用于产生巨核细胞的组合物和方法与流程
政府支持声明
本工作得到了美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)下述资助号的资助：1r44hl131050-01、1r43ai125134-01a1和1sb1hl137591-01。政府对本发明享有某些权利。
相关申请
本申请要求2018年1月5日提交的美国临时申请序列号62/614,117的权益和优先权，通过引用其全部内容纳入本文。
本公开涉及产生巨核细胞祖细胞和巨核细胞的方法，具有巨核细胞祖细胞和巨核细胞的组合物及其用途。
背景
血小板是负责活动性出血部位血块形成和血管修复的血液细胞。生理学角度而言，血小板由称之为巨核细胞(mk)的亲本细胞在骨髓中产生，所述mk占骨髓中细胞的<0.1％。成熟的mk位于骨髓中的窦状血管(sinusoidalbloodvessel)外，并将称为前血小板(proplatelet)的长结构扩展到循环系统中。前血小板作为血小板产生的组装线，并从其末端依次释放血小板。
mk是由造血干细胞通过多步骤分化过程在骨髓中产生的。暴露于各种细胞因子、趋化因子和生长因子(包括促血小板生成素)导致造血干细胞分化成多能祖细胞，然后分化成定型的巨核细胞祖细胞，也称之为前mk。经过进一步分化，包括细胞扩大、dna含量增加、核内有丝分裂和颗粒形成，产生了成熟mk。mk将其细胞团转化成前血小板伸展(extension)以产生/释放无核血小板。
血小板计数低是多种疾病和疗法(包括癌症治疗、移植和手术)的显著后果，对于这些疾病和疗法，血小板是防止由于失控出血而导致的死亡的关键一线疗法。血小板单位(3x10^11血小板/200-400ml)完全来自人志愿者供体并且必须保存在室温下以避免不可逆的活化。然而，在该温度下，存在细菌生长的风险，这将血小板单位的保存期限限制为5天，其中2天被病原体筛选消耗并且1天被运输消耗。因此，血液中心通常没有超过1.5天的血小板库存可用于输血，这在紧急情况下会迅速耗尽。可能会出现血小板供体短缺，尤其是在关键时刻。仅民用需求的不断增加就超过供应量约20％，并且在紧急情况下库存将迅速耗尽。此外，单位和供体之间广泛的功能差异导致过度输血以确保有效的出血控制。因此，迫切需要提供血小板来源的巨核细胞，以及产生巨核细胞的新型、改进方法。
技术实现要素：
本公开提供了由干细胞产生巨核细胞祖细胞(前mk)和巨核细胞(mk)的方法。本公开进一步提供了包含前mk和mk及其裂解物的组合物，以及使用前mk、mk、其裂解物及其组合物的方法。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在低粘附或非粘附条件下并在搅拌下扩增多能干细胞，其中扩增的多能干细胞形成自聚集球状体；在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞。将多能细胞分化成造血内皮细胞是在粘附条件下于基质上进行的。在一些实施方式中，将多能细胞分化成造血内皮细胞是在低粘附或非粘附条件下进行的，以使得造血内皮细胞能够自聚集。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；和在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞，其中分化多能细胞和分化造血内皮细胞中的至少一项是在基质涂覆的三维结构上进行的。三维结构可以是微运载体或微运载体。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；和在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞，其中分化多能细胞和分化造血内皮细胞中的至少一项是在低粘附或非粘附条件下进行的，以使得造血内皮细胞能够自聚集。
在一些实施方式中，第一培养基包含骨形态发生蛋白4(bmp4)，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf)中的一种或多种。第一培养基可以包括wnt调节剂。在一些实施方式中，第二培养基包含干细胞因子(scf)、促血小板生成素(tpo)、fms相关酪氨酸激酶3配体(flt3-l)、白介素-3(il-3)、白介素-6(il-6)和肝素中的一种或多种。
在一些实施方式中，多能干细胞是人诱导型多能干细胞。
在一些实施方式中，本方法还包括在基质包被的三维结构上扩增多能干细胞的步骤。
在一些实施方式中，本方法可以还包括在第三培养基中将巨核细胞祖细胞分化成巨核细胞的步骤。第三培养基可以包含干细胞因子(scf)、促血小板生成素(tpo)、白介素-6(il-6)、白介素9(il-9)和肝素中的一种或多种。
在一些实施方式中，本公开提供了具有通过本公开的方法产生的巨核细胞祖细胞或巨核细胞祖细胞的裂解物的组合物。
在一些实施方式中，本公开提供了由本公开方法产生的巨核细胞或巨核细胞的裂解物。在一些实施方式中，这类巨核细胞为cd42b+、cd61+和dna+。
由下文描述和权利要求中能够很容易地了解本公开的其他特征和优点。
附图简要说明
本公开将在参照所提及的附图通过示例性实施方式的非限制性实例详细描述(其中类似的参照数字代表了附图的几个视图的相似部分)，并且其中：
图1显示了用于由ipsc系大规模分化巨核细胞祖细胞(前mk)、巨核细胞(mk)和血小板(plt)的总体示意图。
图2描述了2d基质依赖型系统如细胞培养板或培养瓶中多能干细胞向多核细胞的定向分化方案的示例。
图3a和图3b描述了3种示例性临床级hipsc系(在此称之为pbg1、pbg2、pbg3)的多能性。图3a描绘了在具有essential8培养基的玻连蛋白(vitronectin)基质上培养时pbg1、pbg2和pbg3ipsc形成特征生长区域的低放大倍数相衬(phasecontrast)图像。图3b描述了针对多能性因子oct4和nanog进行免疫染色并用核染料复染色的pbg1、pbg2和pbg3ipsc的更大放大倍数图像。
图4a、图4b、图4c和图4d描述了pbg1、pbg2和pbg3ipsc的培养，其经历由多能干细胞到成熟巨核细胞的定向分化的阶段。图4a描述了定向分化过程的一般时间线示意图。图4b显示了在阶段0(第0天)、阶段i(第2天和第5天)、阶段ii(第6+7天)和阶段iii(第+2和+4天)期间的pbg1培养的实际图像。图4c显示了在阶段0(第0天)、阶段i(第2天和第5天)、阶段ii(第6+7天)和阶段iii(第+2和+4天)期间的pbg2培养的实际图像。图4d显示了在阶段0(第0天)、阶段i(第2天和第5天)、阶段ii(第6+7天)和阶段iii(第+2和+4天)期间的pbg3培养的实际图像。
图5是描述在阶段i结束时pbg1、pbg2和pbg3ipsc系定向分化的平均cd31+分化效率的图。
图6a、图6b和图6c显示了在pbg1、pbg2和pbg3ipsc系定向分化第ii阶段期间产生的巨核细胞祖细胞(cd43+cd41+)的纯度和产率。图6a描述了在第6+6天由第ii阶段培养收获的悬浮细胞的代表性cd41/cd43流式细胞术数据(从左至右：pbg1、pbg2、pbg3)。图6b是显示在pbg1、pbg2和pbg3ipsc系的代表性第ii阶段分化培养期间释放到悬浮液中的cd41+cd43+(巨核细胞祖细胞)细胞的日产量测量的图。pbg1和pbg2分化培养中cd41+cd43+巨核细胞祖细胞的产生在第6+17天测量出，而pbg3分化培养中cd41+cd43+细胞的产生在第6+8天停止。图6c描述了等级hipsc系第ii阶段分化培养期间cd41+cd43+细胞的累积产量，以cd41+cd43+细胞的数量/孔显示。
图7a、图7b和图7c描述了最终产生成熟巨核细胞的定向分化方案的最终阶段——第iii阶段。图7a描述了第iii阶段培养中pbg1、pbg2和pbg3衍生的细胞随时间变化的成熟状态，通过还表达成熟巨核细胞标志物cd42b的cd41+巨核细胞谱系细胞的比例所测量。图6b和6c描述了第iii阶段第4天的分别分化自pbg1和pbg2的hipsc衍生的巨核细胞的光学显微镜图像。前血小板伸展的示例用箭头指示。
图8a、图8b、图8c、图8d和图8e描述了通过pbg1，pbg2和pbg3hipsc的分化衍生的成熟巨核细胞的表征。图8a描述了衍生自pbg1的第iii阶段细胞针对β1微管蛋白进行免疫染色，并且通过核酸染色显示细胞核(上图)。衍生自pbg1的巨核细胞也通过电子显微镜分析(下图)。图8b描述了通过pbg2hipsc的分化衍生的第iii阶段细胞。衍生自pbg2的巨核细胞针对β1微管蛋白进行免疫染色，并通过核酸染色显示细胞核(上图)。衍生自pbg2的巨核细胞也通过电子显微镜分析(下图)。图8c描述了通过pbg3hipsc的分化衍生的第iii阶段细胞。衍生自pbg3的巨核细胞针对β1微管蛋白进行免疫染色，并通过核酸染色显示细胞核(上图)。衍生自pbg3的巨核细胞不通过电子显微镜分析(下图)。图8d描述了衍生自对胞内血管假性血友病(vonwillebrand)因子染色呈阳性的pbg1、pbg2和pbg3ipsc的第iii阶段细胞的比例。图8e描述了衍生自对胞内血小板因子4染色呈阳性的pbg1、pbg2和pbg3ipsc的第iii阶段细胞的比例。
图9a、图9b和图9c描述了使用各种生长培养基在重组玻连蛋白上扩增多能pbg1细胞。图9a示出了essential8培养基中的pbg1生长。图9b示出了stemflex培养基中的pbg1生长。图9c示出了nutristemxf培养基中的pbg1生长。
图10a、图10b和图10c描述了流式细胞术数据，其评估了在多种重组培养基上使用重组玻连蛋白扩增的pbg1细胞上多能性标志物tra-1-60，ssea5和分化标志物ssea1的表达。图10a示出了来自essential8培养基中扩增的pbg1细胞的多能性标志物数据。图10b示出了来自stemflex培养基中扩增的pbg1细胞的多能性标志物数据。图10a示出了来自nutristemxf培养基中扩增的pbg1细胞的多能性标志物数据。
图11a、图11b和图11c描述了3d搅拌槽(无基质)中自聚集球状体培养中pbg1ipsc的扩增。图11a显示培养中pbg1球状体随时间变化的显微镜图像。图11b描述了pbg1球状体培养中细胞密度随时间变化的增加。图11c描述了3d培养中随时间变化的平均pbg1球状体大小。
图12a、图12b描述了流式细胞术数据，其评估了在3d搅拌槽(无基质)中自聚集球状体培养中扩增的pbg1细胞上多能性标志物tra-1-60，ssea5和分化标志物ssea1的表达。图12a显示了3d搅拌罐中单次7日扩增后pbg1细胞的多能性标志物数据。图12b显示了3d搅拌罐中连续6-7日扩增后pbg1细胞的多能性标志物数据。
图13a和图13b描述了pbg1ipsc针对多能性因子oct4和nanog进行免疫染色并用核染料复染色。图13a描述了在玻连蛋白上生长的pbg-1ipsc的2d集落的部分。图13b描述了在3d搅拌条件(不含基质)下生长的pbg-1ipsc的球状体。
图14描述了扩散(spread)自3d搅拌罐中进行4个连续6-7天扩增生长的pbg1ipsc的中期染色体扩展的核型分析，这证明了4轮3d传代后的正常核型。
图15描述了2d培养容器中胶原蛋白iv基质上pbg1ipsc至造血内皮细胞的第i阶段分化的6天内发生的形态变化。
图16a和图16b描述了pbg1衍生的细胞的代表性第i阶段分化数据。图16a描述了分化第6天时pbg1衍生的细胞的代表性流式细胞术分析。经由cd31和cd34的细胞表面表达鉴定造血内皮细胞。图16b描述了41个独立pbg1定向分化的第i阶段(第6天)分化效率的平均值和范围。
图17a、图17b和图17c描述了来自pbg1分化培养的代表性第ii阶段数据。图17a显示了在第6+6天的第ii阶段培养，背景为造血内皮细胞(he)单层，并且巨核细胞祖细胞(前mk)由单层释放到悬浮状态中。图17b显示了第ii阶段悬浮细胞的流式细胞术分析，其鉴定了cd43+造血祖细胞。图17c显示了cd43+造血细胞的流式细胞术分析，其鉴定了cd43+cd41+cd14-巨核细胞祖细胞(前mk)。在该分析中还鉴定出了污染的cd43+cd14+髓样祖细胞。
图18a和图18b描述了第ii阶段悬浮细胞的平均组成特征。图18a描述了在阶段ii的10天内释放的前mk的平均日纯度(即，cd41+cd43+cd14-活力悬浮细胞％)。图18b描述了在阶段ii的10天内污染的髓样祖细胞(即，cd43+cd14+活力悬浮细胞％)的中值，四分数位和范围。所有培养采用2d容器中的胶原蛋白iv基质上的pbg1细胞开始。数据代表41个独立分化。
图19a和图19b描述了释放的前mk的产量。图19a描述了使用pbg1ipsc起始的第ii阶段定向分化培养期间各6孔当量(即，2ml培养基，9.5cm2表面积)释放的前mk(即，活力cd41+cd43+cd14-)的平均日产量。图19b描述了使用pbg1ipsc起始的第ii阶段定向分化培养的第6+4和6+8之间各6孔当量(即，2ml培养基，9.5cm2表面积)释放的前mk(即，活力cd41+cd43+cd14-)的累积产量。各点代表2d培养容器中胶原蛋白iv基质上独立的pbg1定向分化培养。
图20a、图20b、图20c和图20d描述了第ii阶段中的mk分化和前血小板产生。图20a描述了第iii阶段第1天pbg1衍生的巨核细胞祖细胞(上图：高放大倍数；下图：低放大倍数)。图20b描述了第iii阶段第2天正在成熟的巨核细胞祖细胞(上图：高放大倍数；下图：低放大倍数)。图20c描述了第iii阶段第4天成熟巨核细胞祖细胞(上图：高放大倍数；下图：低放大倍数)。图20d显示了在第iii阶段培养4天后，来自成熟pbg1衍生的mk的自发性前血小板形成。
图21a、图21b和图21c描述了来自由pbg1ipsc起始的第iii阶段培养第3天的代表性流式细胞术分析。图21a鉴定了第iii阶段细胞的cd61+(巨核细胞)部分。图21b显示了cd61+巨核细胞的流式细胞术分析，其鉴定了cd42a+cd42b+成熟mk。在该分析中还可以鉴定出凋亡cd42a+cd42b-细胞。图21c描述了代表性第iii阶段培养的亚组分解。非mk为cd61-，未成熟mk为cd61+cd42a-cd42b-，凋亡mk为cd61+cd42a+cd42b-，而成熟mk为cd61+cd42a+cd42b+。
图22a和图22b显示了在pbg1细胞定向分化的第i阶段中使用层粘连蛋白521和胶原蛋白iv。图22a显示了在4.2ug/cm2的人胶原蛋白iv上的第i阶段分化的进程。图22b显示了在0.13ug/cm2的重组人层粘连蛋白521上的第i阶段分化的进程。
图23a、图23b和图23c描述了使用重组层粘连蛋白521以支持pbg1细胞定向分化的第ii阶段中巨核细胞祖细胞产生和释放。图23a描述了来自利用4.2ug/cm2人胶原蛋白iv的支持性基质的pbg1分化培养的第ii阶段的代表性流式细胞术数据。图23b描述了来自利用0.13ug/cm2重组人层粘连蛋白521的支持性基质的pbg1分化培养的第ii阶段的代表性流式细胞术数据。图23c描述了第ii阶段定向分化培养的第6+4和6+8之间各6孔当量(即，2ml培养基，9.5cm2表面积)释放的前mk(即，活力cd41+cd43+cd14-)的累积产量，所述第ii阶段定向分化培养使用pbg1ipsc起始，利用4.2ug/cm2人胶原蛋白iv或0.13ug/cm2人层粘连蛋白521。
图24a和图24b显示了来自mk的前血小板产生，所述mk分化自由层粘连蛋白521培养生成的前mk。用来自胶原蛋白iv培养的前mk起始的第iii阶段(第6+6+3天)培养示于图24a，而用来自层粘连蛋白521培养的前mk起始的第iii阶段(第6+6+3天)培养示于图24b。红色箭头表示前血小板示例。
图25a和图25b显示了第iii阶段(第6+6+3天)培养的流式细胞术亚组分解。图25a显示了用来自胶原蛋白iv培养的前mk起始的第iii阶段(第6+6+3天)培养的流式细胞术亚组分解。图25b显示了用来自重组层粘连蛋白521培养的前mk起始的第iii阶段(第6+6+3天)培养的流式细胞术亚组分解。非mk为cd61-，未成熟mk为cd61+cd42a-cd42b-，凋亡mk为cd61+cd42a+cd42b-，而成熟mk为cd61+cd42a+cd42b+。
图26a、图26b和图26c描述了层粘连蛋白521上第6天第i阶段培养的免疫荧光显微镜图像。图26a描述了没有wnt激动剂的对照培养。图26b描述了这样的培养，其中在第i阶段的最初48小时将0.6um的wnt激动剂chir98014添加到分化培养中。图26c描述了这样的培养，其中在第i阶段的最初48小时将6um的wnt激动剂chir99021添加到分化培养中。
图27a和图27b描述了层粘连蛋白521上第6+4天第ii阶段培养的免疫荧光显微镜图像。图27a描述了没有wnt激动剂的对照培养。图27b描述了这样的培养，其中在第i阶段的最初48小时将0.6um的wnt激动剂chir98014添加。
图28是这样的示意图，其描述了使用填充床(packedbed)生物反应器策略，3d，基质依赖型方法将pbg1定向定向分化成巨核细胞祖细胞的方案。在此处所描述的实施方式中，将由ptfe制成的层粘连蛋白521包被的raschig环用作大运载体(macrocarrier)以构成填充床。
图29描述了在第3天和第6天，层粘连蛋白521包被的rachig环上pbg-1ipsc的第i阶段分化。
图30描述了在第6+0天和第6+4天，层粘连蛋白521包被的rachig环上pbg-1ipsc的第ii阶段分化。
图31a、图31b和图31c描述了来自在rachig环底物上有效进行的pbg1分化阶段的流式细胞术数据。图31a描述了在第6天的第i阶段，并针对造血内皮细胞标志物cd31和cd34进行流式细胞术染色。图31b描述了在第6+2天的第ii阶段，并针对巨核细胞祖细胞标志物cd43和cd41进行流式细胞术染色。图31c描述了在第6+3+3天的第iii阶段，并针对cd61和cd42b进行流式细胞术染色。
图32是在搅拌槽中使用自聚集ipsc衍生的球状体的示例性3d、基质独立的定向分化方法的示意图。
图33a和图33b描述了用pbg1ipsc的自聚集球状体起始的第0阶段和第i阶段分化。图33a描述了一系列显微图，开始于第-1天的单细胞解离的pbg1细胞，在第0天的自聚集pbg1ipsc球状体，在第3天的部分分化球状体，和在第6天包含造血内皮细胞的完全分化的球状体。图33b描述了第6天的流式细胞术数据，其显示了使用该方法的成功的cd31+cd34+造血内皮细胞分化。
图34a、图34b、图34c和图34d描述了用pbg1ipsc的自聚集球状体起始的定向分化中的第ii阶段。图34a描述了在定向分化的第ii阶段期间第6+4天时的自聚集pbg1衍生的球状体，前mk由球状体释放到悬浮状态中。图34b描述了收获的悬浮细胞的流式细胞术分析，针对前mk标志物cd41和cd43进行染色。图34c描述了在阶段ii中，在2个不同的3d系统，定轨摇床上的超低粘附容器和旋转瓶中随时间变化的前mk纯度。图34d描述了在阶段ii中，在2个不同的3d系统，定轨摇床上的超低粘附容器和旋转瓶中随时间变化的前mk产率。
图35a、图35b和图35c描述了来自由pbg1ipsc的自聚焦球状体起始的3d基质依赖型培养的第iii阶段培养分化。图35a描述了来自第iii阶段培养第3天的代表性流式细胞术分析，其鉴定了第iii阶段细胞的cd61+(巨核细胞)部分，随后鉴定了cd42a+cd42b+成熟mk。在该分析中还可以鉴定出凋亡cd42a+cd42b-细胞。图35b描述了代表性第iii阶段培养的亚组分解。非mk为cd61-，未成熟mk为cd61+cd42a-cd42b-，凋亡mk为cd61+cd42a+cd42b-，而成熟mk为cd61+cd42a+cd42b+。图35c显示了第iii阶段培养中第3天的成熟mk部分的情况，在2d(基质依赖型)和3d(基质独立型)方法之间进行比较。
图36描述收获自3d自聚集球状体分化培养的成熟mk的前血小板伸展。前血小板伸展的示例用箭头指示。
图37描述了pbg1衍生的巨核细胞，其针对巨核细胞特异性蛋白β1微管蛋白进行免疫染色。同时，通过核酸染色显示细胞核。
图38a、图38b、图38c、图38d、图38e和图38f描述了pbg1衍生的巨核细胞针对α-颗粒特异性蛋白血小板因子4(pf4)、血管假性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)以及针对巨核细胞特异性细胞表面标志物cd61和核进行免疫染色。
图39a、图39b、图39c、图39d、图39e和图39f描述了pbg1衍生的巨核细胞针对致密颗粒特异性蛋白(densegranulespecificprotein)lamp1和血清素以及针对巨核细胞特异性细胞表面标志物cd61和核进行免疫染色。
图40a、图40b、图40c和图40d是显示了pbg1衍生的巨核细胞的电子显微镜图。图40a是显示出pbg1衍生的巨核细胞产生微粒的电子显微镜图像(参见箭头示例)。图40b是显示出pbg1衍生的巨核细胞和多囊泡体的电子显微镜图像(箭头；插图放大)。图40c是显示pbg1衍生的巨核细胞的电子显微镜图像，其特征在于多叶(multi-lobed)核，糖原颗粒，α-颗粒和内陷膜系统。图40d是显示pbg1衍生的巨核细胞的内质网和线粒体的电子显微镜图像。
图41a、图41b和图41c显示了pbg1定向分化成巨核细胞的过程发生的特征基因表达变化。对于所有表达分析，将多能pbg1细胞中的表达设置为1，并以相应术语表示所有其他表达值。图41a显示了了第6天细胞(第i阶段结束)、第6+4天和6+5天(第ii阶段)和第6+5+1天到6+5+4(第三阶段)多能性pbg1细胞中oct4(多能性相关基因)的相对基因表达。图41b显示了第6天细胞(第i阶段结束)、第6+4和6+5天(第ii阶段)和第6+5+1至6+5+4天(第iii阶段)多能pbg1细胞中nfe2(巨核细胞成熟的关键转录因子)的相对基因表达。在一组相关基因上进行了相似分析，并且该分析的结果总结在图41c中所示的热图中，其中oct4、sox2、nanog和zfp42基因在分化期间下调，zfpm1、nfe2、runx1、meis1和gata1基因在分化期间上调，而pbx1和myc基因保持在基本一致的水平。
图42a、图42b和图42c提供了pbg1衍生的巨核细胞的大小分布。图42a描述了pbg1衍生的巨核细胞的β1微管蛋白染色的代表性示例，其被用于收集pbg1-mk的大小测量值并与其他来源的mk进行比较。图42b描述了pbg1衍生的巨核细胞的大小分布，包括中值，四分位数和范围。图42c比较了pbg1衍生的mk与来自各种骨髓来源的巨核细胞的大小分布数据。
图43a和图43b提供了对于pbg1衍生的巨核细胞的倍性测量值。图43a描述了对pbg1衍生的巨核细胞进行的dna倍性测量的代表性示例。图43b比较了pbg1-mk的dna倍性测量值与其他来源的mk。
图44提供了通过本公开的方法和某些对照衍生的巨核细胞的hipsc-mk裂解物中各种因素的存在与否和浓度范围的比较。
图45a、图45b和图45c描述了hipsc血小板产生。图45a描述了无核和有核细胞的流式细胞术分析(上部，左侧)。有核细胞包含大量cd41+cd42+巨核细胞(上部，右侧)。使用流式细胞仪评估对cd41+、cd42+和钙黄绿素am呈阳性的无核细胞，并按大小(1-5微米)对血小板进行门选。图45b显示了通过电子显微镜评估收获自巨核细胞培养的血小板的示例。图45c是描绘本文所述定向分化方案的第iii阶段期间各孔cd41+cd42+钙黄绿素am+血小板尺寸颗粒的累积产率的图表。
虽然上述指定的附图阐述了本公开的实施方式，但是也考虑了其它实施方式，正如讨论中所提到的。本公开通过代表性而非限制性的方式提出了说明性的实施方式。本领域普通技术人员可以设计许多其它修饰和实施方式，它们落入当前公开的实施方式的原理的范围和精神。
具体实施方式
本公开涉及由干细胞诸如多能干细胞(例如，临床级人诱导型多能干细胞产生巨核细胞祖细胞(前mk)和巨核细胞(mk)的组合物和方法。该方法能够从造血内皮细胞连续生产前mk用于延长时间范围(长达8天或更长时间)，随后可以将其分化成成熟mk。通过本方法衍生的前mk和mk可以通过下述内容中的一种或多种区分：它们的大小范围，倍性概况，生物标志物表达，基因表达，颗粒组成和生长因子、细胞因子和趋化因子组成或其组合。本公开进一步提供了包含前mk和mk和它们的裂解物的组合物，以及使用前mk和mk和它们的裂解物及其组合物的方法。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的一般定义：singleton等，《微生物和分子生物学词典(dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology)》(第2版，1994)；《剑桥科学技术词典(thecambridgedictionaryofscienceandtechnology)》(walker编，1988)；《遗传学术语汇编(theglossaryofgenetics)》，第5版，r.rieger等(编)，施普林格弗莱格公司(springerverlag)(1991)；和hale和marham,《harlecollins生物学词典(theharpercollinsdictionaryofbiology)》(1991)。除非另有说明，本文所用的以下术语具有下文给出的涵义。
“试剂”意指任何小分子化合物，抗体，核酸分子或多肽或其片段。
本文所用术语“抗体”指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。术语“抗体片段”指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定可变区。
“改变”或“变化”指增加或减少。改变可以是至少1％，2％，3％，4％，5％，10％，20％，30％，或40％，50％，60％，或甚至多达70％，75％，80％，90％或100％。
“生物样品”意指源自生物体的任何组织、细胞、体液或其他材料。
“捕获试剂”意指特异性结合核酸分子或多肽以选择或分离核酸分子或多肽的试剂。
“细胞组合物”意指包含一个或多个分离细胞的任何组合物。
“细胞存活(率)”意指细胞活力。
如本文所用，“临床等级”意指使用当前良好生产规范(goodmanufacturingpractice，gmp)衍生或获得的细胞或细胞系，其允许在人类中临床使用。gmp是用于制药行业的质量保证体系，以确保最终产品符合预设规格。gmp涵盖了最终产品的制造和测试。它要求原材料的可追溯性，并且遵循经验证的标准操作程序(sop)进行生产。
“可检测水平”意指分析物的量足以使用常规用于进行这种分析的方法进行检测。
“检测”意指鉴定待检测的对象的存在、不存在或数量。
“可检测标记物”意指这样的组合物，当其与感兴趣的分子连接时，使其能够后续通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段进行检测。例如，有用的标记物包括放射性同位素，磁珠，金属珠，胶体颗粒，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，在elisa中常用的)，生物素，地高辛或半抗原。
“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何状态或病症。疾病的示例包括导致细胞数量或生物学功能降低的任何疾病或损伤，包括缺血性损伤，如中风，心肌梗塞或任何其他缺血性事件，其引起组织损伤，周围血管疾病，伤口，烧伤，骨折，钝性外伤，关节炎和炎症性疾病。
“有效量”意指产生预期效果所需的试剂的量。
“片段”意指多肽或核酸分子的部分。该部分包含(优选)至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％参照核酸分子或多肽的全长。片段可以包含10，20，30，40，50，60，70，80，90，或100，200，300，400，500，600，700，800，900，或1000个核苷酸或氨基酸。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指以不同程度不含其天然状态下通常伴随的组分的材料。“分离(isolate)”表示与原始来源或周围环境的分开(separation)程度。“纯化(purify)”表示高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物纯化的”蛋白质完全不含其他材料，从而使任何杂质均不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其他不利后果。即如果本发明的核酸或肽在通过重组dna技术产生时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学品，那么其是纯化的。通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和均一性。术语“纯化的”可以表示在电泳凝胶中基本上产生一条条带的核酸或蛋白质。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，其可以被分开纯化。
“分离的多核苷酸”意指这样的核酸(例如，dna)，其不含在衍生本公开的核酸分子的生物体的天然存在的基因组中侧接基因的基因。因此，该术语包括例如纳入载体中、纳入自主复制的质粒或病毒中、或纳入原核生物或真核生物的基因组dna中的重组dna；或作为独立于其他序列的独立分子(例如，由pcr或限制性内切酶消化产生的cdna或基因组或cdna片段)存在的重组dna。此外，该术语包括转录自dna分子的rna分子，以及作为编码其他多肽序列的杂交基因的部分的重组dna。
“分离的多肽”意指已经与天然伴随其的组分分离的本公开的多肽。通常，当多肽按重量计至少60％不含蛋白质以及与之天然相关联的天然存在的有机分子时，其是分离的。优选地，制剂是按重量计至少75％，更优选地至少90％，并且最优选地至少99％本公开的多肽。本公开所述分离的多肽可以这样获得，例如，通过由天然来源提取，通过表达编码这类多肽的重组核酸；或通过化学合成蛋白质。可以通过任何合适的方法测量纯度，例如，柱色谱法，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过hplc分析。
本文所用术语“造血内皮细胞”意指能够分化以产生造血细胞类型或内皮细胞类型的细胞，并且其可以任选地衍生自多能干细胞。造血内皮细胞通常粘附于胞外基质蛋白和/或其他造血内皮细胞，并且在一些实施方式中，可以通过表达标志物cd31和cd34来表征。
“标志物”意指在与特征或条件相关的表达水平或活性中具有改变的任何蛋白质或其他表位。
本文所用术语“巨核细胞”(mk)指具有生成前血小板和/或血小板倾向性的大的(例如，直径≥10μm)多倍体造血细胞。成熟mk的一种形态特征是大的多叶(multi-lobed)核的发育。成熟mk可以停止增殖，但是通过核内有丝分裂继续增加其dna含量，同时细胞大小也相应增加。
本文所用术语“巨核细胞祖细胞”(前mk)指单核造血细胞，其定型于巨核细胞谱系并且是成熟巨核细胞的前体。巨核细胞祖细胞通常存在于(但不限于)骨髓和其他造血位置，但是也可以由多能干细胞产生，如通过进一步分化自身源自多能干细胞的造血内皮细胞。
术语“微粒”指由巨核细胞或其他细胞脱落的非常小的(＜1微米)磷脂囊泡。微粒可能包含遗传物质如rna，并表达其亲本细胞的胞外标志物。巨核细胞和血小板衍生的微粒可能在多种途径包括止血和炎症中起作用。
术语“血小板”(plt)指直径为1-3微米无核但确实包含rna的细胞。血小板可以在其细胞表面表达cd41、cd42b和cd61。在内部，其包含α和致密颗粒，它们分别包含诸如p-选择素和血清素等因子。血小板也具有开放的小管系统，这指的是通道，该通道是将胞外材料运输到细胞中并将材料由颗粒释放到胞外环境的途径。它们主要通过参与血液凝固在止血调节中起作用，但是也被证明在炎症中起作用。
术语“预血小板”(preplatelet)指直径为3-10微米无核但确实包含rna的细胞。此外，预血小板在形态和超结构上与血小板相似，并构成通过巨核细胞产生的中间细胞阶段，所述巨核细胞通过细胞骨架重排分裂以形成单个血小板。
术语“前血小板(proplatelet)”指来自巨核细胞或刚刚由巨核细胞释放的胞质延伸。前血小板通过细胞骨架重排分裂，以形成单独的预血小板和血小板。
术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞，胚胎衍生的干细胞和诱导型多能干细胞以及具有由机体的所有三个胚层形成细胞的能力的其他干细胞，无论多能干细胞通过何种方式衍生。多能干细胞在功能上定义为可以具有一种或多种下述特征的干细胞：(a)当移植到免疫缺陷型(scid)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层的细胞类型(例如，可以分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；或(c)表达一种或多种胚胎干细胞标志物(例如，表达oct4，碱性磷酸酶，ssea-3表面抗原，ssea-4表面抗原，ssea-5表面抗原，nanog，tra-1-60，tra-1-81，sox2，rex1等)。
术语“诱导型多能干细胞”(ips细胞或ipsc)指通过表达重编程因子的组合对体细胞进行重编程而生成的一种多能干细胞。可以使用胎儿、出生后、新生儿、青年或成人体细胞生成ipsc。可以用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，oct4(有时称之为oct3/4)，sox2，c-myc和klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，oct4，sox2，nanog和lin28的组合。在某些实施方式中，至少两个、三个或四个重编程因子在体细胞中表达以重编程体细胞。
本文所用术语“预防”、“防御”、“防止”、“预防性治疗”等指降低没有患病症或病况但处于发展出病症或病况的风险或疑似发展出病症或病况的对象中发展出病症或病况的可能性。
“减少/降低”指至少10％，25％，50％，75％或100％的负变化。
“减少/降低细胞死亡”指减少/降低细胞死亡的倾向或可能性。细胞死亡可以是凋亡，坏死或通过任何其他方式。
“水平降低”指样品中分析物的量低于相应对照样品中分析物的量。
“参照/参比”指标准或对照条件。
“特异性结合”意指识别并接合本公开多肽的抗体或化合物，但是其基本上不识别和结合样品(例如，生物样品)中的其他分子，所述样品天然包括本公开的多肽。
术语“对象”或“患者：指作为处理/治疗、观测或实验客体的动物。仅作为示例，对象包括但不限于，哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物，如非人类灵长类，鼠类，牛，马，犬，绵羊或猫科动物。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”、“医治”等指降低或缓解病症或相关症状。应当理解的是，虽然不是排除性的，但治疗病症或病况不需要完全消除该病症、病况或其相关症状。
“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法所赋予其的含义并且可以表示“包含”、“包括”等；“基本上由……组成”或“由……基本组成”同样也具有美国专利法赋予其的含义并且该术语是开放式的，其允许存在比所陈述内容更多的内容，只要所陈述内容的基本或新颖的特征不会被多于所陈述内容的存在而改变，但是排除了现有技术的实施方式。
除非另外说明或由从上下文中显而易见的，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。除非另外说明或由从上下文中显而易见的，否则如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”应理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文清楚表明，如本文所使用的术语约摂应理解为本领域正常容许的范围，例如平均的标准差在2以内。约可理解为在所示值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％之内。除非本文另有明确表示，本文提供的所有数值均用术语约修饰。
本文变量的任何定义中对基团列表的引用包括该基团作为任何单一元素或列出的基团组合的定义。本文所述变量或方面的实施方式的引用包括该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式的组合或其部分。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。
巨核细胞
在人体中，巨核细胞衍生自cd34+造血干细胞，所述cd34+造血干细胞主要存在于骨髓中，但是也存在于早期发育期间的卵黄囊、胎儿肝脏和脾脏中。在mk分化期间中，mk前体经历了一段核内有丝分裂，从而使mk在没有细胞分裂的情况下通过多个dna复制周期变成多倍体，从而产生了具有多达128n个dna拷贝的多叶核(polylobulatednucleus)。随着mk大小的增加，它们还完善了其转录和蛋白质组学概况，获得了许多高度特化颗粒，包括α颗粒和致密颗粒，并开发了高度凹入性膜系统，这是mk成熟和发育的标志。
为了产生血小板，mk迁移至骨髓中的血管附近，通过这样它们将称之为前血小板的长结构延伸到循环中。前血小板作为血小板产生的组装线，并从其末端依次释放多个无核血小板。
虽然血小板主要负责活动性出血部位的血块形成，但越来越明显的是其在伤口愈合、血管新生和先天免疫中也起着重要作用。在基于干细胞的治疗领域中，血小板是理想的早期入选物(entrant)，因为它们：1)由于库存保质期短，临床需求量大；2)是无核的并且可以安全地经照射以杀灭任何污染的有核细胞，从而降低畸胎瘤形成的风险；3)对于大部分(>90％)的血小板输注，不需要hla或血液类型匹配，这将有助于大规模生产用于现成疗法的同种异体人多能干细胞(hpsc)；4)寿命短且经良好表征，这将简化计划的临床试验；5)易于移植；和6)将极大地受益于无菌生产，因为当前基于供体的血小板输注对于细菌和病毒污染固有地易感。
当前的血小板需求超过供应量约20％，并且由于人口增长和老龄化将需要更多的基于血小板的过程，减少血小板数量的新药物以及血小板输注以改善治愈时间的现有用途的扩展，预计2022年未满足的需求将增加一倍以上。在美国，血液市场实际上是寡头垄断，美国红十字会(americanredcross)和美国血液中心(america’sbloodcenters)各自控制着不到一半的市场，而hemexcel公司是第三大血液供应商。
前mk和mk以及其生长因子还有巨大的其他潜在市场。例如，前mk、mk和其裂解物可用于细胞培养、组织再生、伤口愈合、药物递送、和在化妆品工业中用于嫩肤。作为于通过本文所述方法产生的巨核细胞包含许多生长因子，它们可以是治疗组合物的来源和/或用于许多治疗目的。本公开这样解决了这些需求，其通过建立可扩展的符合当前良好生产规范(cgmp)的商业平台以制备人ipsc衍生的人巨核细胞及其产品。
在体外，mk可以合理地衍生自各种主要干细胞来源，例如多能干细胞，造血干细胞或其他干细胞类型。
在一些实施方式中，mk可衍生自多能干细胞，包括但不限于，胚胎干细胞(esc)(例如，人胚胎干细胞)和诱导型多能干细胞(ipsc)(例如，人诱导型多能干细胞)。esc是这样的多能干细胞，其源自称之为囊胚的早期植入前胚胎的内细胞团。ipsc是一类多能干细胞，其可以通过诱导特定转录因子的定时表达由成体细胞中产生。ipsc可以在培养基中无限扩增和维持并经过工程改造以产生mk。
在一些实施方式中，mk可以衍生自造血干细胞，包括但不限于，cd34+脐带血干细胞(ucb细胞)(例如，人cd34+脐带血干细胞)，cd34+动员外周血细胞(mpb)(例如，cd34+人动员外周血)或cd34+骨髓细胞。ucb细胞是衍生自血液的多能干细胞，所述血液在分娩后仍保留在胎盘和连接的脐带中。mpb细胞是源自志愿者的多能干细胞，所述志愿者的干细胞通过给予g-csf或类似试剂被移动到血流中。
在一些实施方式中，mk可以衍生自其他干细胞类型，包括但不限于，间充质干细胞(msc)(如脂肪来源间充质干细胞(admsc))或来自其他来源的间充质干。
admsc衍生自白色脂肪组织，其在胚胎发育过程中衍生自中胚层并存在于每个哺乳动物物种中，遍布全身。由于它们广泛的可用性以及分化成中胚层其他组织类型(包括骨骼、软骨、肌肉和脂肪)的能力，asc可以用于多种应用。
在本公开中，干细胞培养的维持独立于可能被异种病原体污染的动物血清和/或胚胎成纤维细胞饲养细胞(其从而增加人免疫原性反应的风险)。因此，在本发明方法中使用无血清，无饲养细胞的替代物，以避免将动物产品引入根据本发明方法衍生的前mk和mk中，以确保安全且无动物产品的条件和产品。
产生方法
图1显示了大规模分化来自一种或多种多能干细胞的巨核细胞祖细胞(前mk)、巨核细胞(mk)和血小板(plt)的总体示意图。然而，应当注意的是，虽然结合多能干细胞描述了本发明的方法，但是在各个实施方式中，多能干细胞可以被其他类型的干细胞代替或补充。
第0阶段：人诱导型多能干细胞的扩增和分化用制备物
基质依赖型扩增培养
对于基质依赖型扩增培养，通过在多能干细胞培养基中支持性基质上进行无饲养细胞培养，可以将临床级多能干细胞(psc)扩增为集落。支持性基质可以是二维表面或三维结构。在一些实施方式中，临床级人诱导型多能干细胞可以是人诱导型多能干细胞(ipsc)，如pbg1、pbg2或pbg3，但是可以使用其他类型的多能干细胞，如胚胎干细胞或其他干细胞。
在一些实施方式中，作为非限制性示例，支持性基质可以是重组玻连蛋白，重组层粘连蛋白，基质胶或前述的任何组合。在一些实施方式中，多能干细胞培养基可以是，例如但不限于，essential8培养基(赛默飞世尔公司(thermofisher))，stemflex培养基(赛默飞世尔公司)，nutristem培养基(生物工业公司(biologicalindustries))或本领域已知能够支持多能细胞维持和生长的其他培养基。在一些实施方式中，可以培养细胞以达到融合。在一些实施方式中，可以培养细胞以达到30％至90％融合度。在一些实施方式中，培养细胞以达到最高60％，最高65％，最高70％，最高75％融合度。例如，培养细胞以达到约70％融合度。在达到预定最大百分比融合度后，收获细胞。在一些实施方式中，通过使用0.1mm至5mmedta或相似的螯合剂或试剂进行解离可以团块收获细胞。例如，可以使用约0.5mmedta收获细胞。在一些实施方式中，可以单细胞收获细胞，例如，通过与蛋白水解酶、胶原蛋白水解酶或其组合解离。例如，通过与例如重组胰蛋白酶如trypletm或accutasetm解离可以单细胞收获细胞。为了维持/扩增psc，可以将收获的细胞重悬于多能干细胞培养基中。
基质独立型3d扩增培养
对于基质独立型3d扩展培养，可将临床级psc扩增为自聚集球状体。在一些实施方式中，这可以通过以约0.1至约1.5百万/ml的密度接种单细胞来实现。例如，在一些实施方式中，可以0.5百万/ml接种单细胞。
在多能干细胞培养基中，在低粘附或非粘附条件下，通过缓慢搅拌或轻轻摇动，可使细胞经历连续运动。在一些实施方式中，可以使用无饲养细胞无血清培养基。多能干细胞培养基可以是，例如但不限于，essential8培养基(赛默飞世尔公司(thermofisher))，stemflex培养基(赛默飞世尔公司)，nutristem培养基(生物工业公司(biologicalindustries))或本领域已知能够支持多能细胞维持和生长的其他相似的培养基。在一些实施方式中，培养psc球状体约5-7天，直至达到约3百万至约1千万个细胞/ml的总细胞密度和/或实现约150至约350μm的中值球状体大小。在一些实施方式中，培养psc球状体，直至达到5百万个细胞/ml的总细胞密度。在一些实施方式中，培养psc球状体，直至实现约250μm的中值球状体大小。培养步骤可以持续4、5、6、7或8天。在适用时，可以单细胞形式收获psc，例如，通过用蛋白水解酶、胶原蛋白水解酶或其组合解离。例如，通过适用但不限于胰蛋白酶，重组胰蛋白酶如trypletm，accutasetm或本领域已知的相似试剂解离可以单细胞收获细胞。在一些实施方式中，采用单细胞来起始另一3d扩增培养和/或定向分化培养。
分化的准备
在一些实施方式中，为了制备用于分化，可以通过部分解离来自基质依赖型2d培养的psc集落，通过部分解离来自基质独立型3d培养的psc球状体，或者通过使由本领域已知的任何方法生成的单psc自聚集，来生成psc聚集物。在一些实施方式中，在分化开始之前，可以将这些聚集物重悬并培养于多能干细胞培养基中，例如但不限于，essential8培养基(赛默飞世尔公司)，stemflex培养基(赛默飞世尔公司)或nutristem培养基(生物产业公司)。在一些实施方式中，培养基可包括rock抑制剂，例如但不限于，y27632，h1152或其组合。在一些实施方式中，在开始分化之前，细胞可以37℃、5％co2、20％o2培养0-72小时。
对于基质依赖型培养，可以允许聚集物附连于表面。在一些实施方式中，虽然可以使用1小时至24小时之间的任何时间或更长时间，但是可以允许附连步骤进行约24小时。在一些实施方式中，可以用胶原蛋白\层粘连蛋白或任何其他胞外基质蛋白预先包被表面。在一些实施方式中，人胶原蛋白iv可用于包被表面。在一些实施方式中，基质包被的表面可以是2d的(例如，塑料皿或培养瓶的底部)。在一些实施方式中，基质包被的表面可以是3d的(例如，光滑或网状的球形微运载体、大运载体，例如劳奇环(rauchigring))。然后可以在连续运动或不连续运动的情况下培养3d基质包被的表面上的细胞。例如，可以在超低粘附静态条件下，在转瓶、旋转瓶、搅拌罐生物反应器、立式轮式生物反应器、填充床生物反应器或流化床系统中培养细胞。
对于基质独立型培养，通过在低粘附容器中缓慢搅拌或轻轻摇动可以使聚集物经历连续运动。在0至72小时之后，例如约24小时之后，细胞可以过渡到分化第i阶段。
第i阶段.造血内皮细胞的生成
在第i阶段中，可以将制备的psc分化成造血内皮细胞。简言之，去除多能干细胞培养基，并用第i阶段分化培养基代替。在一些实施方式中，第i阶段分化培养基可以是不含动物组分的培养基(acf)，其包含stemspantm-acf(干细胞科技公司(stemcelltechnologies)，目录号09855)作为基础培养基，补充有一种或多种生长因子，包括例如，骨形态发生蛋白4(bmp4)，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf)。在一些实施方式中，基础培养基补充有1-200ng/ml的bmp4(例如，50ng/ml)、bfgf(例如，50ng/ml)和vegf(例如，50ng/ml)中的一种或多种。细胞可以在低氧条件下孵育2-6天(例如，37℃，5％co2，5％o2)，然后在常氧下孵育2-6天(37℃，5％co2，20％o2)。在一些实施方式中，对于分化的初始阶段，可以添加wnt调节剂，例如，wnt激动剂或拮抗剂。在一些实施方式中，对于分化的初始阶段，可以添加gsk3抑制剂。在一些实施方式中，对于分化的初始阶段，例如在1-2天，可以添加gsk3抑制剂或wnt激动剂，例如chir9998014，chir99021或其组合。在一些实施方式中，对于第i阶段的至少部分，wnt调节剂可以替代一个或多个生长因子。例如，在一些实施方式中，当存在wnt调节剂时，可以在最初的48小时添加bmp4，并且在剩余的第i阶段可以是可有可无的。在一些实施方式中，当存在wnt调节剂时，对于最初的48小时，vegf和bfgf可以是可有可无的。在一些实施方式中，在整个第i阶段期间可以通过去除使用过的培养基并用新鲜第i阶段培养基替代来进行每日完全培养基交换。在一些实施方式中，可以进行部分培养基交换，将10-95％使用过的培养基去除并用等体积的新鲜第i阶段培养基替代。在一些实施方式中，可以添加额外体积的新鲜培养基，其具有增加培养物总体积的净效果。在一些实施方式中，作为替代新鲜第i阶段培养基或添加新鲜第一阶段培养基的替代，在培养物中掺入特定的培养基组分。
在2d依赖型基质培养中，到第2天时，集落的形态改变为分散的细长细胞簇(图15)。到第5-6天时，观察到了造血内皮细胞的融合粘附层，在粘附细胞层内具有一些三维结构(图15)。在基质独立型3d培养中，随着第i阶段的进行，球状体变得更大、更暗并且不均匀(图33a)。第i阶段分化开始后大约6天，向造血内皮细胞的分化完成。在一些实施方式中，当观察到造血内皮细胞的汇合粘附层具有在粘附细胞层内的某些三维结构时，可以认为其分化完成(图4)。为了确认进行了成功的第i阶段分化，可以采用蛋白水解酶，胶原蛋白水解酶或其组合，诸如
第ii阶段.由造血内皮细胞生成脱离的巨核细胞祖细胞(前mk)
在一些实施方式中，在第i阶段的4至8天后，可以进行巨核细胞祖细胞(第ii阶段)分化的起始。简言之，去除第i阶段培养基，并用等体积的第ii阶段培养基代替，例如，stemdifftmapeltm2基础培养基(干细胞科技公司，目录号05275)。这类第ii阶段培养基可以补充有1和200ng/ml下述一种或多种物质中的任一种：干细胞因子(scf)(例如，25ng/ml)，促血小板生成素(tpo)(例如25ng/ml)，fms相关酪氨酸激酶3配体(flt3-l)(例如，25ng/ml)，白介素-3(il-3)(例如，10ng/ml)，白介素-6(il-6)(例如，10ng/ml)和肝素(例如，5单位/ml)。在一些实施方式中，第ii阶段培养基可以进一步补充有um171，um729，sr-1，su6656或其任何组合。
然后将细胞在37°℃、5％co2、20％o2下孵育至少7天和多达12天或更多天，。例如，可以将细胞孵育7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17天。在一些实施方式中，可以进行每日部分培养基交换，将10-95％使用过的培养基去除并用等体积的新鲜第ii阶段培养基替代。在一些实施方式中，可以添加额外体积的新鲜培养基，其具有增加培养物总体积的净效果。在一些实施方式中，作为替代或添加新鲜第i阶段培养基的替代，可以将特定的培养基组分掺入培养物中。
第ii阶段开始后2-3天内，粘附造血内皮细胞内出现小型、圆形、折射细胞，并最终释放到上清液中(图17a)。这些释放的细胞可以包含前mk，如cd43和cd41在细胞表面表达所定义，并且缺少cd14表达。在2d培养中，通过轻轻清洗并将培养基收集到圆锥形试管中，可以每天收获出现在粘附细胞层顶部的漂浮且附连性弱的第ii阶段细胞。可以通过在经清洗的粘附细胞层顶部添加一半原始体积的新鲜第ii阶段培养基来起始半培养基改变。可以移出培养基中收集到的细胞的等分试样，用于通过流式细胞术进行活细胞计数和生物标志物分析。然后可以将剩余的细胞以200xg离心5分钟。离心后，可以通过将一半原始体积的上清液加回到粘附细胞层来完成培养基更换。在基质独立型3d培养中，可以这样收获释放的细胞，通过暂停搅拌使球状体沉降到容器底部，然后将多达90％的培养基以及悬浮细胞收集到管(例如锥形管)中用于离心。然后可以将一半原始体积的新鲜培养基添加到容器中，并用来自离心细胞上清液的条件培养基补足。在一些实施方式中，可以添加额外体积的新鲜培养基，其具有增加培养物总体积的净效果。在一些实施方式中，可以将特定的培养基组分掺入培养物中以替代新鲜第ii阶段培养基。将剩余的上清液丢弃，并将含有前mk的细胞沉淀物以-180℃储存在cryostor10冷冻保存介质中，或直接过渡到第iii阶段。在第ii阶段收集的巨核细胞祖细胞是小型、圆形、折射细胞，其表达cd43和cd41的细胞并缺少cd14的表达。
第iii阶段.由巨核细胞祖细胞生成成熟巨核细胞(mk)
在一些实施方式中，可以使用如上所述生成的psc衍生的前mk开始成熟巨核细胞的分化。可以将新鲜或解冻的巨核细胞祖细胞接种到第iii阶段培养基中的非粘附表面上，其包含例如stemspantm-acf。非粘附表面指这样的表面，即大多数细胞不旨在粘结或附着于这类表面上，而是大部分保持悬浮状态。例如，这类表面可以由“超低粘附性塑料”制成，或者可以不包被有胞外基质蛋白，以防止或细胞对表面的粘附或使其最小化。在一些实施方式中，第iii阶段培养基可以补充有0至200ng/ml的下述一种或多种物质中的每一种：tpo(例如，25ng/ml)，scf(例如，25ng/ml)，il-6(例如10ng/ml)，il-9(例如，10ng/ml)和肝素(例如，5单位/ml)。在一些实施方式中，第iii阶段培养基可以还补充有um171，um729，sr-1，su6656或其任何组合。
然后可以将细胞孵育在37℃-40℃(例如，39℃)，5％-20％的co2(例如，7％-10％)和5％-20％的o2下至多5天。在一些实施方式中，可以进行每日部分培养基交换，将10-95％使用过的培养基去除并用等体积的新鲜第iii阶段培养基替代。在一些实施方式中，非粘附表面是6孔超低粘附性板。在一些实施方式中，非粘附表面是透气膜(例如，g-
在一些实施方式中，在第iii阶段中，巨核细胞祖细胞可以在几天内分化成成熟mk。在一些实施方式中，最初为均匀的小型、圆形、折射细胞(图21)的大小和倍性开始增加直到2-4天(图20)。同时，可以容易地观察到产生前血小板的mk(图20)。到第iii阶段的3-4天，共表达成熟mk标志物cd42a和cd42b的cd61+(巨核细胞谱系)细胞的比例急剧增加，并且可以达到高到80-90％的水平，这取决于起始hispc细胞系(图21)。截至第iii阶段的第4-5天，成熟mk将血小板释放到培养基中。可以通过流式细胞术和电子显微镜收集、定量和评估这些血小板，确认其确实为血小板(图45)。
3d系统
填充床生物反应器(packedbedbioreactor)
在一些实施方式中，3d可扩展填充床生物反应器可以用于生产前mk、巨核细胞、血小板或巨核细胞和血小板中的一种或多种。在一些实施方式中，填充床生物反应器可以用于第i阶段和第ii阶段培养。例如，填充床反应器可用于将psc分化成造血内皮细胞，然后产生前mk。填充床反应器运载体可以是微米级别的或大尺寸的(macro-sized)，并且可以由生物相容性塑料、金属、玻璃或天然材料(如藻酸盐)形成。在一些实施例中，运载体由raschig环例如1mmraschig的形状的ptfe形成。在一些实施方式中，可以如上所述用基质包被运载体。在一些实施方式中，可以用层粘连蛋白如重组人蛋白层粘连蛋白521包被运载体。在一些实施方式中，多能细胞可以以团块的形式接种到运载体上。在一些实施方式中，可以通过每天进行培养基交换来去除第i阶段培养基或将其替换。在一些实施方式中，在第i阶段期间，多能细胞可以在填充床反应器中的运载体内部显示出生长区域。在一些实施方式中，多能细胞向造血内皮细胞的初始分化(即定向分化的第i阶段)以及前mk的进一步分化和释放(即定向分化的第ii阶段)可以在同一容器中发生。例如，填充床生物反应器可以包含接种有多能细胞例如pbg-1ipsc的层粘连蛋白521包被的大运载体。然后可以将填充床暴露于培养基的连续流中，以使第i阶段分化成造血内皮细胞。在通过填充床渗透后，培养基可以通过调节室循环，在其中可以添加新鲜培养基组分，并且可以通过鼓泡或其他方式调节氧气/co2浓度，然后再将培养基再循环到细胞中。
在第i阶段完成时，可以切换培养基以进行第ii阶段分化以及前mk的产生和释放。适当大小和形状的载体，诸如1mm的raschig环，可以实现足够的培养基流动和通道宽度，以使释放的细胞能够渗透通过填充床并流出反应器，用于收集和冷冻保存。在一些实施方式中，该设计可以降低细胞所经受的剪切力，由于其基于灌注的设计可以允许有效的培养基使用，并且可以在前mk释放时对其进行连续收集。
搅拌槽生物反应器中的自聚集球状体
在一些实施方式中，可以使用可扩展的3d方案来执行某些处理步骤，这可以包括使用悬浮在搅拌或摇动容器中的自聚集球状体来进行分化(图32)。在一些实施方式中，这类容器可包括低粘附性表面或非粘附性表面，即包被有亲水性或中性电荷覆层的表面，以抑制表面上的特异性和非特异性细胞固定，迫使细胞进入悬浮状态。多能细胞可以解离成单细胞并重悬于多能维持培养基中。在一些实施方式中，维持培养基可以补充有rock抑制剂，如h1152或其他rock抑制剂。多能细胞然后可以在低粘附或不粘附的容器中孵育，并在标准培养条件(例如，37℃，5％co2、20％o2)下进行搅拌。在提供搅拌的一些实施方式中，可以将孵育容器放置在定轨摇床上，或者持续搅动的摇瓶或旋转瓶，或者可以使用受控的搅拌罐生物反应器。24小时内，多能细胞可以自聚集以形成直径约为50-150um的球状体。随着搅拌的停止，球状体会沉降到容器底部。
然后可以将培养基与第i阶段分化培养基进行交换，以促进向造血内皮细胞的分化，并且可以恢复搅拌，并在缺氧条件下(例如，37℃、5％co2、5％o2)孵育。可以定期(例如，每天)进行培养基交换，在此期间，球状体可以生长变大并发展出特殊的结构和形状。例如，如图33a所示，可以培养球状体总计6天(4天在37℃、5％co2、5％o2，随后2天在37℃、5％co2、20％o2)。如图33a所示，在第6天，球状体较大，较暗且具有不规则的表面。
为了过渡到第ii阶段，可以暂停搅拌，并且可以使球状体沉降到容器底部。然后可以将培养基与第ii阶段分化培养基进行交换，以促进悬浮细胞的分化和释放。在此之后可定期(例如，每天)收集悬浮细胞并进行部分培养基交换。可以收集培养基并离心。可以将大约一半工作体积的新鲜第ii阶段分化培养基以及足够体积条件培养基(即离心后的上清液)添加到球状体中，以恢复原始工作体积。可以将细胞沉淀物冷冻保存或转移到第iii阶段以成熟为成熟mk。
过渡到静态第iii阶段培养后，来自3d自聚集球状体培养的前mk可以生成与2d培养系统的前mk相似的mk纯度。此外，由3d自聚集球状体培养生成的第iii阶段分化培养物可以包含大小急剧增加并能够生成前血小板的细胞，这与它们确实是巨核细胞的特性一致。
过渡到用于第iii阶段的可扩展系统
在一些实施方式中，如上所述，可以将新鲜或解冻的巨核细胞前mk接种到第iii阶段培养基中的低粘附性或非粘附性表面。在一些实施方式中，这类非粘附表面可以是透气膜(例如，g-
巨核细胞及其产品
在一些实施方式中，本公开提供了由psc细胞或细胞系体外衍生的巨核细胞祖细胞，巨核细胞，预血小板，前血小板或或血小板。根据本公开的方面，使用美国专利号9,763,984的方法或国际专利申请号pct/us2018/021354中所公开的生物反应器来生产衍生自psc细胞或细胞系的巨核细胞祖细胞，巨核细胞，预血小板，前血小板或血小板，上述内容通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，本公开提供了包含巨核细胞或巨核细胞祖细胞的分离细胞群。
在一些实施方式中，本公开提供了包含巨核细胞或巨核细胞性的组合物。在本公开的一些实施方式中，公开了包含巨核细胞、巨核细胞祖细胞或其产品的组合物。
根据本公开的一些实施方式，巨核细胞、巨核细胞祖细胞或其产品在形状、大小和/或表型上是均质的。应当理解的是，本公开的巨核细胞、巨核细胞祖细胞或其产品在生物标志物表达、大小、倍性、数量和纯度中可以包括变异性，其在特征上不同于相应人细胞中的变异性。在一些实施方式中，这类变异性可以明显更低。在一些实施方式中，可以使细胞群具有所需变异性，其可以低于或高于天然细胞的变异性。
在一些实施方式中，巨核细胞祖细胞(前mk)的特征在于表达标志物cd43和cd41并缺少cd14(即，cd14+、cd41+、cd43+)。cd42b的其他表达可能表明巨核细胞祖细胞正朝着成熟巨核细胞最终成熟。在某些实施方式中，在分化培养中生成的巨核细胞祖细胞是非粘附且在培养基中自由漂浮的。
在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42a+、cd42b+、cd41+、cd61+、gpvi+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42a+、cd42b+、cd41+，cd61+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42b+、cd61+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42a+、cd61+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42a+、cd41+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42b+、cd41+、cd61+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42b+、cd42a+、cd61+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd42b+、cd42a+、cd41+和dna+中的一种或多种。在一些实施方式中，巨核细胞为cd41+cd61+cd42b+gpvi+。在一些实施方式中，巨核细胞为cd41+cd61+cd42a+gpvi+。
在一些实施方式中，本发明的巨核细胞是cd61+和dna+并且直径为约10-50μm。在一些实施方式中，通过本文所述的方法产生的巨核细胞的平均大小为10-20μm，11-19μm，12-18μm，13-17μm，14-16μm，14-15μm。在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的巨核细胞的平均大小为14.5μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约10-20μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约10-30μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约10-40μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约10-50μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约20-40μm。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的直径为约25-40μm。
在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的巨核细胞的倍性为2n-16n。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的倍性为至少4n、8n或16n。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的巨核细胞在第iii阶段培养72小时时为16％+/-11.4％的cd61+细胞，有高于4n的dna。
在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的至少50％巨核细胞群体是cd61+和dna+，并且具有2n-16n的倍性。例如，来自代表pbg1分化培养的巨核细胞(即，β-1-微管蛋白阳性第iii阶段细胞)的大小范围为约
在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少55％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少65％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少60％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少70％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少75％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少80％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少85％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少90％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少95％的cd42b+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少98％的cd42b+cd61+dna+细胞。
在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少55％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少65％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少60％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少70％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少75％的cd42b+cd41+cd61+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少80％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少85％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少90％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少95％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少98％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。
在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少55％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少65％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少60％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少70％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少75％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少80％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少85％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少90％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少95％的cd42b+cd42a+cd61+dna+细胞。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少98％的cd42b+cd41+cd61+dna+细胞。
在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％具有4n或更高倍性的巨核细胞。在一些实施方式中，至少50％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，至少60％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，至少70％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，至少80％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，至少90％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含平均倍性为4n的巨核细胞。
在一些实施方式中，分离的细胞群或组合物包含由本公开的巨核细胞生成的前血小板、预血小板或血小板。在一些实施方式中，前血小板、预血小板或血小板是cd42b+cd61+dna-细胞。在一些实施方式中，通过分化hipsc细胞或细胞系体外产生巨核细胞。
在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的巨核细胞包含一种或多种下述情形：(a)通过免疫荧光显微镜检查的mk颗粒的含量：对于α-颗粒为pf4和vfw，对于致密颗粒为lamp-1和血清素；(b)基因表达数据：oct4-，nanog-，sox2-，zfp42-，zfpm1+，nfe2+，runx1+，meis1+，gata1+；(c)具有低/无纤维蛋白原、血清素和ldl，和(d)与血浆一起孵育时可以摄取纤维蛋白原、血清素和ldl。
在一些实施方式中，通过本文所述方法产生的巨核细胞具有生长因子、细胞因子、趋化因子和相关因子的特征性表达概况(图44)。在一些实施方式中，本公开提供了包含本发明的巨核细胞的组合物或药物组合物，其可以包括因子，诸如血小板衍生的生长因子同种型pdgf-aa或pdgf-bb，血管内皮生长因子(vegf)，表皮生长因子(egf)，碱性成纤维细胞生长因子(fgf-2)，造血生长因子flt3l，g-csf，gm-csf，白介素(il-1ra、il-8或il-16)，cxc趋化因子家族成员cxcl1(groα)或cxcl12(sdf-1)，tnf超家族成员scd40l或trail或cc趋化因子家族成员ccl5(rantes)，ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)，ccl21(6ckine)或ccl24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)。在一些实施方式中，本公开提供了包含本发明的巨核细胞裂解物的组合物或药物组合物。这类裂解物可以通过本领域已知的任何方法制备，例如通过损害其完整性的病毒、酶或渗透机制破坏前mk或mk的膜。在一些实施方式中，裂解物可以包括其他试剂或根据特定应用的需要在不同的组合物(液体、糊状体等)中制备。在一些实施方式中，这类组合物可以包含因子，诸如血小板衍生的生长因子同种型pdgf-aa或pdgf-bb，血管内皮生长因子(vegf)，表皮生长因子(egf)，碱性成纤维细胞生长因子(fgf-2)，造血生长因子flt3l，g-csf，gm-csf，白介素(il-1ra、il-8或il-16)，cxc趋化因子家族成员cxcl1(groα)或cxcl12(sdf-1)，tnf超家族成员scd40l或trail或cc趋化因子家族成员ccl5(rantes)，ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)，ccl21(6ckine)或ccl24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)。
使用方法
在一些实施方式中，本发明的前mk和mk及其组分可以是生长因子如人生长因子的来源。在一些实施方式中，这类生长因子可用于细胞培养，组织再生，伤口愈合，骨再生，药妆和止血绷带。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞或其裂解物或其组合物可以用于细胞培养。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞或其裂解物或其组合物可用作药妆。在一些实施方式中，本发明的巨核细胞或其裂解物或其组合物可用作治疗剂。例如，可以使用本发明的巨核细胞或其裂解物或其组合物增加离体细胞的扩增，改善体内的骨髓再生，增加组织再生和血管化，并在放射研究中提高动物的存活率。
在一些实施方式中，本发明的前mk和mk可用于生成血小板以支持当前的输注需求(例如，手术，化学疗法，妊娠/分娩，创伤)。国防和安全措施是美国的高度优先事项，并且作为辐射对策，它代表对mk及其产品的巨大潜在市场。辐射暴露(诸如在核事故或攻击后可能发生)抑制血小板产生。大型放射事件将触发对血小板的即时需求，这将耗尽现有的当地库存以治疗紧急创伤，以及暴露后6天以上的幸存者对血小板的持续需求。随着受影响群体的血小板减少，国家战略血小板储备将变得非常重要，因为我们的军队的准备缺口将从前线转移到事件发生后的24-48小时。美国没有在“国家战略储备库(strategicnationalstockpile)”中保留血小板库存，并且也不存在立即增加血小板计数的许可治疗剂。根据一些实施方式的前mk和mk可用于按需血小板生产。能够将前mk库储很长时间并开发应需hipsc-血小板生产能力的能力将能够建立hipsc-血小板的战略国家储库，这对于满足这一预期需求而言至关重要。
已经证明补充了富含自体血小板血浆(prp)的培养基可以培养微血管内皮细胞，从而改善灌注移植器官的血管完整性。血小板将生物活性因子储存在分泌颗粒中，它们获自巨核细胞。内含物包括各种趋化因子和生长因子，如血小板衍生的生长因子同种型(pdgf-aa、-ab和-bb)，转化生长因子-b(tgf-b)，胰岛素样生长因子-1(igf-1)，脑源性神经营养因子(bdnf)，血管内皮生长因子(vegf)，表皮生长因子(egf)，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf或fgf-2)，肝细胞生长因子(hgf)，结缔组织生长因子(ctgf)和骨形态发生蛋白2、-4和-6(bmp-2、-4、-6)。人血小板裂解物显著增加离体细胞扩增，改善体内骨髓再生，并在放射研究中提高动物的存活率。在一些实施方式中，本公开提供了包含由本发明的巨核细胞生成的前血小板、预血小板或血小板的裂解物的组合物或药物组合物，其中这类组合物可以包括因子，诸如血小板衍生的生长因子同种型pdgf-aa或pdgf-bb，血管内皮生长因子(vegf)，表皮生长因子(egf)，碱性成纤维细胞生长因子(fgf-2)，造血生长因子flt3l，g-csf，gm-csf，白介素(il-1ra、il-8或il-16)，cxc趋化因子家族成员cxcl1(groα)或cxcl12(sdf-1)，tnf超家族成员scd40l或trail或cc趋化因子家族成员ccl5(rantes)，ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)，ccl21(6ckine)或ccl24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)。
试剂盒
本公开提供了包含本公开的巨核细胞或分化细胞的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括包含分离的巨核细胞的组合物。在特定实施方式中，本公开内容提供了用于分化、培养和/或分离本公开的巨核细胞或其前体的试剂盒。在某些实施方式中，本公开提供了用于产生血小板的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含细胞组合物的无菌容器；这类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、囊、起泡包装或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合容纳药剂的其它材料制成。
如果需要，可将试剂盒与产生巨核细胞的说明书一起提供。说明书通常包括关于分化、培养和/或分离巨核细胞或其前体所需的条件和因素的信息。在一些实施方式中，包括用于产生血小板的说明书。说明书可以直接打印在容器(如果存在)，或者作为应用到容器的标签，或者作为单独的纸页、小册子、卡片或文件夹，在容器中提供或与其一起提供。
除非另有说明，否则本公开的实践采用了在本领域技术人员范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释，所述文献例如，《分子克隆：实验室手册》(“molecularcloning：alaboratorymanual)”，第二版(sambrook，1989)；“《寡核苷酸合成》(oligonucleotidesynthesis)”(gait，1984)；“《动物细胞培养》(animalcellculture)”(freshney，1987)；“《酶学方法》(methodsinenzymology)”，“《实验免疫学手册》(handbookofexperimentalimmunology)”(weir，1996)；“《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(genetransfervectorsformammaliancells)”(miller和calos，1987)；“《新编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology)”(ausubel，1987)；“《pcr：聚合酶链式反应》(pcr:thepolymerasechainreaction)”，(mullis，1994)；“《新编免疫学实验指南》(currentprotocolsinimmunology)”(coligan，1991)。这些技术适用于生产本公开的多核苷酸和多肽，并且因此可以在制造和实践本公开中考虑。下述部分将讨论对于特定实施方式特别有用的技术。
提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本公开的试验、筛选和治疗方法，并不意在限制发明人认为关于其公开的范围。
实施例
实施例1.由临床等级hipsc细胞系扩大产生巨核细胞祖细胞、巨核细胞和血小板。
使用图2中的定向分化方案研究临床等级hipsc细胞系分化成巨核细胞的潜力，所述图2是显示多能干细胞分化成巨核细胞的时间过程的示意图，其中表示了分化的各个阶段(第0、i、ii、iii阶段)。时间线上方显示了第0-iii阶段中的细胞类型和细胞标志物。时间线下方显示了培养条件，包括培养基组成、基质、温度和气体条件。
不同的ipsc系在功能上是不同的，并且为了真正优化分化方案，重要的是确定该过程的最佳临床等级细胞系。获得了三种临床等级hipsc细胞系，称之为pbg1、pbg2和pbg3。pbg1获自ninds(美国国家神经疾病和中风研究所(nationalinstituteofneurologicaldisordersandstroke))/nih(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth))的ninds人细胞和数据储存库(nhcdr)储存库。pbg1(nindsid:lipsc-gr1.1)衍生自雄性cd34+脐带血(隆萨公司(lonza))。pbg2和pbg3获自富士-细胞动力学国际公司(fujifilm-cellulardynamicsinternational，f-cdi)。pbg2和pbg-3分别衍生自雄性和雌性成体血细胞(f-cdimycellsipscid号：21525和21526)。
在分化开始前，当采用essential8培养基在玻连蛋白上生长时，所有三个hipsc系形成特征性集落(图3a)，并显示出多能性生物标志物oct4和nanog的表达(图3b、图13a)。使用图2中总结的多阶段方案，将三种临床级hipsc细胞系定向分化成巨核细胞。在定向分化期间的各个时间点观测细胞(图4a-4d)。最初通过监测cd31+的表达来观测第i阶段的分化效率，所述cd31+是造血内皮细胞的标志物(图5)。在第i阶段期间，三种hipsc细胞系的分化效率相似。不受理论的束缚，在之后的分化过程中，巨核细胞输出/质量的差异并不总是与第i阶段中的分化效率相关联。在第ii阶段期间，向巨核细胞祖细胞的进一步分化通过监测cd41+cd43+细胞的产生来观察(图6a)。值得注意的是，对于一些临床级细胞系，相较于使用不同hipsc细胞系的先前方法，第ii阶段期间巨核细胞祖细胞的产生被延长得更久(长达17天)(图6b)。pbg-1和pbg-2ipsc的累积产量特别稳健，并且在独立的分化之间显示出一定的变异性(图6c)。当细胞过渡到定向分化方案的第iii阶段时，第1-5天的cd42b+的表达增加了，并在第4-5天，表达cd42b+的cd41+的细胞百分比是至少约80％(图7a)。通过光学显微镜、免疫荧光显微镜和电子显微镜对获自三种临床级ipsc系的第iii阶段细胞进行了分析，结果显示pbg1和pbg2具有与成熟巨核细胞一致的特征，包括大小、形态、前血小板伸展、巨核细胞特异性蛋白表达和超微结构(图7b-7c，图8a-8e)。
实施例2.多能pbg-1细胞的大规模扩增。
分化之前，需要多能pbg-1扩增以产生高密度种子库所需的大量细胞，并生成足够的细胞数量以适当规模起始分化，用于临床生产。pbg-1可以在2d培养中维持和扩增，使用重组玻连蛋白(vtn)，加无动物成分(acf)，cgmp相容性试剂，如essential8，nutristem或stemflex。观测所有三种生长条件下的特征性集落生长和多能性标志物的维持(图9a-9c，图10a-10c)。为了实现大规模扩增，使用tryple由2d培养收获pbg-1细胞为单细胞，并允许其在搅拌的3d容器(在这种情况下为300mldasboxmini生物反应器系统)中自聚集。在最初的24小时，将rock抑制剂如y27632添加到细胞，以在初始聚集期间促进细胞存活。在搅拌槽中6-7天后，所得球状体的直径从50微米增加到250微米，并且总体细胞密度在该时间段内增加高达40倍(图11a-11c)。以这种方式生长的pbg-1细胞可以被重复传代，并且在至少连续的四轮扩增中保持其多能性(图12a-12b，图13b)，并保持正常核型(图14)。
实施例3.在2d培养容器中使用胶原蛋白iv基质对pbg-1定向分化成前mk和mk的深度表征
当用0.5mmedta收获并以小簇铺板在4.2ug/cm2的人胶原蛋白iv上时，pbg-1细胞在第i阶段分化的6天过程中表现出一组特征性的形态变化(图15)。在第i阶段结束时，使用accutase将代表性孔收获为单细胞，并通过流式细胞术评估造血内皮细胞标志物cd31和cd34(图16a)。在多个独立pbg-1分化中(n＝41)，确定第6天的平均分化效率为大约40％cd31+(范围：约20-60％)和大约30％cd31+cd34+(范围：约15％-45％)(图16b)。
第ii阶段开始后2-3天内(即第6+2至6+3天)，粘附造血内皮细胞内出现小型、圆形、折射细胞，并最终释放到造血内皮细胞单层上的上清液中(图17a)。这些释放的细胞包含前mk，如cd43和cd41在细胞表面表达所并且缺少cd14表达所确定(图17b，图17c)。通过轻轻清洗并将培养基收集到圆锥形试管中，每天收获出现在粘附细胞层顶部的这些漂浮且附连性弱的第ii阶段细胞，并每天分析cd43、cd41和cd14的表达。释放的细胞的纯度在第ii阶段的前几天低并在此后进行稳定期，并且到第6+6天，前mk纯度的平均峰值为50-60％(图18a)。cd14+髓样细胞在第ii阶段的前6-7天不是pbg-1定向分化培养中的主要污染物，虽然此后存在一些变异性(图18b)。前mk产生的动力学平均在第6+6天和6+7天达到峰值，然后下降(图19a)。在多个独立pbg-1分化(n＝41)中，确定平均累积前mk(cd43+cd41+cd14-)产量为各孔约100万(范围：10至330万)(图19b)。
当将来自这些培养的前mk转移到第iii阶段条件时，它们会在几天内分化成成熟mk。截至2-4天时，最初为均匀的小型、圆形、折射细胞(图20a)的大小开始增加(图20b和图20c)。同时，可以容易地观察到产生前血小板的mk(图20c和图20d)。到第iii阶段的3-4天，通过facs确定共表达成熟mk标志物cd42a和cd42b的cd61+(巨核细胞谱系)细胞的比例(图21a和图21b)并且成熟mk(cd61+cd42a+cd42b+细胞)的纯度可以达到培养中所有有核细胞的70-90％的水平(图21c)。
实施例4.重组层粘连蛋白521可以替代胶原蛋白iv以支持pbg-1定向分化成mk。
iv型胶原蛋白纯化自人胎盘物质并且仅能够作为研究专用试剂。因此，胶原蛋白iv与pbg-1衍生的巨核细胞的cgmp产生不相容，并且这些细胞可以用于临床之前必须制定替代策略。一种可能的解决方案是用产生自重组来源的重组基质组分代替胶原蛋白iv。在此，证明了重组层粘连蛋白521可以用作胶原蛋白iv的合适替代物，用于将ipsc直接分化成mk。通过用0.5mmedta收获而产生的pbg-1团块在6天的第i阶段分化过程中在0.13ug/cm2的重组层粘连蛋白521表现出和4.2ug/cm2的人胶原蛋白iv上表现出相同的一组特征性的形态变化。(图22a-22b)。当过渡到第ii阶段时，层粘连蛋白521培养产生的前mk的产量和纯度与对应胶原蛋白iv培养相似(图23a-23c)。在另分化3天后，第iii阶段中的细胞显示出相似的大小、形态学和血小板产生倾向，无论它们是在胶原蛋白iv还是层粘连蛋白521上产生的(图24a-24b)。还测量了共表达成熟mk标志物cd42a和cd42b的cd61+(巨核细胞谱系)细胞的比例并发现在任一基质上产生的细胞是相似的(图25a-25b)。
实施例5.wnt调节剂可以影响第i和ii阶段分化效率。
wnt信号在发育过程中十分重要，gsk3激酶抑制剂chir98014和chir99021作为wnt激动剂。当仅在分化的前48小时使用0.6umchir98014或6umchir99021增强本文所述第i阶段分化条件(使用层粘连蛋白521基质)时，在第6天观察到第i阶段分化效率显著提高，如通过cd31和cd34的免疫荧光染色所确定(图26a-26c)。然后将对照和chir98014培养过渡到第ii阶段，其中通过cd41和cd43的免疫荧光染色追踪前mk的产生和释放。cd41+细胞数量的目测估计表明，在前48小时中通过wnt调节剂产生的更高的第i阶段效率可以对应于第ii阶段期间更高的输出(图27a-27b)。因此，短时间内添加wnt调节剂可影响整个后续分化阶段的分化效率。
实施例6.具有层粘连蛋白521包被的大运载体的填充床生物反应器。
为了获得巨核细胞和血小板临床生产所需的产量，至关重要的是将整个分化过程从小规模组织培养塑料器皿(2d，基质依赖型)过渡到3d可扩展方案。在此，我们提供证据表明，层粘连蛋白521包被的处于1mmraschig环形状的ptfe大运载体可为pbg-1细胞分化提供支持，并且该大运载体材料可经调整以用于填充床生物反应器，如示意图中所示(图28)。首先将ptfe环在摇床上用1.25ug/ml层粘连蛋白-521于4℃孵育过夜。使用前，将ptfe环在含有essential8基质加rock抑制剂h1152的6孔板中平衡。使用0.5mmedta收集多能pbg-1ipsc，重悬essential8培养基和h1152，并以簇状接种到ptfe环上。每10分钟，将平板在定轨摇床上以75rpm的速度运行30秒。1小时后，将板以75rpm连续振荡过夜。24小时后，通过每天进行培养基交换来去除90％的培养基并用第i阶段培养基替换。第i阶段期间，pbg-1细胞在raschig环的内部表现出生长区域(图29)，并且该生长区域表现出与2d培养物中所见的形态学特征相似的形态特征(图22)。这些细胞的流式细胞术分析表明高比例的造血内皮细胞，其中约80％的细胞表达cd31，其中一半以上的细胞对cd34+呈双阳性(图31a)。切换到第ii阶段培养基并开始进行半天的培养基交换后，形态从一半平坦的集落改变为3d球状体型结构，虽然应注意的是，这些结构仍然与环形大运载体内部的层粘连蛋白521覆层附连(图30)。在第ii阶段中释放的细胞甚至早在第6+2天就具有高的前mk含量，其中约75％的细胞共表达cd43和cd41(图31b)，其纯度与2d基质依赖型培养相比有益(图18a)。在第6+3天收集释放的细胞并在超低粘附板中的第iii阶段培养基中再培养3天，并且这些细胞中约80％共表达cd61和cd42b(图31c)，这表明发生了有效的mk分化。其中ipsc初始分化成血液内皮细胞(即定向分化的第i阶段)以及前mk的进一步分化和释放(即定向分化的第ii阶段)可以发生在同一容器中(图28)。在该设计中，填充床生物反应器设置为接种有多能pbg-1ipsc的层粘连蛋白521包被的大运载体。然后将填充床暴露于培养基的连续流中，以使第i阶段分化成造血内皮细胞。在通过填充床渗透后，培养基通过调节室循环，在其中添加新鲜培养基组分，并且通过鼓泡或其他方式调节氧气/co2浓度，然后再将培养基再循环到细胞中。在第i阶段完成时，切换培养基以进行第ii阶段分化以及前mk的产生和释放。适当大小和形状的大运载体底物，诸如1mm的raschig环将实现足够的培养基流动和通道宽度，以使释放的细胞能够渗透通过填充床并流出反应器，用于收集和冷冻保存。该设计降低细胞所经受的剪切力，由于其基于灌注的设计可以允许有效的培养基使用，并且能够在前mk释放时对其进行连续收集。
实施例7.搅拌槽生物反应器中自聚集ipsc衍生的球状体
可扩展3d方案的另一个示例涉及在搅拌或摇动的超低粘附性容器中使用自聚集球状体进行分化(图32)。在此示例中，使用tryple将多能pbg-1ipsc解离为单细胞，以50-100万个细胞/ml重悬于多能性维持培养基(如essential8，nutstem，stemflex，其他类似培养基或其组合)加上h1152或其他rock抑制剂，然后在6孔超低粘附板中以37℃、5％co2、20％o2孵育，其位于90rpm的轨道摇床，或恒定搅拌的旋转瓶(对于125ml旋转培养瓶中的50ml体积，90rpm)。在任一系统中24小时内，pbg-1细胞自聚集形成直径约为50-150um的球状体(图33a，对于不同容器中相似的示例也参见图11a)。然后暂停搅拌，并使球状体沉淀到容器底部(大约5分钟)。然后将50％-100％培养基与第i阶段分化培养基交换，以促进向造血内皮细胞的分化，并恢复搅拌，并在缺氧条件下(37c、5％co2、5％o2)孵育。相似地，每天进行培养基交换，总计进行6天(在37℃、5％co2、5％o2中进行4天，然后在37℃、5％co2、20％o2中进行2天)，在此期间，球状体到第6天时变大并发展出特征性结构和形状(图33a)。当这些球状体的样品在第6天解离并通过流式细胞术评估时，发现约44％的细胞表达造血内皮细胞标志物cd31和cd34(图33b)，其纯度相比2d基质依赖型培养有益(图16b)。为了过渡到第ii阶段，暂停搅拌，并使球状体沉淀到容器底部(大约5分钟)。然后将50-100％的培养基与第ii阶段分化培养基交换，以促进悬浮细胞的分化和释放(图34a)。在此之后每天收集悬浮细胞并进行部分培养基交换。为此，暂停搅拌，并使造血内皮细胞球状体沉淀到容器底部(大约5分钟)。收集大约80％的培养基(连同悬浮细胞)并离心。将一半工作体积的新鲜第ii阶段分化培养基以及足够体积条件培养基(即离心后的上清液)添加到球状体中，以恢复原始工作体积。然后丢弃剩余上清液，并将部分细胞沉淀用于facs分析(图34b)，并将剩余物冷冻保存或转移至第iii阶段用于使成熟mk成熟。悬浮细胞的流式细胞术分析表明，在第6+2天和第6+6天之间释放的大多数细胞共表达前mk标志物cd43和cd41(图34b、图34c)。来自3d自聚集球状体培养的总体前mk纯度和产率(图34c、图34d)相比来自2d培养的纯度和产率(图18a、图19a)有益。过渡到静态第iii阶段培养后，来自3d自聚集球状体培养的前mk生成与2d培养系统的前mk相似的mk纯度(图35a-35c)。此外，由3d自聚集球状体培养生成的第iii阶段分化培养物包含大小急剧增加并能够生成前血小板的细胞(图36)，这与它们确实是巨核细胞的特性一致。
实施例8.pbg1ipsc衍生的巨核细胞的详细表征
使用本文所述方法产生的巨核细胞表现出与功能性成熟mk相关的许多特征，包括在通过免疫荧光显微镜对mk特异性蛋白β-1-微管蛋白(图37)、以及与α颗粒相关的蛋白质(pf4和vwf，图38a-38f)和与致密颗粒相关的蛋白质(lamp1和血清素，图39a-39f)进行成像时。pbg1衍生的mk的电子显微镜图像揭示了特征性超微结构特征，包括多囊泡体，糖原颗粒和内陷膜系统(图40a-40d)。基因表达分析揭示了多能性基因如oct4的下调(图41a)和巨核细胞谱系基因如nfe2的上调(图41b)。对一组相关基因进行相似的分析，并且该分析的结果与多能干细胞特征(signature)的丧失以及巨核细胞特征的获得相一致(图41c)。
当与衍生自骨髓cd34+、外周血cd34+或脐带血cd34+细胞的原代巨核细胞(天然产物)，pbg1衍生的mk的进行比较时，发现pbg1ipsc衍生的mk具有相似的平均大小(图42a-42c)，以及相较于衍生自cd34+骨髓、外周血或脐带血干细胞的原代巨核细胞(天然产物)(图42c，图43b)，特征性较低倍性分布(图43a-43b)。pbg1hipsc衍生的巨核细胞也具有与人血小板中存在的因子相似的因子的特征性生长因子、细胞因子和趋化因子表达概况(包括存在之前在巨核细胞中未报道过的多种因子)(图44)。为了获得数据，通过将细胞在-80℃冷冻过夜然后在37℃解冻裂解1xpbs中浓度为2500万/ml的hipsc-mk。重复该冻结/解冻循环4次。使用0.22μm的注射器过滤器过滤所得的悬浮液。使用多重激光微珠技术(eveke科技公司(evetechnologies))测试裂解物选定组合的生长因子、细胞因子和趋化因子。针对背景(pbs，处理方法类似于hipsc-mk)校正数据，然后与下述物质比较：市售可得的人血小板裂解物(hpl)、新鲜mk分化培养基(用于分化的最后阶段)和条件培养基，即裂解前由hipsc-mk中移出的mk分化培养基。虽然在hipsc-mk和hpl之间观测到了强重叠，但是在hipsc-mk中也检测到了以前在巨核细胞或血小板中未曾描述过的几种蛋白质(用“”表示)。
本文所述结果证明了用于产生临床级人ipsc衍生的巨核细胞的稳健过程。可以分离和浓集人ipsc衍生的巨核细胞，用于进一步表征或用于下游应用，如人血小板生成(图45a-45c)。
其它实施方式
如本文所述，本公开的特征在于用于产生巨核细胞祖细胞和巨核细胞的组合物和方法。在一方面中，本公开提供了由临床级hipsc细胞或细胞系分化的巨核细胞或巨核细胞祖细胞。在一些实施方式中，本公开提供了包含根据本文所述任何方面的巨核细胞或巨核细胞祖细胞的分离细胞群。在一些实施方式中，本公开提供了包含根据本文所述任何方面的巨核细胞或巨核细胞祖细胞的组合物。
在一些实施方式中，本公开提供了包含根据本文所述任何方面的巨核细胞裂解物的组合物或药物组合物。在一些实施方式中，本公开提供了这样的组合物或药物组合物，其包含由根据本文所述任何方面的巨核细胞生成的血小板的裂解物。在一些实施方式中，本公开提供了产生巨核细胞的方法，该方法包括分化临床级hipsc细胞或细胞系。在本文所述各方面的各个实施方式中，巨核细胞是cd42b+、cd61+和dna+中的一种或多种。在本文所述各方面的各个实施方式中，巨核细胞的直径为约10-30μm。在某些实施方式中，巨核细胞的直径为约10-20μm。在本文所述各方面的各个实施方式中，巨核细胞的倍性为至少4n、8n或16n。在本文所述各方面的各个实施方式中，巨核细胞祖细胞是cd14-、cd41+和cd43+。在本文所述各方面的各个实施方式中，能够在由血液内皮细胞祖细胞分化开始后至至少第10天连续产生巨核细胞祖细胞(即第ii阶段，第6+10天)。在本文所述各方面的各个实施方式中，能够在由血液内皮细胞祖细胞分化开始后至至少第17天连续产生巨核细胞祖细胞(即第ii阶段，第6+17天)。在本文所述任何方面的各个实施方式中，临床级hipsc细胞或细胞系选自pbg1、pbg2和pbg3。
在本文所述任何方面的各个实施方式中，分离的细胞群或组合物包含由本公开的巨核细胞生成的血小板。在本文所述任何方面的各个实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％的cd42b+的cd41+cd61+细胞。在本文所述任何方面的各个实施方式中，分离的细胞群或组合物包含至少50％具有4n或更高倍性的巨核细胞。在某些实施方式中，至少50％的巨核细胞的倍性为4n-16n。在本文所述任何方面的各个实施方式中，分离的细胞群或组合物包含具有4n或更高平均倍性的巨核细胞。
藉由之前描述，显而易见的是可以对本文所述公开进行变化和修改以使其适应各种用途和条件。这类实施方式也落在本文权利要求书的范围内。
本文变量的任何定义中对元素列表的引用包括该变量作为任何单一元素或列出的元素组合(或子组合)的定义。本文的实施方式的引用包括该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式的组合或其部分。
本说明书中提到的所有专利和公开通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的专利或公开专门和单独地通过引用纳入本文那样。
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