一种诱导人间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及用于人间充质干细胞定向分化为软骨的诱导培养基。


背景技术：

2.间充质干细胞是一类可自我复制、有多分化潜能的细胞。在人体内，间充质干细胞存在于脐带、脂肪、骨髓、牙髓、胎盘等多种组织中，通过采集分离，可在体外扩增培养多个代次。在分化培养基培养下，间充质干细胞可分化成为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、皮肤等多种类型的组织细胞。因此，间充质干细胞己被广范应用于组织及器官功能损伤修复的临床研究中。例如在多项早期临床研究中，研究者使用脂肪间充质干细胞修复软骨组织，获得了良好的疗效，显示间充质干细胞具有极大的临床转化潜能。
3.目前间充质干细胞成软骨诱导培养基通常采用dmem/f12高糖培养基为基础培养基。这一技术获得的成软骨分化效率有限，分化时间长达28天，诱导的成软骨细胞数量少而且存活率较低，不能很好的满足研究、临床软骨修复的需求。为了获得足够的由间充质干细胞分化而来的软骨细胞以更好满足临床需求，需优化间充质干细胞分化培养条件，在更短时间内获得充足的软骨细胞，为临床应用间充质干细胞进行软骨损伤治疗、美容，或对间充质干细胞的生物学活性鉴定提供有利的条件。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中存在的成软骨诱导效率及特异性不够理想、诱导时间较长等问题，本发明提供一种可在19天内诱导间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法。
5.一种用于诱导人间充质干细胞成软骨分化的培养基，其特征在于：由以下组分制成包含低糖dmem 培养基(lg-dmem)、胎牛血清(fbs)5-50％体积百分比、丙酮酸钠50-100μg/ml浓度、抗坏血酸20-200μg/ml 浓度、脯氨酸10-120ng/ml浓度、地塞米松39-500ng/ml浓度、胰岛素-转铁蛋白-晒添加剂(its)0.5-1％体积百分比、转化生长因子-β3(tgf-β3)0.1-20ng/ml浓度。
6.优选由以下组分配置：lg-dmem培养基、fbs 10％体积百分比、丙酮酸钠100μg/ml浓度、抗坏血酸 50μg/ml浓度、脯氨酸40μg/ml浓度、地塞米松39ng/ml、its1％体积百分比、tgf-β3 10ng/ml浓度。
7.优选的its包含有1.0mg/ml人重组胰岛素，0.55mg/ml人转铁蛋白以及0.5μg/ml 100x浓度的亚硒酸钠。
8.优选的基础培养基中包含有一种或多种无机盐、维生素、氨基酸、抗生素等。
9.优选的所述人间充质干细胞为脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞第二代至第五代。
10.一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基的制备方法包括以下步骤：
11.1)培养瓶消毒：将培养瓶洗刷后用去离子水冲洗干净，晾干后用纸或布包好，或装在金属盒内，放置在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min后烘干备用；
12.2)dmem培养基添加：无菌条件下添加lg-dmem培养基到培养瓶中；
13.3)组分混合：加入所述浓度的fbs、丙酮酸钠母液、抗坏血酸母液、脯氨酸母液、地塞米松母液、its 母液、tgf-β3母液，混合均匀；
14.4)过滤除菌：将混合后的培养基用0.22μm的滤膜过滤除菌。
15.所述人间充质干细胞成软骨诱导分化通过以下方法：
16.1)获得干细胞：利用含10％fbs的lg-dmem培养基培养扩增人间充质干细胞；
17.2)预处理：使用胰酶消化细胞，用含10％fbs的lg-dmem培养基重悬细胞；
18.3)细胞接种：将5μl含有5
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105个细胞的细胞悬液滴加到二十四孔板上，一孔一滴；
19.4)分化培养：将细胞在培养箱中放置2小时，每孔加入1ml所述人间充质干细胞，进行成软骨分化诱导培养基培养19天。
附图说明
20.图1为人脐带间充质干细胞成软骨诱导19天后形成的软骨球切片阿利新蓝染色图
21.图2为人脂肪间充质干细胞成软骨诱导19天后形成的软骨小球阿利新蓝染色图
具体实施方式
22.下面将结合本发明具体实施例做进一步说明。
23.实例1：人脐带间充质干细胞成软骨分化
24.本专利提供的成软骨诱导培养基的配制：
25.1)将p2代的人脐带间充质干细胞按1
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105个细胞的接种密度，以5μl接种于24孔板中央培养2小时。
26.2)按照表1所示的组成和用量配制成软骨诱导培养基：
27.表1.成软骨诱导分化培养基
28.成份用量lg-dmem50mlfbs10％tgf-β310ng/mlits1％地塞米松39ng/ml抗坏血酸50μg/ml丙酮酸钠100μg/ml脯氨酸40μg/ml
29.3)2小时后加入按照表1方法配制的成软骨诱导分化培养基1ml，其后每两天更换一次新鲜成软骨诱导分化培养基，诱导19天后即可获得软骨细胞。
30.4)利用阿利新蓝染液对成软骨分化程度进行鉴定，结果如图1所示。
31.实例2：人脂肪间充质干细胞成软骨分化
32.1)将p2代的人脂肪间充质干细胞按按1
×
105个细胞的接种密度，以5μl接种于24孔板中央培养2小时。
33.2)按照表2所示的组成和用量配制成软骨诱导培养基：
34.表2.成软骨诱导分化培养基
35.成份用量lg-dmem50mlfbs10％tgf-β310ng/mlits1％地塞米松39ng/ml抗坏血酸50μg/ml丙酮酸钠100μg/ml脯氨酸40μg/ml
36.3)2小时后加入按照表2方法配制的成软骨诱导分化培养基1ml，其后每两天更换一次新鲜成软骨诱导分化培养基，诱导19天后即可获得软骨细胞。
37.4)利用阿利新蓝染液对成软骨分化程度进行鉴定，结果如图2所示。