本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种基因编辑方法，尤其涉及一种基于crispr-cas13的rna编辑系统及其应用。
背景技术：
：：核糖核酸（ribonucleicacid，rna），是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，在生命过程中发挥至关重要的作用，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。表观转录组学（epitranscriptomics）是近来兴起的热门领域之一，主要研究rna所携带的化学修饰对基因表达的影响。迄今为止，在rna上已发现了一百多种化学修饰。这些修饰大量分布在非编码rna，特别是rrna，trna和snrna上，为ncrna在翻译与剪接中发挥正常功能所必需。其中m6a（n6-methyladenosine）及a-to-i（inosine）是最常见的两种rna修饰方式，这些修饰也分布在真核生物mrna上，影响mrna的代谢与功能。特别是伴随着许多mrna修饰酶（writer）、去修饰酶（eraser）和修饰识别蛋白（reader）的新发现，mrna化学修饰的可逆变化与动态调控重新激起了研究人员的兴趣，受到越来越多的关注。尽管rna修饰对于其功能有重要影响，但目前尚无有效的方法对特定基因的化学修饰进行精准调控。转录后调控对于基因表达的精准协作起到至关重要的作用，目前能够对rna进行编辑的方法主要包括：1.基于crpsr-cas系统的方法。cas9被广泛用于基因组dna的编辑，它具有dna酶的活性但不具备rna酶活性。近期有学者对cas9系统进行改进，通过引入一段短的dna寡核苷酸与目的rna序列结合，从而产生cas9发挥功能所必须的pam序列，使得cas9能够识别并作用于单链rna（1）。通过进一步优化该系统，cas9能够用于内源性mrna的示踪，抑制mrna的翻译等（2）。目前研究发现cas13主要包括cas13a，cas13b及cas13d。其中cas13a是首个发现以rna作为向导具备靶向rna酶的crispr-cas系统，它具备单链rna识别及剪切的功能。cas13d特点为分子量在四者间最小（930个氨基酸组成），便于慢病毒及腺相关病毒的包装，同时具备更显著的rna敲低效果。cas13b目前被用于进行靶向rna编辑。cox等研究者将失活的cas13b（dcas13b）与adar2融合，从而实现了活细胞内特定位点的rna编辑（3）。rauch等人将dcas13b与m6a识别蛋白（ythdf1和ythdf2）相融合从而能够研究m6a修饰对于特定转录本的影响（4）。近期xiao-minliu等基于cripsr-cas9系统开发了特定rnam6a编辑的新工具。研究者将失活的cas9（dcas9）与m6a甲基化酶及去甲基化酶分别融合，然后连同向导rna及短链dna寡核苷酸（与rna碱基互补配对结合形成pam序列）共同导入细胞内，能够实现细胞内特定位点的rnam6a编辑（5）。但该方案无法实现特定rna修饰的时空调控，crispr系统导入细胞内后会持续发生作用，这无法满足复杂生物学行为的精准调控要求。2、基于rna结合蛋白的方法。rna结合蛋白对于rna的调控及代谢至关重要，它能够通过识别rna中特定的结构域并与之结合。puf是人源pumilio1（pum1）蛋白的rna结合结构域截短体。puf蛋白以特定方式识别其rna靶点。利用puf的这种rna识别、结合功能，将其与各种功能模块融合在一起，能够发挥不同的特异性功能。近期报道的cirts（crispr-cas-inspiredrnatargetingsystem）系统，由单链rna结合蛋白orf5，hbegf，b-defensin3，rna发卡结构结合蛋白tbp，slbp及不同的效应蛋白（pin核酸酶，ythdf1，ythdf2，adar2）组成，该系统体积小，无免疫原性，可操控性强，为研究rna修饰提供了一个简便的平台（6）。现有研究报道使用crispr-cas9系统融合m6a甲基化酶或去甲基化酶能够实现对不同rna区域中的单个位点进行m6a编辑（5）；dcas13融合m6a识别蛋白能够用于解释m6a修饰对单个转录本的影响（4）；dcas13融合rna腺苷脱氨酶（adar）可以实现特定的a-to-i编辑（3）；进一步简化设计的guiderna能够引导adar实现精确的a-to-irna编辑（7）；受crispr-cas系统启发进一步优化的cirts系统提供了一个研究rna调控的平台（6）。这些方法不仅扩大了rna编辑的范围，同时大大促进了研究人员对于rna调控的理解。可是，这些系统均无法实现rna编辑的精准时空调控，而这一点对于理解rna的动态功能及与细胞表型之间关系是至关重要的。尽管rna修饰对于其功能有重要影响，但目前尚无有效的方法对特定基因的化学修饰进行精准调控。因此，研发一种能够对特定基因的化学修饰进行精准调控的系统及方法，对于rna编辑领域具有重大意义和研究价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于crispr-cas13的rna编辑系统及其应用，通过将光遗传学与rna编辑相结合，构建了基于crispr-cas系统的光控rna编辑系统，实现了rna编辑的精准时空调控，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。本发明要解决的关键问题为实现特定rna位点化学修饰的高效调控，结合光遗传学及crispr-cas13基因编辑技术，实现rna化学修饰的时间、空间双重调控。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种基于crispr-cas13的rna编辑系统，所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件；其中，所述靶向元件包含刺激响应蛋白a和失活型cas13酶（dcas13），所述编辑效应元件包括刺激响应蛋白b和rna编辑效应蛋白；所述刺激响应蛋白a与刺激响应蛋白b在刺激作用下相互结合，刺激消失后解除结合。优选地，所述刺激包括光刺激、化学刺激或磁场刺激。优选地，所述光刺激的光包括蓝光、紫外光、近红外或绿光中的任意一种。优选地，当所述刺激为光刺激时，所述刺激响应蛋白a和刺激响应蛋白b为光敏蛋白。所述光敏蛋白包括cib1（或其截短体cibn）、cry2（或其截短体cry2phr，cib1与cry2是一对刺激响应蛋白）、pmag、nmag（pmag与nmag是一对刺激响应蛋白）、lov2、phyb、pif3（phyb与pif3是一对）、bphp1、ppsr2、q-pas1（bphp1与ppsr2是一对；bphp1与q-pas1是一对）、uvr8和cop1（uvr8与cop1是一对）中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述失活型cas13酶包括dcas13a，dcas13b或dcas13d中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述失活型cas13酶为dcas13b。所述rna编辑效应蛋白包括去甲基化酶或甲基化酶中的任意一种。优选地，所述去甲基化酶包括fto或alkbh5去甲基化酶中的任意一种。优选地，所述甲基化酶包括m3m14甲基化转移酶结构域。优选地，所述向导元件包括cas13b向导rna。优选地，所述rna编辑系统为光控rna编辑系统pamec。优选地，所述光控rna编辑系统pamec包括光控rna编辑系统pamec-1和光控rna编辑系统pamec-2。优选地，所述光控rna编辑系统pamec-1包括靶向元件dcas13b-cibn、编辑效应元件cry2phr-fto和向导元件guiderna。优选地，所述光控rna编辑系统pamec-2包括靶向元件dcas13b-cibn、编辑效应元件cry2phr-m3m14甲基化转移酶结构域和向导元件guiderna。优选地，所述dcas13b-cibn的氨基酸序列为seqidno.1，如下所示：masdykddddkeasaspkkkrkveasaspkkkskveasgsgtmteqserpyngtyytledkhfwaaflnlarhnayitlthidrqlayskaditndqdvlsfkalwknfdndlerksrlrslilkhfsflegaaygkklfeskssgnkssknkeltkkekeelqanalsldnlksilfdflqklkdfanyysayrhsgsselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkidhehndevdphyhfnhlvrkgkkdryghndnpsfkhhfvdgegmvteagllffvslflekrdaiwmqkkirgfkggtetyqqmtnevfcrsrislpklkleslrmddwmlldmlnelvrcpkplydrlreddracfrvpvdilpdeddtdgggedpfkntlvrhqdrfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykamigeqpedahltrnlygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyisqtsphyhiekgkiglrfmpegqhlwpspevgttrtgrskyaqdkrltaeaflsvhelmpmmfyyfllrekyseevsaervqgrikrviedvyavydafardeintrdeldacladkgirrghlprqmiailsqehkdmeekirkklqemmadtdhrldmldrqtdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdasgkplnnskansteyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtnilsfyrsylrarkaflerigrsdrvenrpflllkepktdrqtlvagwkgefhlprgifteavrdcliemghdevasykevgfmakavplyferacedrvqpfydspfnvgnslkpkkgrflskeeraeewergkerfrdleawsysaarriedafagieyaspgnkkkieqllrdlslweafesklkvradrinlaklkkeileaqehpyhdfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldtgtlylkdirpnvqeqgslnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeeaplatvyieerdtkllkqggsgsmngaiggdlllnfpdmsvlerqrahlkylnptfdsplagffadssmitggemdsylstaglnlpmmygettvegdsrlsispettlgtgnfkkrkfdtetkdcnekkkkmtmnrddlveegeeekskiteqnngstksikkmkhkakkeennfsndsskvtkelektdyi。优选地，所述cry2phr-fto的氨基酸序列为seqidno.2，如下所示：mkmdkktivwfrrdlriednpalaaaahegsvfpvfiwcpeeegqfypgrasrwwmkqslahlsqslkalgsdltlikthntisaildcirvtgatkvvfnhlydpvslvrdhtvkeklvergisvqsyngdllyepweiycekgkpftsfnsywkkcldmsiesvmlpppwrlmpitaaaeaiwacsieelgleneaekpsnalltrawspgwsnadkllnefiekqlidyaknskkvvgnstsllspylhfgeisvrhvfqcarmkqiiwardknsegeesadlflrgiglreysryicfnfpftheqsllshlrffpwdadvdkfkawrqgrtgyplvdagmrelwatgwmhnrirvivssfavkflllpwkwgmkyfwdtlldadlecdilgwqyisgsipdgheldrldnpalqgakydpegeyirqwlpelarlptewihhpwdapltvlkasgvelgtnyakpivdidtarellakaisrtreaqimigaaahmkrtptaeerereakklrlleeledtwlpyltpkddefyqqwqlkypklilreassvseelhkevqeafltlhkhgclfrdlvriqgkdlltpvsrilignpgctykylntrlftvpwpvkgsnikhteaeiaaacetflklndylqietiqaleelaakekanedavplcmsadfprvgmgssyngqdevdiksraaynvtllnfmdpqkmpylkeepyfgmgkmavswhhdenlvdrsavavysyscegpeeeseddshlegrdpdiwhvgfkiswdietpglaiplhqgdcyfmlddlnathqhcvlagsqprfssthrvaecstgtldyilqrcqlalqnvcddvdnddvslksfepavlkqgeeihnevefewlrqfwfqgnryrkctdwwcqpmaqlealwkkmegvtnavlhevkreglpveqrneiltailasltarqnlrrewharcqsriartlpadqkpecrpywekddasmplpfdltdivselrgqlleakp。优选地，所述cry2phr-m3m14甲基化转移酶结构域的氨基酸序列为seqidno.3，如下所示：mkmdkktivwfrrdlriednpalaaaahegsvfpvfiwcpeeegqfypgrasrwwmkqslahlsqslkalgsdltlikthntisaildcirvtgatkvvfnhlydpvslvrdhtvkeklvergisvqsyngdllyepweiycekgkpftsfnsywkkcldmsiesvmlpppwrlmpitaaaeaiwacsieelgleneaekpsnalltrawspgwsnadkllnefiekqlidyaknskkvvgnstsllspylhfgeisvrhvfqcarmkqiiwardknsegeesadlflrgiglreysryicfnfpftheqsllshlrffpwdadvdkfkawrqgrtgyplvdagmrelwatgwmhnrirvivssfavkflllpwkwgmkyfwdtlldadlecdilgwqyisgsipdgheldrldnpalqgakydpegeyirqwlpelarlptewihhpwdapltvlkasgvelgtnyakpivdidtarellakaisrtreaqimigaaahgssfppqwiccdiryldvsilgkfavvmadppwdihmelpygtltddemrrlnipvlqddgflflwvtgramelgreclnlwgyervdeiiwvktnqlqriirtgrtghwlnhgkehclvgvkgnpqgfnqgldcdvivaevrstshkpdeiygmierlspgtrkielfgrphnvqpnwitlgnqldgihlldpdvvarfkqrypdgiiskpknlggsggsggshndycqhfvdtghrpqnfirdvgladrfeeypklrelirlkdeliaksntppmylqadieafdireltpkfdvilleppleeyyretgitanekcwtwddimkleideiaaprsfiflwcgsgegldlgrvclrkwgyrrcedicwiktnknnpgktktldpkavfqrtkehclmgikgtvkrstdgdfihanvdidliiteepeigniekpveifhiiehfclgrrrlhlfgrdstirpgwltvgptltnsnynaetyasyfsapnsyltgcteeierlrpkspppkrpaatkkagqakkkk。本发明中，发明人为解决特定rna的精准时空调控的难题，基于现有技术的科研进展，广泛阅读，深入研究，通过大量实验摸索验证，创造性地首次提出了光控rna编辑的概念，并构建了基于crispr-cas系统的光控rna编辑系统，首次将光遗传学与rna编辑相结合，实现了rna编辑的精准时空调控。本发明以rnam6a修饰作为示例，在哺乳动物细胞内验证了pamec系统光控rnam6a的可行性，由此推广，通过更换不同rna编辑效应元件，可以实现不同rna编辑的精准时空调控。本发明使用了cry2phr与cibn这对光敏蛋白，建立了蓝光响应的rna编辑系统，由此推广，通过更换不同的光敏蛋白，可以实现不同波长调控的rna编辑系统，如紫外、近红外、绿光等。同时，将光敏蛋白更换为化学响应或其他刺激响应的蛋白分子，该系统可以推广为不同刺激响应的rna编辑智能化系统。本发明以rnam6a修饰作为示例，在哺乳动物细胞内验证了pamec系统光控rnam6a的可行性，由此推广，通过更换不同rna编辑效应元件，可以实现不同rna编辑的精准时空调控。第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的rna编辑系统的方法，包括如下步骤：（1）构建光控rna编辑pamec系统质粒，pamec-1去除m6a，包括dcas13b-cibn，cry2phr-fto及guiderna；pamec-2写入m6a，包括dcas13b-cibn，cry2phr-m3m14mtase及guiderna。（2）以hela细胞为模型，选取malat1和tpt1为研究对象，首先hela细胞分别转染dcas13b-cibn，cry2phr-fto，malat1guiderna（质量比3：2：1），转染24小时后进行蓝光刺激（3s光照，60s黑暗，48小时），收取样品进行m6a-qpcr检测，验证pamec-1系统去除m6a的有效性；同时hela细胞分别转染dcas13b-cibn，cry2phr-m3m14mtase，tpt1guiderna，相同条件，验证pamec-2系统写入m6a的有效性。第三方面，本发明提供一种质粒，所述质粒中包含第一方面所述的rna编辑系统的元件。第四方面，本发明提供一种细胞模型，所述细胞模型中包含第三方面所述的质粒。第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物中包含第一方面所述的系统、第三方面所述的质粒或第四方面所述的细胞模型中的任意一种或至少两种的组合。第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的系统、第三方面所述的质粒、第四方面所述的细胞模型或第五方面所述的药物组合物用于制备治疗和/或预防骨科系统（如骨折、骨质疏松、骨坏死等）、神经系统（如阿尔茨海默、中风等）、心血管系统（如高血压、心绞痛、心肌梗死等）或内分泌系统（如糖尿病等）疾病的药物的应用。目前研究发现pth1r的m6a水平异常会导致骨骼发育异常，可能是导致骨质疏松的重要原因（8）；mettl3-m6a水平对于减数分裂、精子分化、心脏节律具有重要意义（9）；fto与二型糖尿病以及肥胖密切相关（9）；m6a的异常改变同时还与肝癌、血液系统肿瘤、t细胞发育、树突细胞活性及免疫系统功能密切相关（10-14）；此外，神经系统发育过程中m6a水平的精准调控对于皮层神经发生至关重要（15）。因此，pamec系统通过借助光遗传学的精准时空调控特点，能够对特定部位特定基因进行精准的rna编辑，从而对于各系统疾病具有重要潜在治疗价值。本发明的具体方案如下:本发明构建基于crispr-cas13的光控rnam6a编辑系统(photoactivatablernan6-methyladenosineeditingwithcrispr-cas13)，简称pamec。pamec系统由三部分组成（见图1），第一部分为dcas13b-cibn，dcas13b为经过人源密码子优化的失活型cas13b（来自于porphyromonasgulae），其只具备rna靶向功能，但不具备rna切割活性，因此能够作为rna靶向编辑的重要平台，本发明使用的是dpgucas13b的n端1-1015氨基酸，同时带有四个位点的酶失活突变，其中r146a与h151a突变是去除cas13b的rna切割活性，k385a与r394a突变是去除其crrna（crisprrna）加工活性；cibn为光敏蛋白cib1（来自于arabidopsisthaliana）的n端1-170氨基酸截短体，该蛋白在蓝光条件下能够与cry2（cryptochrome2，来自于arabidopsisthaliana）蛋白相结合，从而诱导蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteractions，ppi），另一方面，去除蓝光刺激，在黑暗条件下，cibn与cry2会解聚，从而实现ppi的可逆性调控。第二部分为cry2phr（cry2n端1-498氨基酸截短体）融合rna编辑效应蛋白，本发明以催化m6a的两个效应蛋白作为示例，分别组成pamec-1系统，包括cry2phr及fto，可以催化m6a去除；pamec-2系统，包括cry2phr及mettl3及mettl14的甲基化转移酶结构域，可以催化m6a写入。当然，pamec系统可以进一步推广，cry2phr可以与不同效应元件相融合，如rna乙酰化修饰相关酶，那么就能够发挥rna乙酰化修饰的光遗传学调控功能。pamec系统第三部分为编码向导crrna的元件，通过人源u6启动子表达向导rna，与靶标rna特异性结合，并通过紧随其后的cas13bdr（directrepeat）序列招募dcas13b-cibn，在黑暗条件下，由于cibn与cry2phr不发生相互作用，cry2phr-rna编辑效应元件游离于细胞内，因此虽然crrna与dcas13b结合与靶标rna，但不发生rna编辑功能，当在蓝光刺激下，cibn与cry2phr发生聚合，从而将rna编辑效应元件募集于特定rna位点，从而发挥rna编辑功能，其中pamec-1的效应元件为fto，能够实现特定rnam6a的去除，papmec-2的效应元件为m3m14甲基化酶结构域，能够实现特定rnam6a的写入（见图2）。利用pamec系统，能够实现rna编辑的精准时空调控。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明是首次提出了光控rna编辑的概念，并构建了基于crispr-cas系统的光控rna编辑系统，首次将光遗传学与rna编辑相结合，实现了rna编辑的精准时空调控；2.本发明以rnam6a修饰作为示例，在哺乳动物细胞内验证了pamec系统光控rnam6a的可行性，由此推广，通过更换不同rna编辑效应元件，可以实现不同rna编辑的精准时空调控；3.本发明使用了cry2phr与cibn这对光敏蛋白，建立了蓝光响应的rna编辑系统，由此推广，通过更换不同的光敏蛋白，可以实现不同波长调控的rna编辑系统，如紫外、近红外、绿光等；同时，将光敏蛋白更换为化学相应或其他刺激相应的蛋白分子，该系统可以推广为不同刺激响应的rna编辑智能化系统；4、本发明弥补了现有系统的不足，利用光遗传技术及crispr-cas13基因编辑技术高精确性的特点，实现rna编辑的精准时空调控。附图说明图1为本发明的pamec系统组成示意图，其中cmv为哺乳动物细胞通用启动子；polya为编码基因3’utr区通用序列；dcas13b为失活型pgucas13b；图2为pamec系统工作原理示意图；图3（a）-图3（b）为pamec系统光控rnam6a编辑结果图，其中图3（a）为m6a-qpcr检测malat1m6a水平结果图；图3（b）为m6a-qpcr检测tpt1m6a水平结果图；图4（a）-图4（c）为小鼠原代间充质干细胞中pamec系统rnam6a编辑结果图，其中图4（a）为m6a-qpcr检测pth1rm6a水平结果图；图4（b）为qpcr检测pth1rmrna表达水平结果图；图4（c）为westernblot检测pth1r蛋白表达水平结果图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例质粒构建合成人源密码子优化的cibn与dcas13b（r146a/h151a/k385a/r394a)并将二者的融合蛋白克隆进入pcdna3.1+载体，保证开放阅读框无移码与突变。合成人源mettl3甲基化酶结构域（369-580氨基酸）及mettl14甲基化酶结构域（116-402氨基酸）融合蛋白，并使用gibsonassemble的方法将该融合蛋白克隆进入pcry2phr-mcherryn1(addgene26866)，酶切位点为smai和xbai，此为pamec-2的效应元件；合成人源fto全长序列并使用上述相同策略克隆进入pcry2phr-mcherryn1，此为pamec-1的效应元件。向导rna克隆进入cas13bcrrna骨架质粒(addgene103853)，酶切位点为bbsi。细胞转染本发明分别在hela细胞及小鼠骨髓间充质干细胞中验证了pamec系统的有效性，hela细胞使用h4000试剂（engreen，china）进行转染；小鼠间充质干细胞使用电转（genepulsermxcellsystem，bio-rad），具体转染方法参考相应说明书。系统能够在哺乳动物细胞中发挥rna编辑功能本发明以人宫颈癌hela细胞作为研究模型，对其转染pamec系统，经过光照刺激后，通过merip-qpcr的方法检测rnam6a水平，merip-qpcr检测使用magnamerip™m6akit（millipore）完成，具体方法参考说明书。在hela细胞中，我们选取malat1和tpt1为研究对象，因为前期研究报道，hela细胞中malat1a2577位点m6a含量为80%，而tpt1a687位点m6a含量为15%（16），因此我们尝试使用pamec-1系统去除malat1a2577位点的m6a修饰，使用pamec-2系统增加tpt1a687位点m6a的含量。首先hela细胞分别转染dcas13b-cibn，cry2phr-fto，malat1guiderna（质量比3：2：1），转染24小时后使用自制470nm蓝光led灯板（led功率0.02mw/mm2）进行蓝光刺激（3s光照，60s黑暗，共计48小时），收取样品，使用trizol提取细胞总rna,分离、纯化mrna，然后将mrna打断成为100-200nt的片段，纯化回收mrna片段，加入m6a抗体偶联的磁珠4℃旋转过夜。第二天，洗脱磁珠吸附的mrna片段，逆转录并进行qpcr检测；向导guiderna由addgene公司提供，货号103853。结果显示：转染pamec-1系统的细胞，malat1基因a2577位点的m6a水平在光照条件下显著降低，而转染空载体的细胞在黑暗与光照条件下malat1a2577位点的m6a水平均无显著变化，这说明pamec-1系统能够发挥特异性光控rnam6a去除的功能（图3（a）：m6a-qpcr检测malat1m6a水平）；guiderna序列:seqidno.4:gctactatatttaaggccttccaaattctt；m6a-qpcr引物序列：f：seqidno.5：cgtaacggaagtaattcaag；r：seqidno.6：gtcaattaatgctagtcctc。另外一方面，hela细胞分别转染dcas13b-cibn，cry2phr-m3m14mtase，tpt1guiderna，相同蓝光条件刺激，结果显示：转染pamec-2系统的细胞，tpt1基因a687位点的m6a水平在光照条件下显著升高，同样转染空载的细胞在黑暗与光照条件下a687位点的m6a水平均无显著改变，这说明pamec-2系统能够发挥特异性光控rnam6a写入的功能（图3（b）：m6a-qpcr检测tpt1m6a水平）；guiderna序列：seqidno.7：gttaacatttttccatttctaaaccatcct；m6a-qpcr引物：f：seqidno.8：tcacctgtcatcataactggctt；r：seqidno.9：gctcaagatgacatcagtccca。综上，图3（a）-图3（b）的结果说明pamec系统是一种有效的调控特定基因位点rnam6a水平的光遗传学平台，能够有效地靶向细胞内rna，在表观转录组水平对基因进行编辑，未来可能广泛用于表观转录组学研究、rna成像以及开发rna相关疾病的治疗策略。、原代细胞有效性验证由于原代细胞与生物体内环境更为相似，因此接下来，我们在小鼠原代细胞骨髓间充质干细胞中验证pamec系统光控m6a编辑的有效性。提取小鼠骨髓间充质干细胞，然后通过电转的方法将dcas13b-cibn，cry2phr-fto，pth1rguiderna（质量比3：2：1），导入小鼠间充质干细胞中，电转使用伯乐genepulsermxcellsystem进行，具体方法参考说明书。转染48小时后进行蓝光刺激，蓝光刺激方法同上，刺激48小时后检测；结果显示：在光照条件下，pamec-1系统能有导致pth1r基因的m6a水平显著下降，但在黑暗条件下pamec-1系统对于pth1r基因的m6a水平无显著影响，这说明pamec系统发挥作用是光依赖性的，特异性较高，无显著背景活性；同时结果表明，转染空载体的细胞在黑暗与光照条件下m6a水平无显著差异，这证明光照刺激对于基因的m6a水平无显著影响（图4（a））；图4（a）：m6a-qpcr检测pth1rm6a水平结果图，guiderna序列:seqidno.10：gaggcctcctcatccagacccgagcaggag,m6a-qpcr引物序列：f：seqidno.11：tgcaggaagaatgggaaacagt，r：seqidno.12：atctgtccatctgcccatgc。同时结果表明，pth1rmrna表达量无显著改变（图4（b）），但pth1r的蛋白表达水平显著下降（图4（c）），图4（b）：qpcr检测pth1rmrna表达水平结果图，qpcr引物：f:seqidno.13:caggcgcaatgtgacaagc，r:seqidno.14:tttcccggtgccttctctttc。图4（a）-图4（c）的结果与前期报道(16)相一致，pth1r的m6a修饰会影响基因的翻译效率，pamec-1在光照条件下导致pth1rmrna3‘utr区域m6a修饰减少，导致其mrna翻译为蛋白质的过程受到抑制，因此蛋白水平表达下降，但不影响其mrna表达水平。综上所述，本发明提供一种基于crispr-cas13的rna编辑系统及其应用，通过将光遗传学与rna编辑相结合，构建了基于crispr-cas系统的光控rna编辑系统，实现了rna编辑的精准时空调控，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
：的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。参考文献1.r.batra,d.a.nelles,e.pirie,s.m.blue,r.j.marina,h.wang,i.a.chaim,j.d.thomas,n.zhang,v.nguyen,s.aigner,s.markmiller,g.xia,k.d.corbett,m.s.swanson,g.w.yeo,eliminationoftoxicmicrosatelliterepeatexpansionrnabyrna-targetingcas9.cell170,899-912e10(2017).2.d.a.nelles,m.y.fang,m.r.o'connell,j.l.xu,s.j.markmiller,j.a.doudna,g.w.yeo,programmablernatrackinginlivecellswithcrispr/cas9.cell165,488-96(2016).3.d.b.t.cox,j.s.gootenberg,o.o.abudayyeh,b.franklin,m.j.kellner,j.joung,f.zhang,rnaeditingwithcrispr-cas13.science358,1019-1027(2017).4.s.rauch,c.he,b.c.dickinson,targetedm(6)areaderproteinstostudyepitranscriptomicregulationofsinglernas.j.am.chem.soc.140,11974-11981(2018).5.x.m.liu,j.zhou,y.mao,q.ji,s.b.qian,programmablernan(6)-methyladenosineeditingbycrispr-cas9conjugates.naturechemicalbiology15,865-871(2019).6.s.rauch,e.he,m.srienc,h.zhou,z.zhang,b.c.dickinson,programmablerna-guidedrnaeffectorproteinsbuiltfromhumanparts.cell178,122-134e12(2019).7.l.qu,z.yi,s.zhu,c.wang,z.cao,z.zhou,p.yuan,y.yu,f.tian,z.liu,y.bao,y.zhao,w.wei,programmablernaeditingbyrecruitingendogenousadarusingengineeredrnas.nat.biotechnol.37,1059-1069(2019).8.n.liu,m.parisien,q.dai,g.zheng,c.he,t.pan,probingn6-methyladenosinernamodificationstatusatsinglenucleotideresolutioninmrnaandlongnoncodingrna.rna19,1848-56(2013).1.r.batra,d.a.nelles,e.pirie,s.m.blue,r.j.marina,h.wang,i.a.chaim,j.d.thomas,n.zhang,v.nguyen,s.aigner,s.markmiller,g.xia,k.d.corbett,m.s.swanson,g.w.yeo,eliminationoftoxicmicrosatelliterepeatexpansionrnabyrna-targetingcas9.cell170,899-912e10(2017).2.d.a.nelles,m.y.fang,m.r.o'connell,j.l.xu,s.j.markmiller,j.a.doudna,g.w.yeo,programmablernatrackinginlivecellswithcrispr/cas9.cell165,488-96(2016).3.d.b.t.cox,j.s.gootenberg,o.o.abudayyeh,b.franklin,m.j.kellner,j.joung,f.zhang,rnaeditingwithcrispr-cas13.science358,1019-1027(2017).4.s.rauch,c.he,b.c.dickinson,targetedm(6)areaderproteinstostudyepitranscriptomicregulationofsinglernas.j.am.chem.soc.140,11974-11981(2018).5.x.m.liu,j.zhou,y.mao,q.ji,s.b.qian,programmablernan(6)-methyladenosineeditingbycrispr-cas9conjugates.naturechemicalbiology15,865-871(2019).6.s.rauch,e.he,m.srienc,h.zhou,z.zhang,b.c.dickinson,programmablerna-guidedrnaeffectorproteinsbuiltfromhumanparts.cell178,122-134e12(2019).7.l.qu,z.yi,s.zhu,c.wang,z.cao,z.zhou,p.yuan,y.yu,f.tian,z.liu,y.bao,y.zhao,w.wei,programmablernaeditingbyrecruitingendogenousadarusingengineeredrnas.nat.biotechnol.37,1059-1069(2019).8.y.wu,l.xie,m.wang,q.xiong,y.guo,y.liang,j.li,r.sheng,p.deng,y.wang,r.zheng,y.jiang,l.ye,q.chen,x.zhou,s.lin,q.yuan,mettl3-mediatedm(6)arnamethylationregulatesthefateofbonemarrowmesenchymalstemcellsandosteoporosis.naturecommunications9,4772(2018).9.w.wei,x.ji,x.guo,s.ji,regulatoryroleofn6-methyladenosine(m6a)methylationinrnaprocessingandhumandiseases.j.cell.biochem.(2017).10.h.b.li,j.tong,s.zhu,p.j.batista,e.e.duffy,j.zhao,w.bailis,g.cao,l.kroehling,y.chen,g.wang,j.p.broughton,y.g.chen,y.kluger,m.d.simon,h.y.chang,z.yin,r.a.flavell,m(6)amrnamethylationcontrolstcellhomeostasisbytargetingtheil-7/stat5/socspathways.nature548,338-342(2017).11.m.chen,l.wei,c.t.law,f.h.tsang,j.shen,c.l.cheng,l.h.tsang,d.w.ho,d.k.chiu,j.m.lee,c.c.wong,i.o.ng,c.m.wong,rnan6-methyladenosinemethyltransferasemettl3promoteslivercancerprogressionthroughythdf2dependentpost-transcriptionalsilencingofsocs2.hepatology(2017).12.j.z.ma,f.yang,c.c.zhou,f.liu,j.h.yuan,f.wang,t.t.wang,q.g.xu,w.p.zhou,s.h.sun,mettl14suppressesthemetastaticpotentialofhepatocellularcarcinomabymodulatingn(6)-methyladenosine-dependentprimarymicrornaprocessing.hepatology65,529-543(2017).13.z.li,h.weng,r.su,x.weng,z.zuo,c.li,h.huang,s.nachtergaele,l.dong,c.hu,x.qin,l.tang,y.wang,g.m.hong,x.wang,p.chen,s.gurbuxani,s.arnovitz,y.li,s.li,j.strong,m.b.neilly,r.a.larson,x.jiang,p.zhang,j.jin,c.he,j.chen,ftoplaysanoncogenicroleinacutemyeloidleukemiaasan(6)-methyladenosinernademethylase.cancercell31,127-141(2017).14.d.han,j.liu,c.chen,l.dong,y.liu,r.chang,x.huang,j.wang,u.dougherty,m.b.bissonnette,b.shen,r.r.weichselbaum,m.m.xu,c.he,anti-tumourimmunitycontrolledthroughmrnam(6)amethylationandythdf1indendriticcells.nature566,270-274(2019).15.k.j.yoon,f.r.ringeling,c.vissers,f.jacob,m.pokrass,d.jimenez-cyrus,y.su,n.s.kim,y.zhu,l.zheng,s.kim,x.wang,l.c.dore,p.jin,s.regot,x.zhuang,s.canzar,c.he,g.l.ming,h.song,temporalcontrolofmammaliancorticalneurogenesisbym(6)amethylation.cell171,877-889e17(2017).16.n.liu,m.parisien,q.dai,g.zheng,c.he,t.pan,probingn6-methyladenosinernamodificationstatusatsinglenucleotideresolutioninmrnaandlongnoncodingrna.rna19,1848-56(2013).序列表<110>马信龙赵杰<120>一种基于crispr-cas13的rna编辑系统及其应用<130>20191018<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1231<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metalaserasptyrlysaspaspaspasplysglualaseralaser151015prolyslyslysarglysvalglualaseralaserprolyslyslys202530serlysvalglualaserglyserglythrmetthrgluglnserglu354045argprotyrasnglythrtyrtyrthrleugluasplyshisphetrp505560a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