一种多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法及其应用与流程

本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法及其应用。

背景技术：

肉类因含有丰富的蛋白质及脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素等营养成分而成为了最重要的副食品之一。然而，世界人口持续增长及发展中国家人均收入增加，推动了肉类需求快速增长。传统畜牧业的扩张会造成森林砍伐和土地退化，环境污染，影响动物福利，威胁人和动物健康等问题。培养肉是指通过培养动物干细胞，在体外分化重组为肉类组织用于食用。通过相应的加工技术，培养肉将具有和普通肉相似的口感，风味和质地。培养肉是将动物蛋白生产从动物水平发展到细胞水平，从而减少了动物本身生存所带来的资源消耗和环境污染，实现肉类高效率绿色生产。

培养肉的体外生产中最重要的技术之一就是体外生产肌肉组织。天然骨骼肌含有长而平行的肌束，肌肉束是由密集排列和高度对准的肌纤维组成。体外肌肉组织工程就是模仿体内肌肉的生长情况，在体外通过机械力的牵引或者特定的微型管道来促进肌肉细胞的定向排列形成高度对准的肌纤维。

然而，这类方法也存在着缺陷，如微型管道方法只能形成少数几层的肌管细胞，机械力的牵引也仅能使肌肉组织收缩在两个锚钉之间形成单条肌肉束。目前用于培养肉研究和生产的培养肉生产模具有圆柱体单柱型和两个锚点牵引的双柱型模具。利用单柱型模具，可以在圆柱体周围形成紧紧贴住圆柱体的肌肉束，展开后可以形成一条肌肉束。双柱型模具也会在两个柱型锚点间形成一条肌肉束。但由于氧气和其他营养成分以及废物的运输距离极限是100-200um，且一条肌肉束由于力学原因不能过长，因而限制了这两种模具获得较大的肌肉组织，如何提供一种有利于建立较大的且有利于组织营养成分和废弃物交换的培养肉组织的模具，结合改进的培养方法，培养得到较大的用于食用的肌肉组织尤为重要。

技术实现要素：

本研究发现，目前用于培养肉研究和生产的培养肉生产模具是圆柱体单柱型和两个锚点牵引的双柱型模具，这两种模具由于力学以及氧气、营养物质运输等原因，所得到的体外肌肉组织较小。由于培养肉的研究和生产需要在体外制作一块相对较大的肌肉组织作为原料肉，因而培养较大的肌肉组织成为培养肉发展的难题。为解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供一种可以设计成较大尺寸的微柱阵列的多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法。

本发明的第一个目的是提供一种多孔网状培养肉生产模具，所述模具上端开口，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；

所述外壁1的纵向截面为向下的二级阶梯状，第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。

所述第一凹槽2设置在外壁1内侧，第一凹槽主要作用是在第二凹槽加入培养肉所需的混合凝胶细胞培养液之后，第一凹槽还有较大的空间加入培养液，提供适合的培养液储存空间，保证营养的供给。第一凹槽还有利于制备本申请的模具时，从阳模中脱模，帮助模具的制作(阳模可以但不限于通过3d打印获得)。

所述第二凹槽3设置在第一凹槽2底部；第二凹槽为主要用于加入培养肉所需混合凝胶的培养区域。

所述第二凹槽3底部竖直设置若干个微柱4；所述若干个微柱4规律错位间隔排列形成微柱阵列，微柱阵列的设计考虑了后期混合凝胶培养过程中的力学变化，增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化过程。

进一步的，所述微柱4的长度为1～5mm，宽度为0.5～1.5mm，高度为1～5mm。

进一步的，微柱4所述的错位间隔排列具体为：相邻行的微柱(4)之间间隔1-3mm，相邻行的微柱(4)平行偏移1-4mm，每行中的各微柱(4)之间间隔0.5-3mm。基于微柱4的该尺寸、排列方式及间隔距离，即使扩大模具尺寸，也能够在培养肉生产过程中，结合含肌源性细胞混合凝胶形成凝胶以及凝胶压实过程中的力学变化，给予氧气和其他营养成分以及代谢废物适宜的运输距离，使凝胶能在不同柱子之间收缩形成肌肉束，微柱周围由于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化过程，从而获得较大的肌肉组织，这也是实现体外培养较大的网状培养肉组织的关键所在。

所述微柱4的行数≥2行；优选的，在以上微柱4的尺寸和排列方式范围内，根据第二凹槽3底部面积尽量多的设置微柱4。

进一步的，所述微柱4的横截面为矩形或椭圆形。

进一步的，所述模具为上端开口的长方体或者圆柱状体。

进一步的，所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧。

进一步的，所述第一凹槽2的高度为3-7mm。在该高度范围内，第一凹槽可以提供适合的培养基储存空间，且有利于制备本模具时的脱模。

进一步的，所述第一凹槽2的底部宽度为2-4mm。该宽度有利于制备本模具时的脱模。

进一步的，所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部。

进一步的，所述第二凹槽3的高度为2-6mm，即所述第二凹槽3的高度相同或略高于微柱4的高度。

进一步的，所述多孔网状培养肉生产模具可以但不限于通过3d打印得到阳模后，利用pdms浇注法制作得到，优选的，具体制作步骤如下：

(1)利用三维绘图软件设计出用于制备该多孔网状培养肉生产模具的阳模，所述的阳模的纵向截面为三阶梯结构，由下而上的第一层阶梯用于形成本发明模具的外壁1，第二层阶梯用于形成本发明模具的第一凹槽2，第三层阶梯用于形成第二凹槽3和微柱4。阳模的第二层阶梯的高度为3-7mm，所述第三层阶梯的高度为2-6mm，第三层阶梯设置若干个柱状凹槽(用于微柱4生产)，凹槽的排列方式为错位间隔排列，相邻行的凹槽平行偏移1-4mm，凹槽的长宽高为(1-5)×(0.5-1.5)×(1-5)mm，相邻行的凹槽之间间隔1-3mm，每行中的各凹槽之间间隔0.5-3mm，其余长宽尺寸可根据所需制备的多孔网状培养肉生产模具相应调整。

(2)利用3d打印机进行阳模的打印，所述的3d打印机为fdm打印机，挤出的丝材可以是pla、abs等。

(3)利用pdms浇注法浇筑阳模后，脱模得到所述多孔网状培养肉生产模具；所述pdms浇注法的操作为，道康宁sylgard184硅橡胶pdms的a液和b液的质量比为10:1混合，倒入到阳模中，经脱气和凝固后，将培养肉生产模具较为完整的取出，微柱取出时断裂的数目比例为0％-20％，微柱剩余为90％以上才能用于后续培养肉的生产。将所得的模具经清洗后121℃灭菌15min，取出后烘干备用。更优的，将灭菌后的培养肉生产模具在0.2％(质量体积比)的pluronicf-127溶液中浸泡1小时，以防止水凝胶附着在培养肉生产模具上；之后取出培养肉生产模具，用pbs清洗3遍，晾干待用。

3d打印技术是近年来发展迅速的先进制造技术，可以根据需求制造任意特定形状的结构。利用3d打印技术制备的阳模，浇筑、脱模，制造出本申请的具有较大尺寸、规律排布的微柱阵列的培养肉生产模具，将细胞和水凝胶混合溶液置于其中培养，最终获得一个多孔的网状肌肉组织，作为培养肉加工的原料肉。

该多孔网状培养肉生产模具可以在保持微柱4的尺寸和排列方式、第一凹槽2、第二凹槽3的高度在本申请限定的范围内的同时，调整模具外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3的长度、宽度，从而生产出符合未来工业生产大小的培养肉产品。

本发明的第二个目的是提供一种基于前述多孔网状培养肉生产模具的多孔网状肌肉组织生产方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将i型胶原、含酚红的dmem培养基、氢氧化钠溶液混合；所述i型胶原、含酚红的dmem培养基的体积比为50:40，添加氢氧化钠溶液将ph值调节至7.3-7.5，得到混合溶液；该配比有利于后续能形成水凝胶肌肉组织，有利于多孔网状肌肉组织的培养。

(2)将肌源性细胞与步骤(1)获得的混合溶液混合后，得到含细胞的混合溶液；

(3)将步骤(2)获得的含细胞的混合溶液加入到前述的多孔网状培养肉生产模具中进行培养，所述含细胞的混合溶液的添加量不高于所述模具的微柱4的高度，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织，之后加入生长培养基，水凝胶肌肉组织在培养1-3天之后，将生长培养基换为分化培养基，凝胶肌肉组织在分化培养基中培养，在多孔网状培养肉生产模具中进行培养5-7天后，即得多孔网状肌肉组织。

进一步的，步骤(2)所述肌源性细胞为肌肉干细胞、肌肉祖细胞、肌肉前体细胞中的一种，所述含细胞的混合溶液中，肌源性细胞的密度为1x10⁵个/ml-1x10⁷个/ml。，该细胞密度范围有利于形成水凝胶肌肉组织的强度，以及后期细胞的分化。

进一步的，步骤(1)所述i型胶原浓度为3.35-3.73mg/ml，所述的氢氧化钠溶液浓度为1m。

优选的，所述步骤(1)中，还包括向混合溶液中添加基质胶，所述基质胶与混合溶液的体积比为8:91.5，将基质胶与混合溶液混匀后，加入模具进行培养，所述基质胶可帮助网状肌肉组织分化。

所述生长培养基添加量为加满整个培养肉生产模具，生长培养基包括79vol％f-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基，1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2；

所述分化培养基添加量为加满整个培养肉生产模具，分化培养基包括97vol％dmem培养基、2vol％马血清、1vol％青霉素-链霉素双抗。

本发明所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000u/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。

基于该生产模具，结合优化的细胞密度和混合溶液配比，能够较大多孔网状肌肉组织，可用于培养肉生产的原料肉。

本发明的第三个目的是提供前述的多孔网状培养肉生产模具或前述的多孔网状肌肉组织生产方法在研究和/或生产多孔网状肌肉组织中的应用。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

本申请设计的规律排布微柱阵列的多孔网状培养肉生产模具，充分了考虑培养肉的体外培养过程中，含细胞的混合溶液形成水凝胶肌肉组织以及水凝胶肌肉组织压实过程中的力学变化，使水凝胶肌肉组织能在不同微柱之间收缩形成肌肉束，微柱周围由于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化过程。

该模具还可以在保持微柱的尺寸和排列方式、第一凹槽、第二凹槽的高度在本申请限定的范围内的同时，调整模具外壁、第一凹槽、第二凹槽的长和宽的尺寸，可进行适当扩大，并结合优化的多孔网状肌肉组织生产方法，从而实现在体外生产出较大的、符合未来工业生产大小的培养肉产品，利用鬼笔环肽(phalloidin)染色发现网状肌肉组织中也出现了较长的肌管样的结构，所得到的网状肌肉组织可以作为培养肉的原料来源。

附图说明

图1为本发明的培养肉生产模具设计的阳模的结构示意图。

图2为本发明的多孔网状培养肉生产模具的结构示意图。

图中：1外壁、2第一凹槽、3第二凹槽、4微柱。

图3网状肌肉组织在培养肉生产模具中的生长情况。

图4网状肌肉组织培养5天后，表达肌动蛋白丝f-actin(聚合开式的肌动蛋白)的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的描述中，“若干”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例1制造培养肉生产模具的阳模：

1)利用三维绘图软件构建具有规律排布柱状凹槽的阳模的三维cad模型，基于细化stl模型方法对模型进行数据处理；设计出用于制造本发明培养肉生产模具的阳模，阳模的纵向截面为三阶梯结构，由下而上的第一层阶梯用于形成本发明模具的外壁1，第二层阶梯用于形成本发明模具的第一凹槽2，第三层阶梯用于形成第二凹槽3和微柱4。阳模的第二层阶梯的高度为3-7mm，所述第三层阶梯的高度为2-6mm，第三层阶梯设置若干个柱状凹槽(用于微柱4生产)，柱状凹槽的排列方式为错位间隔排列，相邻行的柱状凹槽平行偏移1-4mm，柱状凹槽的长宽高为(1-5)×(0.5-1.5)×(1-5)mm，相邻行的柱状凹槽之间间隔1-3mm，每行中的各柱状凹槽之间间隔0.5-3mm，其余长宽尺寸可根据所需制备的多孔网状培养肉生产模具相应调整。(图1)

2)利用切片软件将得到的stl模型文件进行分层切片处理，得到打印机的运动控制gcode代码文件；

3)将gcode代码文件导入fdm打印机，在打印机上执行加工指令，挤出pla或abs等热塑性塑料丝材，逐点累积成型形成各种尺寸的用于制作培养肉生产模具的阳模结构。

实施例2利用阳模制作培养肉生产模具

称量道康宁sylgard184硅橡胶pdms的a液和b液，按质量比为10:1混合。将充分混合的pdms(聚二甲基硅氧烷)小心的倒入并装满阳模中。将pdms和阳模置于真空脱气机中，脱气的时间为1-16h。同时将pdms和阳模置于25℃凝固24h。之后用手术刀片切割pdms与阳模的接触部分，用称量勺的另一端延模具的四周撬动pdms和阳模，通过对pdms和阳模四周的挤压可以将培养肉生产模具及其规律排列的微柱较为完整的取出，柱子取出时断裂的数目比例为0％-20％，微柱剩余数目为90％以上才能用于后续培养肉的生产。取出的模具即为培养肉的生产模具。

将模具经清洗后121℃灭菌15min，取出后烘干。将灭菌后的培养肉生产模具在0.2％(质量体积比)的pluronicf-127溶液中浸泡1小时，以防止水凝胶附着在培养肉生产模具上。之后取出培养肉生产模具，用pbs清洗3遍晾干待用。

实施例3

一种多孔的网状培养肉生产模具，所述模具为上端开口的长方体，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；

所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状，由上而下的第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。

所述外壁1的长度为25mm；宽度为25mm；高度为12mm，形成上端开口的长方体。

所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧，第一凹槽2的长度为20mm；宽度为20mm；高度为5mm。所述第一凹槽2的底边宽度为2mm。

所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部；第二凹槽3的长度为16mm；宽度为16mm；高度为3mm，第二凹槽3的底部厚度为4mm。

所述第二凹槽3底部竖直设置25个微柱4；所述微柱4的长度为2mm，宽度为1mm，高度为3mm；所述微柱的横截面为矩形，25个微柱4规律排布为微柱阵列；

所述微柱4的排列方式为错位间隔排列，所述微柱阵列为7行，各行微柱分别以4个-3个-4个依次排列，相邻行的微柱4之间间隔1mm，相邻行的微柱4平行偏移1mm，每行中的各微柱4之间间隔1.5mm(图2)。

实施例4

一种多孔的网状培养肉生产模具，所述模具为上端开口的长方体，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；

所述外壁1的长度为30mm；宽度为30mm；高度为15mm，形成上端开口的长方体。

所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状，由上而下的第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。

所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧，第一凹槽2的长度为26mm；宽度为26mm；高度为6mm。所述第一凹槽2的底边宽度为4mm。

所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部；第二凹槽3的长度为18mm；宽度为18mm；高度为4mm，第二凹槽3的底部厚度为5mm。

所述第二凹槽3底部竖直设置18个微柱4；所述微柱4的长度为3mm，宽度为1.5mm，高度为4mm；所述微柱的横截面为矩形；18个微柱4规律排布为微柱阵列；

所述微柱4的排列方式为错位间隔排列，所述微柱阵列为5行，各行微柱分别以4个-3个-4个依次排列，相邻行的微柱4之间间隔1.5mm，相邻行的微柱4平行偏移2mm，每行中的各微柱4之间间隔1mm。

实施例5

一种多孔的网状培养肉生产模具，所述模具为上端开口的长方体，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；

所述外壁1的长度为20mm；宽度为20mm；高度为10mm，形成上端开口的长方体。

所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状，由上而下的第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。

所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧，第一凹槽2的长度为16mm；宽度为16mm；高度为3mm。所述第一凹槽2的底边宽度为3mm。

所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部；第二凹槽3的长度为10mm；宽度为10mm；高度为3mm，第二凹槽3的底部厚度为4mm。

所述第二凹槽3底部竖直设置18个微柱4；所述微柱4的长度为1.5mm，宽度为0.5mm，高度为2mm；所述微柱的横截面为矩形；18个微柱4规律排布为微柱阵列；

所述微柱4的排列方式为错位间隔排列，所述微柱阵列为5行，各行微柱分别以4个-3个-4个依次排列，相邻行的微柱4之间间隔1mm，相邻行的微柱4平行偏移1mm，每行中的各微柱4之间间隔0.5mm。

实施例6

除微柱4横截面为椭圆形外，本实施例模具与实施例3的模具均相同。

实施例7

一种多孔的网状培养肉生产模具，所述模具为上端开口的长方体，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；

所述外壁1的长度为100mm；宽度为100mm；高度为18mm，形成上端开口的长方体。

所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状，由上而下的第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。

所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧，第一凹槽2的长度为92mm；宽度为92mm；高度为7mm。所述第一凹槽2的底边宽度为4mm。

所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部；第二凹槽3的长度为84mm；宽度为84mm；高度为6mm，第二凹槽3的底部厚度为5mm。

所述第二凹槽3底部竖直设置250个微柱4；所述微柱4的长度为4mm，宽度为1.5mm，高度为5mm；所述微柱的横截面为矩形；250个微柱4规律排布为微柱阵列；

所述微柱4的排列方式为错位间隔排列，所述微柱阵列为20行，各行微柱分别以13个-12个-13个依次排列，相邻行的微柱4之间间隔2.5mm，相邻行的微柱4平行偏移3mm，每行中的各微柱4之间间隔2mm。

实施例8网状肌肉组织在培养肉模具中生长情况。

(1)取i型胶原(浓度为3.35-3.73mg/ml)，与含酚红的dmem培养基，1mnaoh以及基质胶混匀制成混合溶液。胶原、含酚红的dmem培养基、naoh溶液、基质胶的体积比为50:40:1.5:8，混合溶液的ph为7.3-7.5。本实施例中胶原、含酚红的dmem培养基、naoh溶液、基质胶的具体添加量分别为500ul、400ul、15ul、8ul。

(2)将成肌细胞系c2c12(来源：atcc，美国菌种保藏中心)与混合溶液一起混匀，得到含细胞的混合溶液，含细胞的混合溶液中，成肌细胞系c2c12的密度为1x10⁵个/ml-1x10⁷个/ml。

(3)将含细胞的混合溶液缓慢添加到实施例3制备的培养肉生产模具中，含细胞的混合溶液的添加量不高于所述模具的微柱4的高度，轻轻震荡，以除去气泡。

将装有混合溶液的培养肉生产模具置于37℃，5％co2培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织。之后加入2.5ml生长培养基，以加满整个培养肉生产模具。所述生长培养基为包括79vol％f-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基，1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2。水凝胶肌肉组织在培养1-3天之后，将生长培养基换液成2.5ml分化培养基，以加满整个培养肉生产模具。所述的分化培养基为包括97vol％dmem培养基、2vol％马血清、1vol％青霉素-链霉素双抗。生长5-7天后获得网状肌肉组织(图3)。

实验结果显示，通过本实施例获得的网状肌肉大小约为长12mm，宽12mm，厚度为0.1-0.3mm。单个网状肌肉的重量约为0.12-0.15g，利用鬼笔环肽(phalloidin)染色发现网状肌肉组织中也出现了较长的肌管样的结构，所得到的网状肌肉组织可以作为培养肉的原料来源。鬼笔环肽(phalloidin)染色检测实验如下：

将获得的组织用磷酸缓冲液洗1-2次。用4％(质量体积比)甲醛固定，室温15分钟。然后置于oct中使用液氮冷冻肌肉组织，然后将组织切成10um厚度的冷冻切片，用于染色。用磷酸缓冲液清洗冷冻切片3次，加入1:20体积比稀释的6.6μm的alexafluor488phalloidin(购于cellsignalingtechnology(cst))，室温孵育15min，然后用磷酸盐清洗一次。加入含有dapi的抗猝灭剂后封片。在莱卡荧光显微镜下观察拍照。能够观察到表达绿色f-actin且为形状为长的肌管状的染色判断为细胞分化形成肌管(图4)。

实施例9

除将生产模具替换为实施例7制备的培养肉生产模具，并等比例调整混合溶液、细胞和培养基用量外，其他实验方法与实施例8相同。

结果显示：通过该实施例可以获得网状肌肉的大小约为长80mm，宽80mm，厚度为0.2-0.5mm。单个网状肌肉的重量约为3.2g，利用鬼笔环肽(phalloidin)染色发现网状肌肉组织中也出现了较长的肌管样的结构，所得到的网状肌肉组织可以作为培养肉的原料来源。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。