一种巴利阿里假单胞菌及其在处理垃圾渗滤液膜浓缩液中的应用的制作方法

本发明涉及一种巴利阿里假单胞菌，还涉及上述巴利阿里假单胞菌在处理垃圾渗滤液膜浓缩液中的应用，属于污水处理领域。

背景技术：

垃圾渗滤液是一种成分复杂的高浓度有机废水，具有可生化性差、氨氮浓度高、有毒有害物质含量丰富等特征。随着环境水质管控标准的日趋严格，尤其是2009年10月，《生活垃圾填埋场渗滤液处理工程技术规范(征求意见稿)》颁布，提出了深度处理应以膜处理工艺为主，进一步确定了膜工艺的标准化趋势，作为主流工艺膜法深度处理过程会产生约15％～30％的膜浓缩液。垃圾渗滤液膜浓缩液主要成份为腐殖质类物质，呈棕黑(黄)色，cod通常在1000～5000mg/l之间，总氮浓度在500～2500mg/l，并含有大量的无机离子，tds在20000～60000mg/l之间，电导率为40000～50000us/cm，垃圾渗滤液膜浓缩液中盐度可达3％以上，废水的盐度严重影响了微生物内部渗透压，高盐度使物质吸收过程受阻，微生物生长速率缓慢，部分微生物大量死亡，严重影响该类废水的生化处理效能。

垃圾渗滤液膜浓缩液中的总氮主要来源于垃圾渗滤液生化尾水经过多级膜后的浓液。其中原水中的大部分氨氮经过硝化作用转为硝态氮，硝态氮在浓缩液总氮中的占比可达到90％以上。对于此类高盐度、高氮浓液一般作焚烧处置，但由于垃圾填埋场水量增大，废水焚烧热值低，浓液需要作废水处理，达标排放。此类废水的高盐度、高毒性，高氮，一般微生物难以处理达标，亟需适合浓缩液的生物深度脱氮方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种巴利阿里假单胞菌，该巴利阿里假单胞菌能够高效去除垃圾渗滤液膜浓缩液中的总氮含量。

本发明还要解决的技术问题是提供上述巴利阿里假单胞菌在处理垃圾渗滤液膜浓缩液中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：

本发明的巴利阿里假单胞菌，命名为巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1，分类命名为巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)，菌株号为ebt-1，其于2019年9月17日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2019730。

通过采集垃圾渗滤液处理厂的活性污泥，并采用高盐度的垃圾渗滤液膜浓缩液进行逐级驯化后，获得本发明的巴利阿里假单胞菌。

该菌株的生物学性质如下：本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1菌株来源于高盐垃圾渗滤液(盐度>3％)污水处理系统中的活性污泥，分离纯化后，在lb培养基中，35℃好氧条件下生长良好，菌落呈不规则圆形，直径大小2～5mm，白色菌落，不透明，表面有由外向内的褶皱，革兰氏染色呈阴性，显微镜观察下细胞形状为杆状。

本发明得到的菌株ebt-1，经16srrna测序，采用blast分析，将本发明得到的假单胞菌株ebt-1基因序列于ncbi中检索，其基因序列与巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)相似性高达99％以上，因此鉴定得到的菌株为巴利阿里假单胞菌。

上述巴利阿里假单胞菌在处理垃圾渗滤液膜浓缩液中的应用。

其中，将巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1接种于培养基中，于30～35℃下好氧培养24～32h，培养后得到ebt-1扩培产物，然后接种于垃圾渗滤液膜浓缩液中进行处理。

其中，巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1接种于培养基中进行培养时的接种量为3％～5％。

其中，每升培养基(水)中含有如下质量份数的组分：玉米浆(干粉)10～12.5份、酵母膏5份、磷酸氢二钾1份、氯化钠10份、无水乙酸钠2.5份以及硫酸镁0.03份。

其中，巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1用于降解垃圾渗滤液膜浓缩液中的含氮化合物，含氮化合物包括硝态氮、亚硝态氮和氨氮。

其中，巴利阿里假单胞菌降解垃圾渗滤液膜浓缩液中的含氮化合物是在厌氧/缺氧条件下进行。

其中，巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1在降解垃圾渗滤液膜浓缩液中含氮化合物时，按接种量0.2％～0.4％将菌液添加至垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧处理反应器中，反应器中废水的cod/n为4∶1～6∶1。

其中，垃圾渗滤液膜浓缩液的盐度为3％以上。

将培养所得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩大培养产物进行离心，离心后得到菌体固体。按接种量0.4％将离心固体接种至不同盐度测定配水中，在30℃，150rpm下振荡处理，跟踪不同盐度下巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对含氮化合物降解速率，得到巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1可适应7％以下(含7％)盐度范围的废水。

其中，每升盐度测定配水中含有如下质量分数的组分：葡萄糖6.1g，kno36.07g，kh2po41.5g，k2hpo4·3h2o6.0g，mgso4·7h2o1.0g以及根据所需盐度添加的nacl。

将培养所得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩大培养产物进行离心，离心后得到菌体固体。按接种量0.4％将离心固体接种至装有垃圾渗滤液膜浓缩液的缺氧瓶中，在30℃，150rpm下振荡处理，巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液的总氮去除率高达99％。

其中垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧处理反应器有效体积为2l，反应器中原始污泥浓度为60000～80000mg/l，水力停留时间为12h，外加碳源使碳氮比为4∶1，将培养所得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩大培养菌液按接种量0.2％将菌液添加至垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧处理反应器中，可显著提高反应器中污泥活力，总氮去除率由30％有效提升至98.89％，且出水水质稳定达标。从而说明将本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1添加入已有的污泥体系后，能够有效增大污泥体系的脱氮效率。

有益效果：本发明通过对垃圾渗滤液膜浓缩液的逐级驯化后，获得耐高盐的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1，该巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1能够实现对垃圾渗滤液膜浓缩液的高效生物脱氮；另外，可以有效提高已有活性污泥的脱氮速率，增强污泥脱氮效果，出水水质稳定。

附图说明

图1为实施例3中ebt-1对盐度适应性脱氮效果图；

图2为实施例4中ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液深度脱氮的效率图；

图3为垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧处理反应器结构示意图；

图4为实施例5中ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液反应器强化脱氮的效率图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1：菌株的分离与鉴定

菌株ebt-1是从垃圾焚烧厂垃圾渗滤液污水处理系统的活性污泥中筛选出的具有反硝化活力的好氧反硝化细菌。

分离筛选方法为：从垃圾渗滤液(高盐)污水处理生化系统中取出活性污泥；将5g活性污泥接种至硝态氮浓度为100mg/l的dm无机盐培养基(培养基中盐度>3％)中，在温度35℃、转速为150rpm的摇床上培养1天，得到第一菌液；按5％(体积分数)的接种量将第一菌液接种至硝态氮浓度为200mg/l的dm无机盐培养基(培养基中盐度>3％)中，在温度35℃、转速为150rpm的摇床上培养1天，得到第二菌液；按5％的接种量将第二菌液接种至硝态氮浓度为300mg/l的dm无机盐培养基中，在温度35℃、转速为150rpm的摇床上培养1天，得到第三菌液；吸取第三菌液，涂布于dm无机盐固体培养基(培养基中盐度>3％)中，于35℃下静置培养，挑选出生长速率较快的菌株；将生长速率较快的菌株于含有溴百里酚蓝的dm无机盐固体培养基(培养基中盐度>3％)上划线，于35℃下静置培养，得到平板变蓝的菌株；将筛选得到的菌株在dm无机盐固体培养基(培养基中盐度>3％)上进一步划线纯化，至挑选得到单菌落，该菌落即为本发明巴利阿里假单胞菌，菌株号为ebt-1，该菌株ebt-1能实现对高盐度的垃圾渗滤液膜浓缩液的高效生物脱氮。

菌株ebt-1的菌落特征如下：分离纯化后，在lb培养基中，35℃好氧条件下生长良好，菌落呈不规则圆形，直径大小2～5mm，白色菌落，不透明，表面有由外向内的褶皱，革兰氏染色呈阴性，显微镜观察下细胞形状为杆状。

通过pcr扩增，得到的ebt-1菌16srrna全序列如下(seqidno.1)：

经比对，其基因序列与巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)相似性高达99％以上，因此鉴定得到的菌株为巴利阿里假单胞菌。

实施例2：本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1的扩大培养：

扩大培养采用的培养基包括如下质量的组分：每升水中含玉米浆(干粉)10g、酵母膏5g、氯化钠10g、无水乙酸钠2.5g、磷酸氢二钾1g以及硫酸镁0.03g，培养基的初始ph为6.5。

培养基的制作工艺为：将玉米浆(干粉)10g、酵母膏5g、氯化钠10g、无水乙酸钠2.5g、磷酸氢二钾1g以及硫酸镁0.03g溶解于1000g水中，用碱调整其ph为6.5，于121℃下灭菌20min，得到培养基。

将巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1菌母液按接种量3％～5％(体积分数)接种于培养基中，于30～35℃下培养28～32h。

采用本发明培养基扩培后，将扩大培养得到的菌液用稀释平板法计数，得到目标有效菌量为5×10⁸～1×10⁹cfu/ml。

实施例3：本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1盐度适应性考察

将实施例2中培养得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩培液，于6000rpm下离心5min，去掉上清液，得到活化后的菌体固体。设定0％，3％，7％，，10％四个盐度梯度。每升盐度测定配水中含有如下质量分数的组分：葡萄糖6.1g，kno36.07g，kh2po41.5g，k2hpo4·3h2o6.0g，mgso4·7h2o1.0g，nacl根据所需盐度调整。将离心菌体固体按接种量0.4％接种于盐度测定配水中，于250ml蓝盖瓶中30℃下，150rpm振荡处理。

检测不同盐度条件反应过程中总氮变化，结果见图1。如图1所示，巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1脱氮速率随着盐度的增加而降低，在5％盐度以下，总氮脱除率可以达到90％以上；在7％盐度下，总氮去除率在50％以上。本专利巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1是由高盐垃圾渗滤液生化系统中污泥得到，其本身具备一定的耐盐特性，经过高效脱氮驯化筛选得到，自身有较强的耐盐、脱氮性能。

实施例4：本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液生物脱氮的效果分析。

将实施例2中培养得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩培液菌液转移到新的离心管中，于6000rpm下离心5min，去掉上清液，得到活化后的菌体固体，取干净的蓝盖瓶，往蓝盖瓶中加入200ml垃圾渗滤液膜浓缩液(盐度为3.5％)，再加入无水乙酸钠为碳源，使废液中碳氮比为4∶1，最后按接种量0.4％加入巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1，于30℃下，150rpm振荡处理。

检测反应过程中垃圾渗滤液膜浓缩液中总氮的变化，结果见图2。如图2所示，经过72h处理，垃圾渗滤液膜浓缩液中的总氮浓度由初始浓度为1110.74mg/l降至13.37mg/l，由此可知，说明本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液的总氮去除率高达99％。巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1为兼性厌氧菌，同时具有好氧反硝化特性，在缺氧环境中仍然能够有较高的反硝化功能。

实施案例5：本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液生物脱氮强化的效果分析

垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧反应器结构如图3所示。垃圾渗滤液膜浓缩液及外加碳源混合液由反应器底部进入，通过活性污泥厌氧/缺氧反应后，由反应器上部流出。反应器有效容积为2l，水力停留时间12h，污泥浓度60000mg/l～80000mg/l，外加碳源碳氮比4∶1，连续进出水，每天检测出水含氮化合物指标，计算脱氮效率，待反应器出水水质稳定后，按接种量0.2％投加实施例2中培养得到的巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1扩培液菌液至反应器污泥中，跟踪投加菌剂前后稳定出水脱氮效率。

垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧反应器投加菌剂前后稳定出水脱氮效率结果见图4。如图4所示，投加菌剂前(图4第i阶段)，垃圾渗滤液膜浓缩液厌氧/缺氧反应器进水总氮浓度为547.48mg/l，反硝化活性污泥由于受过量碳源冲击，群落结构发生变化，而导致污泥反硝化活力差，出水总氮去除率在30％～50％之间波动；投加巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1菌剂与反应器污泥充分混合后(图4第ii阶段)，其出水总氮去除率有效提高，随着适应周期的增加，总氮去除率显著增加，最终出水总氮去除率可以达到98.89％；随后提高进水总氮浓度至1000mg/l(图4第iii阶段)，系统总氮去除率仍然稳定在90％以上。巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1菌剂具备高效反硝化性能，在加入反硝化活性污泥体系后，丰富了该体系中反硝化脱氮菌群落结构，大大提高了污泥的反硝化性能。并且该菌剂能够较好的适应垃圾渗滤液膜浓缩液，在体系中生长繁殖，不易流失，进而保证出水水质稳定。

本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1对垃圾渗滤液膜浓缩液中总氮的去除效率高，能够有效解决垃圾渗滤液膜浓缩液中深度脱氮这一难题。并且将本发明巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)ebt-1添加到已有的污泥体系后，能够有效增大污泥体系的脱氮效率。

序列表

<110>南京大学

<120>一种巴利阿里假单胞菌及其在处理垃圾渗滤液膜浓缩液中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<213>巴利阿里假单胞菌(pseudomonasbalearica)

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