本发明属于分子生物学和遗传育种领域，具体涉及一种获得对虾早期胚胎或幼体雌雄差异表达基因的方法。
背景技术：
性别是生命科学的重要命题之一，研究生物的性别决定与性别分化机制，有助于丰富对物种性别进化过程的认识。同时，由于许多经济动物在生长性状方面存在显著的雌雄差异，因而研究性别决定与性别分化对实现性别控制与单性化品种培育也具有重要意义。
凡纳滨对虾是我国主要的海水养殖品种，年产量高达150万吨。该品种在生长中后期，雌性生长速度显著快于雄性，因此，研究其性别决定与性别调控机制，对于实现单性化育种，提高养殖产量十分重要。由于生物的性别决定与性别分化往往起始于发育早期，所以有必要建立凡纳滨对虾发育早期的雌性与雄性转录组，发掘雌雄差异表达基因，并从中筛选性别发育相关基因。然而，因凡纳滨对虾发育早期体积极小，无法根据表型区分性别，且不能运用常规方法提取rna，所以至今未见相关研究。
在凡纳滨对虾中已获得一种性别标记(李富花，于洋，张晓军，相建海。一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的dna探针序列及获取方法，zl201510245304.9)，借助该标记可在dna水平上准确鉴定性别。若能实现凡纳滨对虾发育早期单尾个体dna与rna共提取，利用上述性别标记鉴别遗传性别后，将同性别rna混合，实现微量转录组测序，发掘雌雄差异表达基因，将大大推动凡纳滨对虾性别决定与性别分化的研究进程。
技术实现要素：
本发明针对凡纳滨对虾性别发育早期，提供一种获得其胚胎或幼体雌雄差异表达基因的新方法，这对深入研究对虾的性别决定与调控机制意义重大，同时可以为开发性别控制技术，培育单性化苗种提供重要的理论依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种获得对虾早期胚胎或幼体雌雄差异表达基因的方法，取凡纳滨对虾单个胚胎或幼体样本，进行dna与rna共提取，使用性别探针，以dna为模板扩增测序鉴定遗传性别后，将同一性别rna混合，分别构建雌性与雄性幼体rna库，利用微量转录组测序技术，获得各基因在雌雄幼体中的表达量，再通过雌雄基因表达量差异的显著性检验(p<0.01,fdr<0.05)，筛选雌雄胚胎或幼体的差异表达基因。
上述雌性与雄性胚胎或幼体rna库的构建方法具体包括：将凡纳滨对虾胚胎或幼体个体置于trizol中消化，加入氯仿混匀、静置并离心，吸取上层清液于异丙醇中用来提取rna，下层液体经乙醇沉淀用于提取dna。随后，利用已有性别探针，以dna为模板扩增测序鉴定个体遗传性别，将同性别rna混合，分别构建溞状幼体雌性与雄性rna库。
上述胚胎与幼体雌雄差异基因的筛选方法：针对分别建立的雌性与雄性rna库，利用微量转录组测序技术进行测序，根据测序数据获得各基因在雌雄个体中的表达量，通过雌雄基因表达量差异的显著性检验(p<0.01,fdr<0.05)，筛选雌雄胚胎或幼体的差异表达基因。
本发明优点在于：
本发明所提供的获得对虾早期胚胎或幼体雌雄差异表达基因的方法，首次实现对虾发育早期个体dna与rna共提取，利用遗传性别探针鉴别雌雄后，将同种性别rna混合，以满足微量转录组测序浓度要求。因生物的性别决定与性别分化一般起始于发育早期，该方法对建立对虾性别发育早期雌性与雄性转录组，研究雌雄差异表达基因，进而发掘性别决定与性别分化基因具有重要的推动作用。
具体实施方式
以凡纳滨对虾溞状幼体期为例，介绍雌雄差异基因的获得方法：
实施例1：凡纳滨对虾溞状幼体雌雄微量转录组建立与雌雄差异表达基因分析
(1)材料来源
凡纳滨对虾溞状幼体取自海南广顺泰谱海洋育种有限公司，参考凡纳滨对虾发育早期形态手册，在显微镜下确定为溞状幼体期后，挑取单尾个体放入250μl无rna酶离心管，并迅速置于液氮中。所有样品存放在-80℃备用。
(2)dna与rna共提取
rna提取：
向含有单尾个体的离心管中加入50μltrizol，反复吹打后，加入20μl氯仿，上下颠倒充分混匀，静置5min，4℃12000g离心10min；
吸取30-40μl上层液相于新的无rna酶离心管中，加等体积异丙醇，混匀，-20℃静置过夜分层，下层液相用于dna提取；
静置过夜上层液相样品4℃12000g离心10min，弃液体，加100μl体积浓度75％乙醇洗涤后，4℃12000g离心10min；
弃液体，加depc水溶解rna，保存于-80℃备用。
dna提取：
向rna提取过程中获取的下层液相中加入20μl无水乙醇，上下颠倒充分混匀，静置3min，4℃12000g离心10min；
弃液体，加100μl0.1m柠檬酸钠的体积浓度10％乙醇溶液洗涤，静置10min，4℃12000g离心10min；
弃液体，加100μl体积浓度75％乙醇洗涤，4℃12000g离心5min；
弃液体，干燥后用于pcr扩增。
(3)巢式pcr扩增
利用遗传性别探针，以引物lvsdpf：ccagacagaaatgatctcctttga与lvsdpr：agaaaagaaaagaggaaagcagga进行pcr扩增。使用天根goldeneasypcrsystem，扩增体系如下：dna模板，0.5μllvsdpf，0.5μllvsdpr，12.5μlpcrmix，9.5μl灭菌水，体系共计23ul。pcr反应程序为：94℃预变性5min，(94℃30s，55℃30s，72℃40s)共计45个循环，72℃延伸10min。
以上述扩增产物为模板，以引物lvsdpf1：cccgagggcaagtacaaatttag与lvsdpr1：atttccattcgccttccggtaat为引物进行巢式pcr扩增。使用天根goldeneasypcrsystem，扩增体系如下：2μldna模板，0.5μllvsdpf1，0.5μllvsdpr1，12.5μlpcrmix，9.5μl灭菌水，体系共计25ul。pcr反应程序为：94℃预变性5min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)共计45个循环，72℃延伸10min。
(4)pcr产物测序与snp分型
上述pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，使用天根胶回收试剂盒回收产物，以引物lvsdpr1进行一代测序，查看所得序列第120bp位置的碱基信息。结果显示48尾个体中，42尾测序成功，其中22尾在该位点为gc杂合，即为雌性，20尾为cc纯合，即为雄性。
(4)同性别个体rna混合
上述已鉴定性别的单尾个体，对应其提取rna后，将同一性别rna混合，雌性与雄性均设置三个重复f1/f2/f3与m1/m2/m3，用thermonanodrop2000分光光度计测定浓度。微量转录组测序要求rna样品浓度>20ng/μl，总量>0.1μg，六组样品浓度与总量见下表1，满足测序要求：
表1凡纳滨对虾溞状幼体rna样品浓度与总量
(5)雌雄微量cdna文库建立与测序
使用磁珠富集样品中的mrna，向mrna中加入裂解液使其断裂成为短片段，再以此为模板，使用试剂盒n712-singlecellfulllengthmrnaamplicationkit(诺唯赞，南京)建立微量cdna数据库。cdna经过qiaquickpcr试剂盒纯化、末端修复、加碱基a，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，进行pcr扩增，完成整个cna文库的制备工作。构建好的文库使用illuminahiseqtm2000测序。
(6)转录组数据处理、组装与雌雄差异表达基因分析
原始数据(rawreads)按照下述要求筛选得到高质量数据(cleanreads)：去除含接头的rawreads；去除包含多于10％未知核苷酸的rawreads；去除低质量的rawreads，随后使用软件trinity对高质量数据进行denovo组装，得到基因(unigenes)。
基因表达量使用rpkm法计算：rpkm＝(1000000*c)/(n*l/1000)。设rpkm为unigenea基因的表达量，则c为比对到unigenea基因的reads数，n为比对到所有unigenes的总reads数，l为unigenea的碱基数。最后，使用edger软件包检验雌雄组间基因表达量的差异显著性，以p<0.01，fdr<0.05作为选择标准，筛选获得雌雄差异表达基因。
通过上述分析，在凡纳滨对虾溞状幼体雌雄转录组中共获得60个雌雄差异表达基因，其中差异最显著的20个基因如表1所示，这些基因可以为对虾的性别决定和性别分化研究提供重要指导。
表2在凡纳滨对虾溞状幼体雌雄转录组中获得前20个雌雄差异表达基因