一种无色杆菌及其在改善花生铁营养中的应用的制作方法

本发明属于微生物学和植物促生菌领域，具体地说，涉及一种具有高产铁载体能力、改善植物铁营养的无色杆菌及其应用。

背景技术：

花生不仅是我国主要的食用油料作物之一，也是食品、油脂加工工业的重要原料和人造奶油及橄榄油的优质替代品。我国是花生生产大国，对我国国民经济发展具有重要的作用。铁是各种生物必需的元素之一，其参与生物体内重要代谢活动。植物的光合作用、呼吸作用、dna合成等生理代谢过程都需要元素铁的参与。然而土壤中的铁大多以难溶态的氧化铁形式存在，其生物有效性低，特别是在石灰性土壤上，土壤ph高导致可溶性铁含量极低，因此在石灰性土壤上生长的植物易出现缺铁黄化症状。在我国北方石灰性土壤上，花生缺铁而导致的黄化症是一个限制其产量及品质的重要因素。目前，生产上主要通过选育铁高效利用品种，喷施铁肥来改善花生缺铁黄化，但是育种周期长，喷施硫酸亚铁等铁肥的效果也不佳。近年来，利用根际有益菌促进植物养分高效吸收及利用成为一个热点方向，其中之一就包括利用根际促生菌改善植物铁营养。

在农业生产中，化肥的使用虽然提高了作物产量，但也向环境释放了大量有害物质，污染了土壤、水源及食物本身，对人类健康及生存环境构成极大威胁。因此，适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发利用替代化学肥料的新肥源成为当务之急。

缺铁环境中微生物往往处于一种铁胁迫状态，微生物在长期进化过程中形成了一套对难溶性铁的活化、吸收和运输的特殊机制,以保证可溶性铁的有效吸收,即产生铁载体。产铁载体细菌的应用不但能够减轻植物由缺铁带来的负面影响，而且可以通过直接或间接作用促进植物的生长。产铁载体细菌菌种资源的开发和应用是提高花生产量和改善花生铁营养的。现有技术中常见的产铁载体菌多为假单胞菌及芽孢杆菌，所产生的铁载体种类及促生作用相对单一。因此，探求一种新型产铁载体菌株，并具有强效促生功能的菌株，是本领域技术人员的迫切需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有高产铁载体、改善植物铁营养和促进植物生长、提高植物产量的无色杆菌及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的无色杆菌(achromobactersp.)是从花生玉米间作体系中间花生根际土壤中分离得到，命名为1604ipr-02,以下简称为1604ipr-02。经16srrna基因序列分析，该菌株1604ipr-02为无色杆菌(achromobactersp.)。该菌株已于2018年12月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为无色杆菌(achromobactersp.)，保藏号为cgmccno.16955。

1604ipr-02菌株的菌落及菌体特征为：菌落圆形，中心凸起，颜色淡黄，边缘光滑整齐，菌体呈湿润半透明状。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阴性，无芽孢。

该菌株的生理生化特征为：可液化明胶、水解淀粉、不还原硝酸盐、水解葡萄糖后不产酸、接触酶阳性、可利用柠檬酸盐。

发酵上述的无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02，得到的发酵产物也属于本发明的保护范围。

在本发明的实施例中，发酵采用的培养基为lb培养基。其组成为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；氧化钠10g；加蒸馏水定容至1000ml；琼脂15-20g；ph＝7.0，121℃灭菌20min；发酵的条件为：温度为30℃，转速为150-200rpm。

本发明提供了含有所述的无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物的菌剂。

优选地，所述菌剂为植物促生菌剂、植物侧根促生长剂或植物铁营养改善剂。

优选地，所述菌剂含有无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02的有效活菌数不小于1×10⁹cfu/ml。

本发明实验发现无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02具有高产铁载体，促进改善花生铁营养、花生增产中的作用。体现在促生菌制剂能够促进提高花生植株铁营养，促进侧根生长，提高养分吸收能力，提高植株干重及产量。

本发明提供了含有所述的无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物的生物肥料。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在促进土壤中难溶性铁转化为能够被植物有效吸收的可溶性铁中的应用。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在促进植物对土壤中铁吸收中的应用。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料产生生长素，在促进植物根系发育，促进侧根生长，增加植物根系吸收面积，促进养分吸收能力中的应用。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在提高植物干重及产量中的应用。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在高产铁载体中的应用。

本发明提供了无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02或其发酵产物或含有其菌剂或生物肥料在提高植物铁吸收转运相关基因相对表达量中的应用。

优选地，所述基因为ahfit、ahfro1(ferricreductionoxidase)、ahnramp1、ahfrdl，这些基因均为铁吸收、转运相关基因。

优选地，上述应用中，所述的植物为花生。本领域技术人员可以理解，将本发明的1604ipr-02应用于其他作物的生长，也具有上述类似的促生作用。

本发明的有益效果在于本发明从花生玉米间作体系中间作花生根际土壤中分离得到一株无色杆菌(achromobactersp.)1604ipr-02，该菌株具有高产铁载体，将土壤中难溶性的铁转化为可溶性的有效铁，增加土壤养分，实验发现该无色杆菌能够促进幼苗期、饱果期花生对土壤铁的吸收，改善花生铁营养，提高铁吸收转运相关基因相对表达量、提高花生干重及产量等多种促生功能。在应用过程中，无污染，无残留，生物环保，是一株在植物促生领域应用前景良好的促生菌株。

附图说明

图1为无色杆菌1604ipr-02的生长曲线图。

图2为无色杆菌1604ipr-02在蓝色cas平板上形成黄色晕圈图。

图3为无色杆菌1604ipr-02产生的铁载体曲线图。

图4为无色杆菌1604ipr-02的氢氧化铁溶解曲线曲线图。

图5为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生叶片活性铁浓度的影响。

图6为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生ahfit、ahfro1、ahnramp、ahfrdl基因表达的影响。

图7为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生总根长、总根面积、根平均直径、根体积的影响。

图8为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生干重的影响。

图9为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生生长的影响。

图10为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生地上部鲜重及根鲜重的影响。

图11为无色杆菌1604ipr-02对幼苗期花生新、老叶spad值的影响。

图12为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生株高的影响。

图13为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生新叶叶活性铁浓度的影响。

图14为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生新叶、功能叶及老叶spad值的影响。

图15为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳含量及蒸腾速率的影响示意图。

图16为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生新叶、老叶、茎、根及果实干重的影响。

图17为无色杆菌1604ipr-02对饱果期花生生长的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1l，将ph调至7.0。

cas检测平板：cas染液含铬天青(chromeazurals,cas)0.02515g/100ml，fecl30.0027g/100ml，十六烷基三甲基溴化铵(hdtma)0.1456g/100ml和0.1mol/l磷酸盐缓冲液ph6.8，其磷酸缓冲液每100ml含na2hpo4·2h2o2.2427g，nah2po4·2h2o0.5905g，kh2po40.075g，nh4cl0.250g，nacl0.125g，使用时对其稀释10倍。每100ml含20％蔗糖溶液1ml，10％水解酪蛋白氨基酸3ml，1mmol/lcacl2100μl，1mmol/lmgso42ml，琼脂1.8g在约60℃时缓慢加入盐溶液和cas染液各5ml，即得蓝色检测平板。121℃,15min灭菌。

蔗糖-天冬氨酸培养基(msa)：蔗糖,20g/l；天冬氨酸,2g/l；k2hpo4,1g/l；mgso4·7h2o,0.5g/l。

cas蓝色检测液的制作：

溶液a:将0.079的cas溶于50ml去离子水中,再加入10ml1mmol/l的fecl3溶液(含有10mmol/l的hci)；

溶液b:将0.069的十六烷基三甲基溴化铵(hdtma)溶于40ml的去离子水中；

溶液c:将a溶液沿着烧杯的壁缓缓加入到b溶液中,轻轻晃动,使得溶液a与溶液b混合均匀,即得到溶液c:cas蓝色检测液。

实施例1无色杆菌(achromobactersp.)筛选、分离及鉴定

1.菌株的筛选分离：

无色杆菌1604ipr-02分离于花生玉米间作体系中的间作花生根际土，土样重悬于无菌水后于cas固体培养基上培养，挑选获得具有较强产铁载体能力的菌株。经过进一步筛选、选育得到该无色杆菌，纯化后的菌命名为1604ipr-02。

2.菌株1604ipr-02的形态及生理生化特征测定

(1)菌落特征及菌体形态菌株1604ipr-02的菌落及菌体特征为：菌落圆形，中心凸起，颜色淡黄，边缘光滑整齐，菌体呈湿润半透明状。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阴性，无芽孢。

(2)菌株1604ipr-02的生理生化特征该菌株的生理生化特征为：可液化明胶、水解淀粉、不还原硝酸盐、水解葡萄糖后不产酸、接触酶阳性、可利用柠檬酸盐。

3.菌株1604ipr-0216srdna序列测定及分析

对1604ipr-02菌株16srdna序列进行pcr扩增，得到4297bp的pcr产物。将其16srdna序列(seqidno.11所示)进行blast比对，结果显示1604ipr-02与无色杆菌的多个不同株的相似性均在98％以上，结合菌株的形态、培养特征及生理生化分析结果，鉴定菌株1604ipr-02为无色杆菌(achromobactersp.)。

该菌株已于2018年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为无色杆菌(achromobactersp.)，保藏号为cgmccno.16955。

实施例2无色杆菌1604ipr-02生长曲线及产铁载体曲线测定

(1)生长曲线测定

取盛有50ml无菌lb培养液的锥形瓶12个，分别编号0，3，6，12，24，30，36，48，60，72，96，120。将无色杆菌1604ipr-02以1％接种量接种于已编号的12个锥形瓶中，于30℃下振荡培养，速度为180r/min。然后分别按对应时间将锥形瓶取出测定od值。将未接种的lb培养液倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并将不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的lb液体培养基适当稀释后测定，使其od值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数即为最终od值。以测定的时间为横坐标，od600值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。(图1)

从生长曲线可知，无色杆菌1604ipr-02接种后进入迟缓期，培养9h后进入对数生长期，于60h进入稳定期，培养96h进入衰亡期。

(2)产铁载体能力测定

将无色杆菌1604ipr-02接种于lb固体培养基上，30℃暗培养2d，沿菌落边缘，取直径为6mm菌块，接种于cas检测平板上，培养72h。由图2可见，无色杆菌1604ipr-02菌落周围出现黄色圆圈，说明该菌具有产铁载体的能力。

取盛有50ml无菌msa液体培养基的锥形瓶12个，分别编号0，3，6，12，24，30，36，48，60，72，96，120。将无色杆菌1604ipr-02以1％接种量接种于已编号的msa培养基中，于30℃下振荡培养，速度为180r/min。然后分别按对应时间将锥形瓶取出测定od值。将未接种的msa培养液倒入比色杯中，选用630nm波长分光光度计上调节零点，将未接种msa培养基与等体积cas检测液混合后作为对照，并将不同时间培养液从0h起依次进行取样并加入等体积cas检测液，对浓度大的混合液用未接种的msa培养基适当稀释后，使其od630值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的od值乘以稀释倍数即为最终od值。

铁载体产生能力计算公式为：

铁载体产生能力＝[(对照od值-培养液od值)/对照od值]×100％

以测定的时间为横坐标，铁载体产生能力为纵坐标，绘制细菌的产铁载体曲线。(图3)

菌株产铁载体曲线与细菌生长曲线较为一致，培养96h进入，120h铁载体分泌量基本达到最大，最大产铁载体单位(siderophoreunits)达33.69％。

(3)氢氧化铁溶解能力测定

将无色杆菌1604ipr-02接种于20ml的液体msa培养基中培养。24小时后,各取预培养的细菌悬浮液100μl接种于缺铁、+fecl3(10μm)和+fe(oh)3(200mg/l)的100ml液体msa培养基中,30℃下120rpm振荡培养。分别于12h、24h、48h、72h、96h吸取一定量培养基，在600nm处测定其od值,作出生长-时间响应曲线。

fe(oh)3的制备如下:将1mnaoh缓慢加入5mmfecl3溶液中,直到溶液的ph达到6.5-7。将沉淀离心,多次用去离子水洗涤,在100℃烘箱中烘干备用。

由图4可知，接种于含fecl3或fe(oh)3中的无色杆菌1604ipr-02其生长曲线几乎一致，均明显好于缺铁培养基中培养的无色杆菌1604ipr-02。说明无色杆菌1604ipr-02具有一定fe(oh)3溶解能力，能够将培养基中难溶铁转化为可溶铁。

实施例3无色杆菌1604ipr-02对花生生长及铁营养的影响

1、将本发明菌株1604ipr-02于lb液体培养基中30℃培养至10⁹cfu/ml，于高速离心机中5000rpm离心10min，倒掉上清液，加入等量灭菌的10g/lnacl蒸馏水溶液配置成菌悬液，备用。

2018年5月16日，在北京市中国农业大学资源与环境学院温室移栽花生，花生品种采用鲁花14。并于间苗后第一周开始每周按照20ml/株加入菌液，加菌处理中菌液浓度：1×10⁹cfu/ml，对照组中加入等量等浓度的灭菌盐水溶液。两组处理每个处理4盆，每盆2个生物学重复。分别于花生移栽后一个月(幼苗期)及三个月(饱果期)收样两次。饱果期收样前一周用光合仪测定花生净光合速率、气孔导度及蒸腾速率，幼苗期收样后利用根系扫根仪对花生总根长、跟平均直径、根面积、根体积进行测定，于两次收样并烘干后测定花生干重及产量。

2、叶片活性铁测定：取新鲜叶片约1g并剪碎，放入装有10mlhcl的离心管中，拧紧盖子，用振荡器震荡5小时。随后用定性滤纸过滤，收集上清液-20℃冰箱保存。用icp对浸提液进行铁元素含量测定。

3、植物基因表达测定

ⅰ.总rna提取：trizol法提取植物rna

ⅱ.反转录mrna：采用rr047a试剂盒对已提取rna进行反转录

ⅲ.实时定量pcr

1)将反转录cdna释3倍作为模板；

2)按如下反应体系，根据样品数量配制混合液，分别吸取23μl混合液，加入2μl模板，混匀；

ddh2o9.5μl；powersybergreenpcrmastermix12.5μl；5μmprimerf1μl；5μmprimerr1μl(fit、fro、nramp及frdl基因引物)；模板(反转后cdna)2μl。总共25μl。本发明选用的花生铁吸收相关基因相对定量realtimepcr引物包括ahubiquitin内参引物和针对上述4个基因的特异引物对，其核苷酸序列分别入seqidno.1-10所示。

3)使用bio-radiq5荧光定量pcr仪进行测定，反应程序为：

a.95℃10min；b.(95℃15sec60℃1min)×40；c.95℃15sec60℃1min98℃30sec。

4)完成后对pcr产物进行凝胶电泳检测，收集数据进行计算和分析。

4、结果

图5-图6数据表明，在幼苗期施用无色杆菌1604ipr-02后花生叶片活性铁浓度为21.93mg〃kg^-1fw，比加入等量等浓度盐水溶液的对照组增加了13.92％。且几种与植物体内铁吸收转运相关基因的相对表达量分别为2.11、2.74、4.82及1.98，分别提升到了1.8倍、1.8倍、9倍、2.1倍。

由图7可知，经无色杆菌1604ipr-02处理后，幼苗期花生总根长、跟平均直径、根面积、根体积分别为2.34m/株、805.83cm²/株、1.10mm/株、17.49cm³/株，分别较对照增长了221.13％、726.68％、105.86％、1244％。

从图8可以看出施用无色杆菌1604ipr-02使幼苗期花生地上部、根部干重为2.53g/株、0.23g/株，分别比对照增加了74.55％与82.99％。综合来看，无色杆菌1604ipr-02接种后，在幼苗期花生铁营养得到了显著改善，并使铁吸收转运相关基因的表达上升，且花生生长发育及根构型都得到了显著促进，见图9。

施用无色杆菌1604ipr-02后，幼苗期花生地上部鲜重及根部鲜重分别为12.84g/株、2.86g/株，比对照组增加了59.10％、74.39％。说明经无色杆菌1604ipr-02处理后，对花生生长能够起到显著促进作用。见图10。

图11可以看出，经无色杆菌处理后，幼苗期花生新、老叶spad为45.83和52.67，比对照增加了7.16％、2.93％。结果表明，无色杆菌1604ipr-02能够有效减缓幼苗期花生新叶及老叶的失绿症状。

从图12可以看出，施用无色杆菌1604ipr-02后，花生生长至饱果期后，其株高增长至39.7cm，比对照增加了31.89％。说明无色杆菌1604ipr-02能够明显促进花生生长发育。

从图13可以看出，在饱果期施用无色杆菌1604ipr-02后花生新叶活性铁浓度为17.16mg〃kg^-1fw，比对照增加了116.1％。

由图14可知，饱果期花生经无色杆菌1604ipr-02处理后，功能叶及老叶spad值为45.96与44.17，比对照分别增加了14.84％和26.93％。结果表明，无色杆菌1604ipr-02能够显著改善饱果期花生功能叶及老叶的失绿症状。

从图15中可以看出经无色杆菌1604ipr-02处理后，花生老叶净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳含量及蒸腾速率三项光合相关指标分别为8.59μmolco2〃m^-2〃s^-1、0.143μmol〃h2o〃m^-2〃s^-1、304μmol〃co2〃mol^-1和3.13mmol〃h2o〃m^-2〃s^-1，相较于对照组增加了127.14％、107.08％、8.46％与48.69％，新叶中三项指标分别为6.60μmol〃co2〃m^-2〃s^-1、0.15μmol〃h2o〃m^-2〃s^-1、312.7μmol〃co2〃mol^-1和3.25mmol〃h2o〃m^-2〃s^-1，比对照增加了112.31％、60.66％、4.58％及104.4％。

由图16得出结论，花生在接种无色杆菌1604ipr-02后其新叶、老叶、茎、根干重分别为0.44g/株、2.06g/株、1.96g/株、0.34g/株，比对照增加了62.96％、94.34％、27.27％、6.25％，同时果实干重达到了4.22g/株，相比对照增加了24.31％。综合来看，无色杆菌1604ipr-02接种后，在饱果期花生铁营养同样得到了明显改善，光合相关指标得到显著提升，且花生生长发育及果实产量都得到了显著促进(图17)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种无色杆菌及其在改善花生铁营养中的应用

<130>khp191111613.4

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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