变异(sv)、插入/缺失突变(indel)三种。近年来，随着测序技术的不断升级与测序成本的降低，插入/缺失突变作为分子遗传标记而逐渐受到人们的重视。插入/缺失突变是发生在亲缘关系较近物种同一位点的序列不同大小片段(一般在50bp以下)的插入或缺失。而indels的应用已经成为分子育种的热点：在繁殖方面，有报道山羊kdm6a内含子16bp的indel可以显著的影响山羊的产羔数(cuietal.,2018)；还有报道山羊lhx4第一内含子上存在的12bp的indel可以显著的影响山羊的产羔数(yanetal.,2018)。这些研究都表明挖掘indels对动物分子育种具有重要的意义和参考价值。

山羊dnmt3b基因位于13号染色体上，具有22个外显子与21个内含子。dnmt3b是dnmts家族的重要成员，其编码的甲基转移酶是哺乳动物胚胎发育必需的酶。dnmt3b主要功能是从头甲基化，也有维持甲基化的功能。dnmt3b在早期胚胎发育中起主要作用，特别是在早期胚胎发育的晚期阶段(okanoetal.,1999；katoetal.,2017)。与dnmts家族其他成员相比，dnmt3b可以作用于真核染色体卫星区域中重复dna序列的cpg岛，为其添加甲基化，此功能是其他dnmt成员所不具备的。另外，卵母细胞甲基化也需要dnmt3b，dnmt3b的失活会导致小鼠胚胎死亡(okanoetal.,1999；hirasawaetal.,2008；uysaletal.,2015；katoetal.,2017)。近年来，使用全基因组关联分析已经揭示了山羊不同产仔数的遗传信息，并筛选到dnmt3b为山羊产多羔的关键基因(laietal.,2016)。

尽管大量研究和全基因组分析表明，dnmt3b在山羊的繁殖中发挥着关键作用。然而，dnmt3b多态性对山羊繁殖性状的影响尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良性状的山羊遗传资源群体。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊全基因组dna为模板，以引物对p1为扩增引物，利用pcr扩增包含山羊dnmt3b基因第21内含子(dnmt3b最后一个内含子)插入/缺失多态性位点的片段，对pcr扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定待测山羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自山羊dnmt3b基因nc_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点。

优选的，所述引物对p1为：

上游引物f：5'-caagacaggtgccctcaaga-3'(20nt)；

下游引物r：5'-cagatgcgcccccaaca-3'(17nt)。

优选的，所述pcr采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12～24s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12～24s，25～30个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述电泳采用质量浓度为3.0～3.5％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)表现为209bp一条带纹，插入/缺失基因型(id)表现为209bp和198bp两条带纹，缺失/缺失基因型(dd)表现为198bp一条带纹。

一种山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于pcr扩增上述山羊dnmt3b基因21内含子区插入/缺失多态位点的引物对(例如，上述引物对p1)。

上述山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失基因型(dd)可以作为提高山羊产羔数的dna标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据山羊dnmt3b基因内含子区插入/缺失多态性位点(参考序列nc_030820.1:g.61500477_61500478)设计引物，以山羊基因组dna为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

本发明对山羊(例如，陕北白绒山羊)dnmt3b基因插入/缺失多态性位点(参考序列nc_030820.1:g.61500477_61500478)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与山羊生产性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为山羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立产羔数性状优良的山羊种群，提高良种选育速度。

附图说明

图1为山羊dnmt3b基因扩增产物(引物对p1)的琼脂糖凝胶电泳结果；m表示marker。

图2为山羊dnmt3b基因pcr扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示11-bp插入序列：nc_030820.1:g.61500477_61500478incggccaggaga。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用pcr方法对所发现的山羊dnmt3b基因g.61500477_61500478位点(参考序列：nc_030820.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊产羔数性状进行关联分析，验证其是否存在可以作为山羊分子育种中标记辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①taqdna聚合酶(购自fermantas即mbi公司)；②蛋白酶k(购自华美生物工程公司)；③markeri(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、tris、edta、nacl、naoh、kcl、na2hpo4、kh2po4、tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(sds)、溴化乙锭(eb)、溴酚蓝、二甲基苯氰ff、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等，普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制；高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵pa)、25min。试剂配制方法均参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》；

1)提取组织样dna所用溶液

①2mol/lnacl：11.688g溶于水，定容至100ml，高压灭菌；

②组织dna提取液(100ml)：1mol/ltris-hcl(ph8.0)1ml、0.5mol/ledta(ph8.0)20ml，及2mol/lnacl5ml，定容至100ml。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×tbe缓冲液：取10×tbe50ml定容至1000ml；

②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青ff，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计山羊dnmt3b基因indel位点扩增引物

在ncbi上检索山羊dnmt3b基因的序列(nc_030820.1)，并利用primer5.0设计能够扩增dnmt3b基因多个候选indel位点dna片段的引物，其中能够扩增山羊dnmt3b基因21内含子区g.61500477_61500478indel位点的pcr引物对为p1(引物设计完成时间2018年10月)。引物对p1序列见表1。

表1.山羊dnmt3b基因indel位点扩增引物表

上述引物对p1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊dnmt3b基因21内含子区的候选indel位点(nc_030820.1:g.61500477_61500478)的片段。理论上，当g.61500477_61500478位之间的序列cggccaggaga缺失时，利用引物对p1进行pcr扩增所得到的是198bp大小的带纹；当g.61500477_61500478位之间的序列cggccaggaga存在(插入)时，利用引物对p1进行pcr扩增所得到的是209bp大小的带纹；当g.61500477_61500478位之间的序列cggccaggaga在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，利用引物对p1进行pcr扩增所得到的是大小分别为209bp和198bp的带纹。

3.以引物对p1pcr扩增待测山羊dnmt3b基因片段

3.1山羊耳组织样品的采集

实验所用的动物共计1534个样本，具体信息见表2。产羔数性状数据由原种场工作人员测量，采取个体耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表2.采样信息

3.2组织样品基因组dna的提取与分离

参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[d.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测dna

参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4dna的纯化

参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测dna

用紫外光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值。计算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除rna纯化。

dna浓度(ng/μl)＝50×od260值×稀释倍数。

dna检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μl，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6pcr扩增

pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mleppendorfpcr管中，然后加入模板dna(浓度为50ng/μl的山羊基因组dna)，再瞬时离心后进行pcr扩增；pcr反应体系包括2×taqpcrsupermix(包括taqdna聚合酶、dntps和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl(上、下游引物浓度为10pmol/μl)；基因组dna0.6μl；去离子水4.9μl；共13μl。

3.7pcr反应的程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。

4.pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.5μl，点样后120v电压电泳1.0～1.2h；2)待分子量不同的dna片段分离清晰时，在bio-radgeldoc2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析indel位点多态性；

对于陕北白绒山羊dnmt3b基因g.61500477_61500478位存在的11-bp插入/缺失多态性位点，其插入/缺失突变(indel)在不同山羊个体中的多态性分析结果参见图1，pcr的扩增产物(引物对p1)经琼脂糖凝胶电泳检测之后，所扩增的对应插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)表现为209bp一条带纹，插入/缺失基因型(id)表现为209bp和198bp两条带纹，缺失/缺失基因型(dd)表现为198bp一条带纹。分析结果经测序进行了验证，参见图2。

5.山羊dnmt3b基因indel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。pyy＝nyy/n，其中pyy代表某一位点的yy基因型频率；nyy表示群体中具有yy基因型的个体数；n为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：py＝(2nyy+nya1+nya2+nya3+nya4+……+nyan)/2n

式中，py表示等位基因y频率，nyy表示群体中具有yy基因型的个体数量，nyai表示群体中具有yai基因型个体数量，a1～an为等位基因y的n个互不相同的复等位基因。

2)统计结果

陕北白绒山羊样本dnmt3b基因g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率及等位基因频率如表3所示。

表3.山羊dnmt3b基因indel位点基因频率分布表

6.山羊dnmt3b基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

生产数据：陕北白绒山羊的头胎产羔数。

关联分析模型：利用spss(18.0)软件来分析品种，不同因素与产羔数性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型：yijlm＝μ+si+hysj+gl+eijlm；其中，yijlm：个体表型记录；μ：总体均值；si：产仔年限效应；hysj：山羊群体均值；gl：基因型的固定效应；eijlm：随机误差。关联分析结果如表4所示。

表4.山羊dnmt3b基因indel位点与陕北白绒山羊产羔数性状关联分析

注：平均值肩上字母不同表示差异极显著(p<0.01)

由表4可以看出，dnmt3b基因11-bpindel多态性对陕北白绒山羊产羔数有显著影响(p<0.01)，dd基因型个体性状优于ii和id基因型个体。因此，山羊dnmt3b基因11-bp插入/缺失多态性位点(nc_030820.1:g.61500477_61500478)的dd基因型可作为山羊产羔数的dna分子标记。

总之，本发明利用pcr扩增方法检测山羊dnmt3b基因11-bp插入/缺失多态性位点(nc_030820.1:g.61500477_61500478)的基因型，并将其与陕北白绒山羊的头胎产羔数进行关联分析，发现了可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测方法，为利用indel实现山羊产羔数性状的标记辅助选择(mas)提供了理论和实践依据。

<110>榆林学院

<120>一种山羊dnmt3b基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用

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<213>人工合成

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<213>nc_030820.1:g.61500477_61500478位插入序列

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