包含来源于决明子芽的萘并吡喃酮衍生物的神经细胞保护用组合物的制作方法

本说明书涉及萘并吡喃酮衍生物及将包含其的决明子芽提取物作为有效成分包含的组合物。

背景技术：

脑海马体(hippocampus)作为大脑内部颞叶的一个结构体，在人类和动物的认知功能中起到重要的作用。已知海马体是对生理性/氧化应激刺激脆弱并会引起因压力导致的认知功能的损伤的中枢组织。压力可以引起海马体的结构和脑细胞生成、突触可塑性以及与海马体有关的行动学变化(eun-jookim,韩国心理学杂志：认知和生物,2012,24,65-88)。已知当神经细胞中的氧化应激诱发在海马体、脑下垂体、纹状体、黑质、前脑皮质或下丘脑中时，神经细胞死亡增加，减少神经元和生长因子，从而导致肌萎缩性侧索硬化(卢格里格氏病)、帕金森氏病或者脑缺血性神经损伤等急性或慢性神经疾病(rahman,t.etal.adv.biosci.biotechnol.2012,3,997-1019)。

根据韩国国民健康保险公署的健康保险资料，视网膜疾病患者从2010年约83万名增加到2015年约125万名，年平均增加约8％。视网膜是类似于相机胶卷的眼睛内部的薄神经膜。在视网膜中，存在着一亿个以上的感光细胞(感知光的细胞)和百万个以上的视神经细胞，从而将光转换为电信号，通过神经，将用眼看到的事物的影像传递至大脑。如果这样的视网膜的神经损伤或神经功能产生异常，则在视力和视野上产生问题。代表性的视网膜疾病包括视力下降、视野障碍和失明，有糖尿病性视网膜病变、与年龄有关的黄斑变性、视网膜色素变性、视网膜脱离和视网膜血管闭锁等。青光眼作为视网膜的视神经损伤产生的代表性的眼部疾病，由于眼压升高、缺血和氧化应激等原因损伤视神经(kim,n.y.etal.j.koreanopthalmol.soc.2015,56,70-79；kang,j.h.etal.j.koreanophthalmol.soc.2003,44,965-970；lee,s.m.etal.j.koreanophthalmol.soc.2002,43,2577-2584)。

谷氨酸是在脊椎动物的中枢神经系统中起到重要作用的兴奋性神经递质。谷氨酸作用于集中分布在已知在脑组织中参与记忆力和学习能力的小脑扁桃体和海马体中的使君子氨酸(quisqualate)受体、nmda(n-methyl-d-aspartate，n-甲基-d-天冬氨酸)受体以及卡因酸(kainite)受体，参与各种生理作用表现。相反，当谷氨酸从神经细胞内向外的游离增加而细胞外的谷氨酸浓度急剧增加时，可以作用为氧化性神经毒性物质(hyunjeongkim等,j.lifesci.2009,19,963-967)发挥作用。过量的谷氨酸(glutamate)已知与包括贫血、缺氧、低血糖、创伤、各种慢性退行性神经疾病在内的各种急性神经学障碍有关。眼睛中的谷氨酸与视网膜神经节细胞的急性障碍和死亡有关(otori,y.etal.invest.ophthalmol.vis.sci.1998,39,972-981)。已知在谷氨酸大量产生而激活突触前(presynaptic)的谷氨酸受体的同时，刺激了活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的过量产生(tarasenkoa.etal.neurochem.int.2012,61,1044-1051)。此外，已知响应于谷氨酸而发挥的氧化作用通过nmda受体的活化来介导，显示出钙离子依赖性。据报告，这样的nmda受体过度的活化和线粒体中钙离子的吸收(uptake)造成ros的产生(reynoldsi.j.etal.j.neurosci.1995,15,3318-3327)。活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)是通过基于生物体细胞内的线粒体中的呼吸和免疫反应的氧的氧化·还原而持续产生的。由于ros在化学上不稳定，反应性高，因此可以与体内的脂质、核酸、蛋白质等反应，从而引起dna损伤、细胞内游离钙和铁的浓度增加、生物膜的离子传输系统损伤等(kiselyov,k.etal.cellcalcium.2016,60,108-114)。此外，已知光也可以诱导ros产生，从而诱导视神经的光氧化损伤(masuda,t.etal.oxid.med.cell.longevity.2017；articleid9208489,14pages)。

已知决明子在传统上用于眼部健康，并且具有优异的抗氧化作用。决明子作为属于豆科植物的决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.))或龙岗南茶(小决明(cassiatoral.))的成熟种子，在韩国各处均有栽培，叶子掉落后，在约10厘米左右的弓形豆荚中有一排润泽的种子(yen,g.-c.etal.j.agric.foodchem.1998,46,820-824)。研究报道了决明子提取物具有改善糖尿病、改善血脂异常、护肝、抗菌、降血压的功效(dong,x.etal.mol.med.rep.2017,16,2331-2346)。

然而，决明子芽提取物或来源于它的作为萘并吡喃酮衍生物的7-羟基酸模素-红镰霉素-8'-o-吡喃葡萄糖苷(7-hydroxymusizinyl-rubrofusarin-8'-o-glucopyranoside)、异决明种内酯(isotoralactone)、决明内酯(toralactone)、决明蒽酮(torosachrysone)和红镰霉素(rubrofusarin)对于谷氨酸诱导的神经毒性的神经保护作用未曾有报道，对于决明子芽提取物的抗氧化以及用于神经保护的组合物的技术未曾了解。

另外，利用决明子芽提取物的健康功能性和药效成分研发案例也未曾报道，本发明的发明人确认了决明子芽提取物与决明子提取物相比，生成新型抗氧化成分，抗氧化活性成分增加，由此而显著增加抗氧化作用和神经细胞保护作用的事实，通过确认从决明子芽提取物中分离的包含新型化合物7-羟基酸模素-红镰霉素-8'-o-吡喃葡萄糖苷的萘并吡喃酮成分显示出保护视网膜神经细胞和海马神经细胞免受谷氨酸诱导的氧化应激的效果，从而完成了本发明。

[现有技术文献]

[专利文献]

(专利文献1)kr10-1503429b1

(专利文献2)kr10-2010-0082054a

(专利文献3)kr10-0877371b1

(专利文献4)kr10-1807367b1

(专利文献5)kr10-2016-0058613a

[非专利文献]

(非专利文献1)jung,h.a.journalofethnopharmacology,2016,vol191,152-160；inhibitoryactivitiesofmajoranthraquinonesandotherconstituentsfromcassiaobtusifoliaagainstβ-secretaseandcholinesterases.

(非专利文献2)shrestha,s.etal.archivespharmacalresearch,2018,onlinepublicationhttps://doi.org/10.1007/s12272-018-1044-0；twonewnaphthaleniclactoneglycosidesfromcassiaobtusifolial.seeds.

技术实现要素：

本说明书的目的在于提供下述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物。

[化学式1]

本说明书的另一目的在于提供一种组合物，其显示出保护神经细胞免受氧化应激的损伤，或者抑制神经细胞死亡的效果。

本说明书的另一目的在于提供一种组合物，其显示出预防或治疗由视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的效果。

本说明书的另一目的在于提供一种组合物，其显示出抗氧化效果。

为了实现上述目的，本发明的一个方面提供下述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物。

[化学式1]

另一方面，本发明提供选自下述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物的制造方法。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

另一方面，本发明提供用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的组合物，包含选自萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分，上述萘并吡喃酮衍生物为选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上。

另一方面，本发明提供由视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的预防或治疗用组合物，包含选自萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分，上述萘并吡喃酮衍生物为选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上。

另一方面，本发明提供抗氧化用组合物，包含选自萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分，上述萘并吡喃酮衍生物为选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1中以上。

发明效果

根据本发明的一个方面的组合物具有抗氧化效果、以及保护神经细胞免受氧化应激或者抑制神经细胞死亡的效果，特别是，具有抑制由于谷氨酸毒性导致的视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡的效果。因此，根据本发明的一个方面的组合物保护视网膜神经细胞，因此可以用作治疗或预防视神经损伤伴随的视力下降和减退以及眼部疾病，保护海马神经细胞，因此可以用作治疗或预防由脑神经损伤导致的记忆力减退、学习能力减退、抑郁症发作以及恶化和退行性脑神经疾病，而且，可以用于改善记忆力和学习能力、缓解压力等的精神健康、以及保护视神经和改善视力下降等眼睛健康，因此可以用作药物或食品组合物。

附图说明

图1是显示决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)的dpph(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl，α,α-二苯基-β-吡啶并肼基)自由基清除活性的图。

图2是显示决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)的abts在线抗氧化hplc色谱的图。向上方标记的蓝色线的色谱是显示在紫外线(uv)254nm处检测出的成分的图，向下方标记的红色线的色谱是显示与abts试剂反应并在uv/vis(紫外线/可见光)734nm处检出的抗氧化成分的图。

图3是显示在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)的abts在线抗氧化hplc色谱的图。在(a)至(f)的各色谱中，向上方标记的色谱是显示在紫外线(uv)254nm处检出的成分的图，向下方标记的色谱是检出与abts试剂反应并在uv/vis(紫外线/可见光)734nm检出的抗氧化成分的图。(a)样品是在遮光条件下栽培2周的决明子芽提取物(实施例1的sts)，(b)样品是在一般的光条件下栽培2周的决明子芽提取物(实施例2的sts-c)，(c)样品是在385nm的led照明下栽培2周的决明子芽提取物(实施例2的sts-385)，(d)样品是在465nm的led照明下栽培2周的决明子芽提取物(实施例2的sts-465)，(e)样品是在645nm的led照明下栽培2周的决明子芽提取物(实施例2的sts-645)，(f)样品是在780nm的led照明下栽培2周的决明子芽提取物(实施例2的sts-780)。

图4是标记从作为本发明的一实施例的实施例1的决明子芽提取物(sts)中分离的主要成分的峰值的hplc色谱。

图5是显示作为本发明的比较例1的决明子提取物(st)、遮光条件下栽培的决明子芽提取物(实施例1的sts)以及在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(实施例2的sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)保护由谷氨酸(glutamate)毒性诱发的视网膜祖细胞(r28)损伤的效果的图。

图6是按照从决明子芽提取物(sts)中分离的各化合物(实施例4和5的化合物1至化合物5、以及比较例2的化合物a至化合物x)的浓度显示保护由谷氨酸毒性诱发的视网膜祖细胞(r28)损伤的效果的图。

图7是显示作为本发明的比较例1的决明子提取物(st)、在遮光条件下栽培的决明子芽提取物(实施例1的sts)以及在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(实施例2的sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)保护由谷氨酸(glutamate)毒性诱发的海马神经细胞(ht-22)损伤的效果的图。

图8是按照从决明子芽提取物(sts)中分离的各化合物(实施例4和5的化合物1至化合物5、以及比较例2的化合物a至化合物x)的浓度显示保护由谷氨酸毒性诱发的海马神经细胞(ht-22)损伤的效果的图。

具体实施方式

本发明的一个方面可以涉及下述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物。

[化学式1]

上述化学式1的萘并吡喃酮衍生物可以为7-羟基酸模素-红镰霉素-8'-o-吡喃葡萄糖苷(7-hydroxymusizinyl-rubrofusarin-8'-o-glucopyranoside)。

在本说明书中，“药学上可接受”是指通过在以一般的医用剂量(medicinaldosage)利用时避免大部分毒性效果，从而以可以用于动物，更具体而言，可以用于人类的、可以取得政府或其批准的监管机构的承认、或取得承认，或药典中罗列的、或其它一般的药典中记载并被了解的。

在本说明书中，“药学上可接受的盐”是指药学上可接受并具有母化合物(parentcompound)的优选药理活性的、根据本发明的一个方面的盐。上述盐可以包括：(1)由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机盐形成或者由乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2,2,2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡萄糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等有机酸形成的酸加成盐(acidadditionsalt)；或者(2)当存在于母化合物的酸质子被取代时形成的盐。

特别是，在本说明书中，“异构体”不仅包括光学异构体(opticalisomers)(例如，本质上纯的对映异构体(essentiallypureenantiomers)、本质上纯的非对映异构体(essentiallypurediastereomers)或者它们的混合物)，还包括构象异构体(conformationisomers)(即，仅在一个或多个化学键的角度上不同的异构体)、位置异构体(positionisomers)(特别是，互变异构体(tautomers))或者几何异构体(geometricisomers)(例如，顺反异构体)。

在本说明书中，“本质上纯”是指，例如，在与对映异构体或非对映异构体关联而使用时，可以将对映异构体或非对映异构体作为例子举出的具体的化合物存在约90％以上、优选存在约95％以上、更优选存在约97％以上或约98％以上、进一步优选存在约99％以上、再进一步优选存在约99.5％以上(w/w)。

在本说明书中，“水合物(hydrate)”是指结合有水的化合物，是包括在水与化合物之间没有化学键的包合物的广范围的概念。

在本说明书中，“溶剂合物”是指在溶质的分子或离子与溶剂的分子或离子之间生成的高阶的化合物

本发明的一个方面可以涉及萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物的制造方法，是选自下述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物的制造方法，包括从决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.)或小决明(cassiatoral.))芽(sprout)中分离选自上述萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上的过程。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

上述化学式1的化合物(萘并吡喃酮衍生物)可以为7-羟基酸模素-红镰霉素-8'-o-吡喃葡萄糖苷，上述化学式2的化合物(萘并吡喃酮衍生物)可以为异决明内酯(isotoralactone)，上述化学式3的化合物(萘并吡喃酮衍生物)可以为决明内酯(toralactone)，上述化学式4的化合物(萘并吡喃酮衍生物)可以为决明蒽酮(torosachrysone)，上述化学式5的化合物(萘并吡喃酮衍生物)可以为红镰霉素(rubrofusarin)。

上述芽作为使种子发芽而短时间内栽培的芽，可以为在室内使种子发芽而栽培的芽，或者可以为一般所售卖的芽。

上述制造方法的决明子芽(sprout)或者决明子芽植株可以为决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.))或龙岗南茶(小决明(cassiatoral.)或草决明(sennatora))的种子发芽并经2天至31天自然生长或栽培的芽或幼植株，具体而言，可以为自然生长或栽培2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上、15天以上、16天以上、17天以上、18天以上、19天以上、20天以上、21天以上、22天以上、23天以上、24天以上、25天以上、26天以上、27天以上、28天以上、29天以上或30天以上的芽或幼植株，可以为自然生长或栽培31天以下、30天以下、29天以下、28天以下、27天以下、26天以下、25天以下、24天以下、23天以下、22天以下、21天以下、20天以下、19天以下、18天以下、17天以下、16天以下、15天以下、14天以下、13天以下、12天以下、11天以下、10天以下、9天以下、8天以下、7天以下、6天以下、5天以下、4天以下或者3天以下的芽或幼植株，更具体而言，可以为自然生长或栽培选自2天至21天的期间中的期间的芽或幼植株。

上述决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.)或小决明(cassiatoral.))是指被子植物门双子叶植物纲蔷薇目豆科的草本植物，决明子是上述决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.))或龙岗南茶(小决明(cassiatoral.)或草决明(sennatora))的成熟种子，尽管已知决明子提取物的改善糖尿病、改善血脂异常、护肝、抗菌、降血压功效(dong,x.etal.mol.med.rep.2017,16,2331-2346)，但未曾知道改善由氧化应激或药物毒性，特别是，由谷氨酸引起的视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或抑制死亡的效果。

上述决明子芽或幼植株可以是决明子芽或幼植株的整体或部分。上述部分可以前梢或地上部分或地下部分。上述地上部分可以是茎、叶、花或它们的组合。上述地下部分可以是根。上述植株可以自然生长或人工栽培。本发明的决明子芽在室内可以容易地栽培，可以无需供养格外的营养成分在数周之内的短期间内栽培来使用，因此具有工业实用性较大的优点。

上述决明子芽提取物包括粗提取物(crudeextract)或者还包括将提取物进一步分馏(fractionation)得到的分馏物。具体而言，上述决明子芽提取物可以为决明子芽的粗提取物、分馏物、或其组合。上述粗提取物是指使决明子芽与提取溶剂接触而得到的物质。上述分馏物是指从上述粗提取物分离包含特定成分的物质而得到的物质。上述提取物、或其分馏物可以在本发明的组合物中以决明子芽植株的提取物、其分馏物、或小分馏物各自或者其混合物的形式被包含。上述小分馏物可以通过具有截止值的超滤膜来得到，可以通过柱色谱或溶剂分馏来获得。上述决明子芽提取物或分馏物可以含有选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物。

上述分离可以利用过滤、沉淀、离心分离、溶剂分馏、色谱或它们的组合。上述色谱是为了根据各种条件，即，大小、电荷、疏水性或亲和力的分离而制作的，可以为离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、hplc、高效液相色谱、柱色谱、反向柱色谱或其组合。

上述提取可以包括将上述植株在溶剂中孵育一定时间。上述提取可以搅拌或不搅拌进行，或者可以包括加热。上述孵育可以在室温或回流温度下搅拌或不搅拌进行。孵育温度可以根据所选择的溶剂而适当地选择。例如，可以为室温至回流温度、30℃至回流温度、40℃至回流温度。上述加热可以包括加热至50℃、60℃、70℃、80℃、或回流温度。上述加热可以是加热至50℃至回流温度、60℃至回流温度、70℃至回流温度、80℃至回流温度、或回流温度。上述提取时间可以根据所选择的温度而改变，可以为1小时至2个月，例如，可以为1小时至1个月、1小时至15天、1小时至10天、1小时至5天、1小时至3天、1小时至2天、1小时至1天、5小时至1个月、5小时至15天、5小时至10天、5小时至5天、5小时至3天、5小时至2天、5小时至1天、10小时至1个月、10小时至15天、10小时至10天、10小时至5天、10小时至3天、或10小时至2天。上述提取可以为将上述植株在溶剂中回流提取。上述溶剂可以相对于上述植株重量具有1倍、2倍、5倍、10倍或15倍以上的体积。上述溶剂相对于上述植株重量可以具有1倍至15倍、2倍至15倍、5倍至15倍、10倍至15倍或者约15倍的体积。上述植株可以是阴凉或遮光设备或暖风或干燥装置中干燥的植株。

作为上述提取方法，可以利用过滤法、热水提取、沉淀提取、冷沉淀、微波提取、回流冷却提取、压力提取、亚临界提取、超临界提取以及超声波提取等该领域的通常的方法。例如，可以为沉淀提取方法。沉淀提取可以是温热沉淀或常温下的沉淀，可以提取1次至5次。上述决明子芽植株可以与0.1倍至10倍或者1倍至6倍的提取溶剂接触。冷沉淀提取温度可以为20℃至40℃。温热沉淀或加热提取温度可以为40℃至100℃。冷沉淀提取时间可以为24小时至120小时，温热沉淀或者加热提取时间可以为0.5小时至48小时。

上述提取还可以包括从得到的提取液中通过蒸发或减压浓缩之类的已知的方法来去除溶剂。上述提取还可以包括将得到的提取物通过冻干之类的干燥来制造干燥提取物。上述减压浓缩可以利用真空减压浓缩机或真空旋转蒸发仪。此外，干燥可以为减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

上述制造方法还可以包括将上述决明子芽用选自水、c1至c6的醇和它们的混合溶剂中的溶剂来进行提取的过程。上述醇可以为c1至c3的醇、c1至c4、c1至c5或c1至c6的醇。上述醇可以为伯醇。上述c1至c6的醇可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或它们的混合物。

另外，上述制造方法还包括用选自水、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、以及它们的混合溶剂中的一种以上进行分馏的过程。上述制造方法还包括制造以通过提取上述决明子芽的过程而获得的提取物的总重量为基准，以1至20重量％包含有选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物的决明子芽分馏物的过程，具体而言，可以包括制造包含有1重量％以上、2重量％以上、3重量％以上、4重量％以上、5重量％以上、6重量％以上、7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、11重量％以上、12重量％以上、13重量％以上、14重量％以上、15重量％以上、16重量％以上、17重量％以上、18重量％以上或19重量％以上的决明子芽分馏物的过程，可以包括制造包含有20重量％以下、19重量％以下、18重量％以下、17重量％以下、16重量％以下、15重量％以下、14重量％以下、13重量％以下、12重量％以下、11重量％以下、10重量％以下、9重量％以下、8重量％以下、7重量％以下、6重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下或2重量％以下的决明子芽分馏物的过程。

选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物以决明子芽提取物或分馏物的总重量为基准，可以包含为1至50重量％，具体而言，可以包含为1重量％以上、2重量％以上、3重量％以上、4重量％以上、5重量％以上、6重量％以上、7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、11重量％以上、12重量％以上、13重量％以上、14重量％以上、15重量％以上、16重量％以上、17重量％以上、18重量％以上、19重量％以上、20重量％以上、21重量％以上、22重量％以上、23重量％以上、24重量％以上、25重量％以上、26重量％以上、27重量％以上、28重量％以上、29重量％以上、30重量％以上、31重量％以上、32重量％以上、33重量％以上、34重量％以上、35重量％以上、36重量％以上、37重量％以上、38重量％以上、39重量％以上、40重量％以上、41重量％以上、42重量％以上、43重量％以上、44重量％以上、45重量％以上、46重量％以上、47重量％以上、48重量％以上或49重量％以上，可以包含为50重量％以下、49重量％以下、48重量％以下、47重量％以下、46重量％以下、45重量％以下、44重量％以下、43重量％以下、42重量％以下、41重量％以下、40重量％以下、39重量％以下、38重量％以下、37重量％以下、36重量％以下、35重量％以下、34重量％以下、33重量％以下、32重量％以下、31重量％以下、30重量％以下、29重量％以下、28重量％以下、27重量％以下、26重量％以下、25重量％以下、24重量％以下、23重量％以下、22重量％以下、21重量％以下、20重量％以下、19重量％以下、18重量％以下、17重量％以下、16重量％以下、15重量％以下、14重量％以下、13重量％以下、12重量％以下、11重量％以下、10重量％以下、9重量％以下、8重量％以下、7重量％以下、6重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下或2重量％以下。

本发明的一个方面可以涉及用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的组合物，包含选自萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明(cassiaobtusifolial.)或小决明(cassiatoral.))芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分，上述萘并吡喃酮衍生物为选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上。上述选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物可以为选自上述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、以及上述化学式2至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物。与上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂合物、决明子芽、决明子芽提取物或分馏物有关的说明如上所述。

上述组合物可以为用于保护神经细胞或者用于抑制神经细胞死亡的组合物，具体而言，可以为用于保护神经细胞免受由代谢性毒性、神经毒性、化学原因等诱发的氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的组合物。上述氧化应激可以由谷氨酸(glutamate)、谷氨酸毒性或谷氨酸神经毒性诱发，或者可以为由与由谷氨酸神经毒性诱发的氧化应激类似的钙稳态失调、线粒体功能异常、兴奋细胞毒性、营养因子耗竭等导致的氧化应激。具体而言，上述组合物可以减少、抑制、改善、或预防由谷氨酸、谷氨酸毒性或谷氨酸神经毒性诱发的视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤，或者复苏或再生死亡的视网膜神经细胞或海马神经细胞，可以利用作为对由谷氨酸神经毒性、钙稳态失调、线粒体功能异常、兴奋细胞毒性、营养因子耗竭等诱发的氧化应激的防御机制的抗氧化活性化或谷氨酸代谢调节等来保护神经细胞，或者抑制神经细胞死亡。

根据本发明的一实施例，决明子芽提取物与决明子提取物相比，dpph自由基清除效果优异1.7倍以上(试验例1)，相当于抗氧化成分的上述化学式1至化学式5的化合物(萘并吡喃酮衍生物)的含量高，从而显示出更优异的抗氧化效果(试验例2)，本发明的组合物的作为对氧化应激的防御机制的抗氧化作用被激活，从而确认保护神经细胞，或者抑制神经细胞死亡的效果优异。

上述组合物可以在神经细胞损伤或者死亡发生前、发生的同时、或者发生后进行处理。上述组合物可以相对于组合物总重量包含0.001重量％至80重量％的选自萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物，上述萘并吡喃酮衍生物为选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上，具体而言，可以包含0.001重量％以上、0.01重量％以上、0.05重量％以上、0.1重量％以上、1重量％以上、2重量％以上、3重量％以上、4重量％以上、5重量％以上、10重量％以上、20重量％以上、30重量％以上、40重量％以上或者60重量％以上，可以包含80重量％以下、60重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下或者1重量％以下。

另外，上述决明子芽提取物或分馏物以决明子芽提取物或者分馏物的总重量为基准，以1至50重量％包含选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物，具体而言，可以包含1重量％以上、2重量％以上、3重量％以上、4重量％以上、5重量％以上、6重量％以上、7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、11重量％以上、12重量％以上、13重量％以上、14重量％以上、15重量％以上、16重量％以上、17重量％以上、18重量％以上、19重量％以上、20重量％以上、21重量％以上、22重量％以上、23重量％以上、24重量％以上、25重量％以上、26重量％以上、27重量％以上、28重量％以上、29重量％以上、30重量％以上、31重量％以上、32重量％以上、33重量％以上、34重量％以上、35重量％以上、36重量％以上、37重量％以上、38重量％以上、39重量％以上、40重量％以上、41重量％以上、42重量％以上、43重量％以上、44重量％以上、45重量％以上、46重量％以上、47重量％以上、48重量％以上或49重量％以上，可以包含50重量％以下、49重量％以下、48重量％以下、47重量％以下、46重量％以下、45重量％以下、44重量％以下、43重量％以下、42重量％以下、41重量％以下、40重量％以下、39重量％以下、38重量％以下、37重量％以下、36重量％以下、35重量％以下、34重量％以下、33重量％以下、32重量％以下、31重量％以下、30重量％以下、29重量％以下、28重量％以下、27重量％以下、26重量％以下、25重量％以下、24重量％以下、23重量％以下、22重量％以下、21重量％以下、20重量％以下、19重量％以下、18重量％以下、17重量％以下、16重量％以下、15重量％以下、14重量％以下、13重量％以下、12重量％以下、11重量％以下、10重量％以下、9重量％以下、8重量％以下、7重量％以下、6重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下或2重量％以下。

上述神经细胞可以为与脑海马体或眼视网膜关联的中枢神经、末梢神经或视神经，具体而言，可以为视网膜神经细胞或海马神经细胞。

上述视网膜神经细胞可以为选自杆状细胞(rodcell)、视锥细胞(conecell)、双极细胞(bipolarcell)、视网膜无长突细胞(retinalamacrinecell)、水平细胞(horizontalcell)和视网膜神经节细胞(retinalganglioncell)中的一种以上的细胞。上述杆状细胞和视锥细胞为感知光并认识事物的神经细胞，上述双极细胞、视网膜无长突细胞和水平细胞是将视觉信息传递至视网膜神经节细胞的神经细胞，上述视网膜神经节细胞是将视网膜的视觉信息传递至大脑的神经细胞。本发明的一实施例的r28视网膜祖细胞或r28视网膜神经祖细胞是表达视网膜的各种构成细胞的特征，即使移至到视网膜也能生存的细胞，对于低氧症或血清缺乏引起细胞死亡，也可以有效地用于与青光眼关联的谷氨酸或gaba受体表达相关的细胞死亡和细胞毒性研究。此外，r28细胞可以根据培养条件从视网膜祖细胞分化为视网膜神经节细胞，不仅可以用于视网膜的基础细胞学研究，还可以用于视网膜神经节细胞的基础研究(jungillee,jaewookim,韩国眼科协会杂志,2009,50,919-922)。

上述海马神经细胞是作为脑内侧颞叶的一个结构体的海马体(hippocampus)的神经细胞，海马体对生理性/氧化应激刺激薄弱，引起由于压力引起的认知功能的损伤，已知为中枢组织，上述压力可以引起与海马体的结构和脑细胞生成、突触可塑性和海马体有关的行动学变化(kimeun-joo,韩国心理学杂志：认知和生物,2012,24,65-88)。本发明的一实施例的ht-22海马神经细胞对谷氨酸(glutamate)敏感，可以用作用于研究由氧化应激诱发的神经毒性的体外(invitro)模型系统(liu,j.etal.lifescience,2009,84,267-271；kimjihyunkim,soonsiljeon,韩国食品营养科学杂志,2017,46,886-890)。

根据本发明的一实施例，对通过谷氨酸处理诱发氧化应激的r28细胞分别用决明子芽提取物、上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物处理时，被谷氨酸减少的细胞生存率上升为与对照组相应的程度，这样的视网膜细胞保护效果比作为比较例的决明子提取物更优异，确认了本发明的组合物保护由氧化应激导致的视网膜神经细胞的损伤或者抑制视网膜神经细胞死亡的效果优异(试验例3和4)。

另外，根据本发明的一实施例，对通过谷氨酸处理诱发氧化应激的ht-22细胞分别用决明子芽提取物、上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物处理时，被谷氨酸减少的细胞生存率上升为与对照组相应的程度，这样的海马神经细胞保护效果比作为比较例的决明子提取物更优异，确认了本发明的组合物保护由于氧化应激导致的海马神经细胞的损伤或者抑制海马神经细胞死亡的效果优异(试验例5和6)。

本发明的一个方面可以涉及用于预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的组合物，其将选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分包含，或者可以涉及用于预防或治疗由于谷氨酸神经毒性诱发的神经损伤性疾病的组合物。选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物可以为选自上述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、以及上述化学式2至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物。与上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂合物、决明子芽、决明子芽提取物或分馏物、含量有关的说明如上所述。

上述通过视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病可以由谷氨酸神经毒性导致，关于上述视网膜神经细胞和海马神经细胞的说明如上所述。上述神经损伤性疾病可以为选自由于视网膜神经细胞损伤或死亡导致的糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、由视网膜细胞损伤导致的视力障碍、视网膜色素变性、视网膜脱离、视网膜血管闭锁和青光眼中的一种以上，可以为选自由于海马神经细胞损伤或死亡导致的记忆力减退、学习能力减退、抑郁症、肌萎缩性侧索硬化(卢格里格氏病)、帕金森氏病和脑缺血性神经损伤中的一种以上，但只要是由谷氨酸神经毒性诱发的视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡所导致的疾病就没有限定。

上述谷氨酸神经毒性是指神经细胞外的谷氨酸浓度急剧增加，从而谷氨酸作为氧化神经毒性物质作用而显示出的毒性。上述谷氨酸神经毒性可以由于从个体外部流入的谷氨酸而诱发，上述谷氨酸的流入可以依靠含有谷氨酸的食品、含有谷氨酸的治疗剂、含有谷氨酸的预防剂、含有谷氨酸的抗生剂等的摄取或施用，但并不限定于此。

选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物可以从决明子(钝叶决明或小决明)芽中分离或纯化，具体而言，可以从决明子芽乙醇提取物中分离或纯化，可以是将决明子芽乙醇提取物用乙酸乙酯分馏后，将上述乙酸乙酯分馏物用色谱分离或者将上述乙酸乙酯分馏物再次用己烷、二氯甲烷和甲醇的混合溶剂分馏，将其通过色谱而得到的衍生物。

上述决明子芽提取物可以是将决明子芽用选自水、c1至c6的醇和它们的混合溶剂中的溶剂而提取得到的提取物。上述醇可以为c1至c3的醇、c1至c4、c1至c5或c1至c6的醇。上述醇可以为伯醇。上述c1至c6的醇可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或它们的混合物。

上述分馏物还可以包括用选自水、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、以及它们的混合溶剂中的一种以上进行分馏的过程。

根据本发明的一实施例，选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物作为抗氧化成分，与决明子提取物相比，在决明子芽提取物中包含更高的含量(试验例2)，上述萘并吡喃酮衍生物保护通过谷氨酸处理而损伤乃至死亡的视网膜神经细胞(r28)和海马神经细胞(ht-22)的效果优异(试验例4和6)，确认了上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物为具有预防或治疗由谷氨酸神经毒性诱发的神经损伤性疾病的效果的决明子芽的有效成分。

本发明的一个方面可以涉及抗氧化用组合物，其将选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物作为有效成分。选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物可以为选自上述化学式1的萘并吡喃酮衍生物、以及上述化学式2至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物。关于上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物、药学上可接受的盐、异构体、水合物、溶剂合物、决明子芽、决明子芽提取物或者分馏物、含量的说明如上所述。

在本发明的另一观点中，可以涉及包括对需要保护神经细胞免受氧化应激或者抑制神经细胞死的个体施用选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的保护神经细胞免受氧化应或抑制神经细胞死亡的方法。在本发明的一个观点中，上述方法的施用可以根据本说明书中记载的施用方法和施用用量而实施。

在本发明的另一个观点中，可以涉及包括对需要预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的个体施用选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的方法。在本发明的一个观点中，上述方法的施用可以根据本说明书中记载的施用方法和施用用量而实施。

在本发明的另一个观点中，可以涉及包括对需要抗氧化的个体施用选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的抗氧化方法。在本发明的一个观点中，上述方法的施用可以根据本说明书中记载的施用方法和施用用量而实施。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造抗氧化用药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的化妆品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于改善、预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的的化妆品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造抗氧化用化妆品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的食品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于改善、预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的食品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造抗氧化用食品组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于保护神经细胞免受氧化应激或用于抑制神经细胞死亡的准药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造用于改善、预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的准药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于制造抗氧化用准药物组合物的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的保护神经细胞免受氧化应激或抑制神经细胞死亡的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的抗氧化用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于保护神经细胞免受氧化应激或抑制神经细胞的死亡的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及用于预防或治疗由于视网膜神经细胞或海马神经细胞的损伤或死亡诱发的神经损伤性疾病的选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

在本发明的另一个观点中，可以涉及抗氧化用选自由选自上述化学式1至化学式5的萘并吡喃酮衍生物中的1种以上的萘并吡喃酮衍生物、其立体异构体、其药学上可接受的盐、其水合物、或其溶剂合物组成的组中的一种以上、包含其的决明子(钝叶决明或小决明)芽提取物、或包含其的决明子芽分馏物的用途。

本发明的组合物可以为药物组合物、化妆品组合物或食品组合物。

根据本发明的一个方面的药物组合物可以制剂成口服或非口服施用方式。就制剂化而言，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、软胶囊或硬胶囊等，这样的固体制剂通过在一种以上的化合物中混合至少一种以上的赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等等而制备。此外，除了简单的赋形剂以外，也使用硬脂酸镁、滑石粉之类的润滑剂。作为用于口服施用的液体制剂，相当于悬浮剂、液体溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了经常使用的作为简单的稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包括各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、香味剂、防腐剂等。用于非口服施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮溶剂，可以使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油；油酸乙酯之类的可注射酯等。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸酯、甘油明胶等。

根据本发明的一个方面的组合物的药学施用方式也可以以它们的药学上可接受的盐的形式使用，而且可以单独或者以与其它药学活性化合物结合、以及以适当的组合的形式使用。作为上述盐，只要是药学上接受的盐，就没有特别限定，例如，可以使用盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、甲酸乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸等。此外，非口服施用剂型可以为皮肤贴剂、软膏剂、乳膏剂、滴眼剂、喷雾剂或注射剂。

在另一方面中，本发明可以是用于保护个体的神经细胞的方法，其包括将上述药物组合物施用于个体的步骤。

上述个体可以是哺乳动物，例如，人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫，上述哺乳动物可以是人，本发明的化合物的对于人体的有效的施用量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用方式、健康状态和疾病程度而改变。

上述施用可以通过用于口服施用或静脉、覆膜、皮内、皮下、上皮或肌肉施用之类的非口服施用的各种剂型进行施用，就制剂化而言，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制造。

上述施用可以利用该领域中已知的方法来施用。施用可以通过例如，静脉内、肌肉内、口服、或皮下施用之类的途径，利用任意的方法来向个体适当地进行施用。上述施用可以施用至全身或局部。上述施用可以极小地施用至预计神经细胞存在或产生的部位。

根据本发明的一个方面的食品组合物可以为保健功能食品组合物。

上述食品组合物的剂型没有特别限定，可以以直接或稀释而摄取浓缩液或粉末，或者通过口服摄取的方式进行剂型化，例如，可以剂型化为片剂、颗粒剂、粉剂、口服液剂之类的液体药剂、焦糖、凝胶、棒等。在各剂型的食品组合物中，除了有效成分以外，本领域技术人员可以无困难地根据剂型或使用目的适当地选择本领域中通常使用的成分并进行混合，在与其它原料同时使用时，可以引起增益的效果。具体而言，上述食品组合物可以含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述天然碳水化合物可以为葡萄糖、果糖之类的单糖；麦芽糖、蔗糖之类的二糖；以及糊精，环糊精之类的聚糖；木糖醇，山梨糖醇，赤藓糖醇等糖醇。作为甜味剂，可以使用索马甜、甜叶菊提取物之类的天然甜味剂，或者糖精、阿斯巴甜之类的合成甜味剂等。上述天然碳水化合物的比例可以在上述组合物每100重量份的0.01～0.04重量份，具体而言，约0.02～0.03重量份的范围中选择。此外，上述食品组合物可以含有在各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，本发明的可以含有用于制造天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这样的成分可以单独或组合来使用。尽管这样的添加剂的比例不是十分重要，但通常包含在本说明书的组合物每100重量份的0至约20重量份的范围中。

在上述食品组合物中，上述有效成分的施用量的确定在本领域技术人员的水平内，例如，其1天的施用量可以为0.1mg/kg/天至5000mg/kg/天，更具体而言，50mg/kg/天至500mg/kg/天，但并不限定于此，可以根据所要施用的对象的年龄、健康情况、并发症等的各种因素而改变。

根据本发明的一个方面的食品组合物，例如，可以为口香糖、焦糖制品、糖果类、冰果类、膨化食品类等的各种食品类；清凉饮料、矿物质水、醇饮料等的饮料制品；包含维生素或矿物质等的健康功能性食品类。

本发明的组合物可以为准药物组合物。

上述“准药物”为排除根据药事法而作为药品的用途使用的物品之外的药物，是指依据对于与用于治疗或预防疾病而使用的医药品相比对人体的作用更轻微的物品保健福祉部单独规定的分类标准的药品。因此，可以包括用于治疗或预防人类或动物的疾病的纤维、橡胶制品；对于人体的作用轻微或不直接作用，器械或非器械物及其相似物；或用于阻断传染病的杀菌、杀虫剂等。本发明的上述准药物组合物可以用于改善、保护或治疗神经细胞免受氧化应激的损伤，可以用于预防或改善由谷氨酸神经毒性诱发的神经损伤性疾病。

上述准药物组合物可以进一步包括作为准药物可接受的赋形剂或载体。

上述准药物组合物可以制成为皮肤涂抹剂、乳霜、药膏、滴眼剂、喷雾剂形式。

下面，通过实施例和试验例对本发明更详细地进行说明。然而，这些实施例和试验例用于例示性地说明本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例和试验例。

[实施例1]决明子芽提取物的制造

购买未经消毒的国产决明子(钝叶决明子(cassiaobtusifolial.))((株)handsherb，2016年1月)，用20mg/ml浓度的漂白粉(caocl2)消毒15分钟后，用水充分洗涤，在纯净水中浸泡4小时后，在遮光条件下栽培6天。将通过上述栽培而获得的决明子芽在32℃热风(38℃)干燥22天，粉碎而得到了698.4g的干燥的植株。然后，将上述干燥的植株放入提取容器中后，加入5.5l的乙醇后，常温下混合并搅拌，提取7天，将上述混合物利用具有0.34mm的膜厚度的沃特曼(whatman)滤纸和直径30cm的玻璃漏斗进行重力过滤，此过程重复2次(“提取-过滤”2次)，获得了过滤的提取液。将上述过滤的提取液放入减压浓缩器中，在减压下，在35℃将溶剂完全蒸发而浓缩，从而获得了决明子芽提取物66.7g(以下称为“sts”)(收率9.55％)。

[比较例1]决明子提取物的制造

购买未经消毒的国产决明子(钝叶决明子(cassiaobtusifolial.))((株)handsherb，2016年1月)，粉碎后，放入到15ml的提取容器中后，加入11ml的乙醇后，在常温下混合并搅拌，提取7天，将此混合物使用具有0.34mm的膜厚度的沃特曼滤纸和直径10cm的玻璃漏斗实施重力过滤的过程(“提取-过滤”2次)，获得了过滤的提取液(以下称为“st”)。将上述过滤的提取液放入减压浓缩器中，在减压下，在35℃将溶剂完全蒸发而浓缩。(收率3.34％)。

[实施例2]在各种光条件下栽培的决明子芽提取物的制造

为了将上述实施例1的在遮光条件下栽培的决明子芽提取物(sts)的成分和在特定光条件下栽培的决明子芽提取物的成分进行比较分析，使光的波长条件不同而栽培了决明子芽。通过与上述实施例1相同的方法栽培决明子芽，且栽培决明子芽时的光条件为通过不是遮光条件的、照射荧光灯、led385nm、465nm、645nm、780nm分别作为大量波长的选择性光质的光，各栽培了6天。利用通过上述栽培而获得的5种芽，通过与上述实施例1相同的方法制造了各自的决明子芽提取物，将在荧光灯条件下栽培而得到的提取物称为“sts-c”、将在led385nm的光条件下栽培而得到的提取物称为“sts-385”、将在led465nm的光条件下栽培而得到的提取物称为“sts-465”、将在led645nm的光条件下栽培而得到的提取物称为“sts-645”、将在led780nm的光条件下栽培而得到的提取物称为“sts-780”。

[实施例3]决明子芽提取物(sts)的分馏物的制造

将66.7g的上述实施例1的决明子芽提取物(sts)悬浮于600ml的水后，加入1.8l的乙酸乙酯，在常温下震荡搅拌，实施每2小时进行4次的分馏，获得了23.5g的乙酸乙酯分馏物(sts-ea)。对将上述乙酸乙酯分馏物单独使用二氯甲烷(或乙酸乙酯)或者使用每份2.4l的正己烷、二氯甲烷(或乙酸乙酯)、甲醇(或乙醇)的混合溶剂(正己烷:二氯甲烷的混合比例(体积比)为1:1，二氯甲烷:甲醇的混合比例(体积比)为200:1、50:1、10:1、5:1、3:1和1:1)作为分馏溶剂，从而制造了上述sts-ea的分馏物，即，决明子芽提取物(sts)的分馏物。

具体而言，使上述乙酸乙酯分馏物(sts-ea)与上述8种分馏溶剂接触，在硅藻土(celite)中搅拌，使溶剂蒸发，利用填充在直径10cm及长度20cm的柱中硅(silica)树脂展开。进行利用上述各溶剂进行洗脱的色谱，从而获得了20种分馏物(sts-ea-馏分1至sts-ea-馏分20)。

[实施例4]从决明子芽提取物中分离化合物1

将上述实施例3中制造的sts-ea-馏分12(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为10:1的3个馏分中的第2个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法1的条件下实施用于分离的色谱，在保留时间约221分钟的条件下分离了具有上述化学式1的结构的化合物1(14.0mg，干燥植株体重的0.002％；干燥提取物体重的0.021％)。

分离方法1

使用的设备：ymclc-forter

色谱柱：watersdelta-pakc-18rphplc柱(30.0×300mm，15μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为40:60开始洗脱

从0分钟至60分钟，将(a)溶剂的比例从40％增加到100％

流动相流速：10.0ml/min

检测器：紫外线254nm；elsd

[实施例5]从决明子芽提取物中分离化合物2至5

(1)化合物3的分离

将上述实施例3中制造的sts-ea-馏分12(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为10:1的3个馏分中的第2个馏分)减压浓缩后，在上述实施例4的分离方法1的条件下实施用于分离的色谱，在保留时间约24分钟的条件下分离了具有上述化学式3的结构的1.2mg的化合物3。

(2)化合物2的分离

将上述实施例3的sts-ea-馏分8(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为50:1的3个馏分中的第1个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法2的条件下实施用于分离的色谱，在保留时间约36分钟的条件下分离了具有上述化学式2的结构的7.5mg的化合物2。

分离方法2

使用的设备：ymclc-forter

色谱柱：watersdelta-pakc-18rphplc柱(30.0×300mm，15μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为60:40开始洗脱

从0分钟至60分钟，将(a)溶剂的比例从60％增加到100％

流动相流速：10.0ml/min

检测器：紫外线254nm；elsd

(3)化合物4和5的分离

将上述实施例3的sts-ea-馏分13(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为10:1的3个馏分中的第3个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法3的条件下实施用于分离的色谱，在保留时间约71分钟左右，分离了具有上述化学式4的结构的0.6mg的化合物4，在保留时间约120分钟的条件下，分离了具有述化学式5的结构的2.6mg的化合物5。

分离方法3

使用的设备：jascolc-2000plus

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为10:90开始洗脱

从0分钟至60分钟，将(a)溶剂的比例从10％增加到50％

从60分钟至80分钟，将(a)溶剂的比例从50％增加到51％

从80分钟至140分钟，将(a)溶剂的比例从51％增加到58％

从140分钟至180分钟，将(a)溶剂的比例从58％增加到100％

流动相流速：8ml/min

检测器：紫外线254nm

[比较例2]从决明子芽提取物中分离化合物a至x

(1)化合物f、g和h的分离

将上述实施例3的sts-ea-馏分12减压浓缩后，在上述实施例4的分离方法1的条件下实施用于分离的色谱，对上述分馏物实施成分分离。其结果，分离了0.8mg的相当于图4的峰f的化合物f，0.9mg的相当于图4的峰g的化合物g，0.5mg的相当于图4的峰h的化合物h。

(2)化合物c、d和e的分离

将上述实施例3的sts-ea-馏分8减压浓缩后，在上述实施例4的分离方法2的条件下实施用于分离的色谱，从而分离了上述分馏物中所含有的成分。其结果，分离了7.2mg的相当于图4的峰c的化合物c，0.8mg的相当于图4的峰d的化合物d，2.5mg的相当于图4的峰e的化合物e。

(3)化合物i的分离

将上述实施例3中获得的sts-ea-馏分15(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为5:1的3个馏分中的第2个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法4的条件下通过hplc分离法，分离了上述分馏物的含有成分。其结果，分离了0.7mg的相当于图4的峰i中的化合物i。

分离方法4

使用的设备：jascolc-2000plus

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为30:70开始洗脱

从0分钟至240分钟，将(a)溶剂的比例维持在30％

流动相流速：8ml/min

检测器：紫外线254nm

(4)化合物j、k、l、m、n、o、a和p的分离

将上述实施例3中获得的sts-ea-馏分16(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为5:1的3个馏分中的第3个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法5的条件下实施硅胶柱色谱，从而分馏为14个小分馏物。

分离方法5

使用的设备：快速硅胶柱

色谱柱：玻璃柱(25.0×200mm)

溶剂：(a)二氯甲烷(氯化亚甲基)

(b)甲醇流动相组成：以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为20:1开始洗脱

(a)溶剂:(b)溶剂的体积比按照10:1、7:1、4:1、2:1、1:1变化分步溶剂量：300ml

从上述小馏分3(上述分离方法5中的洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为10:1的3个小馏分的第2个馏分)中，在下述分离方法6的条件下，通过hplc分离法，分离了1.8mg的相当于图4的峰j的化合物j，1.9mg的相当于图4的峰k的化合物k，1.0mg的相当于图4的峰l的化合物l。

分离方法6

使用的设备：gilson321hplc

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为20:80开始洗脱

从0分钟至80分钟，将(a)溶剂的比例从20％增加到40％

从80分钟至120分钟，将(a)溶剂的比例从40％增加到100％

流动相流速：8ml/min

检测器：紫外线254nm

另外，从上述小馏分4(上述分离方法5中的洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为10:1的3个小馏分的第3个馏分)中，在下述分离方法7的条件下，通过hplc分离法，分离了2.5mg的相当于图4的峰m的化合物m，2.1mg的相当于图4的峰n的化合物n，0.5mg的相当于图4的峰o的化合物o。

分离方法7

使用的设备：gilson321hplc

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为20:80开始洗脱

从0分钟至100分钟，将(a)溶剂的比例从20％增加到80％

从100分钟至160分钟，将(a)溶剂的比例从80％增加到100％

流动相流速：8ml/min

检测器：紫外线254nm

从上述小馏分6(上述分离方法5中的洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为7:1的3个小馏分的第2个馏分)中，在下述分离方法8的条件下，通过hplc分离法，分离了2.0mg的相当于图4的峰a的化合物a。

另外，从上述小馏分7(上述分离方法5中的洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为7:1的3个小馏分的第3个馏分)中，在下述分离方法8的条件下，通过hplc分离法，分离了4.1mg的相当于图4的峰p的化合物p。

分离方法8

使用的设备：gilson321hplc

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为17:83开始洗脱

从0分钟至50分钟，将(a)溶剂的比例维持在17％

从50分钟至70分钟，将(a)溶剂的比例从17％增加至25％

从70分钟至150分钟，将(a)溶剂的比例从25％增加至30％

从150分钟至180分钟，将(a)溶剂的比例从30％增加至100％

流动相流速：6.5ml/min

检测器：紫外线254nm

(5)化合物q的分离

将上述实施例3中获得的sts-馏分17(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为3:1的3个馏分的第1个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法9的条件下，通过hplc分离法，分离了上述分馏物的含有成分。其结果，分离了1.7mg的相当于图4的峰q的化合物q。

分离方法9

使用的设备：jascolc-2000plus

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为10:90开始洗脱

从0分钟至40分钟，将(a)溶剂的比例维持在10％

从40分钟至70分钟，将(a)溶剂的比例从10％增加至18％

从70分钟至180分钟，将(a)溶剂的比例从18％增加至22％

从180分钟至260分钟，将(a)溶剂的比例从22％增加至100％

流动相流速：6.5ml/min

检测器：紫外线254nm

(6)化合物b、r、s、t、u、v、w和x的分离

将上述实施例3中获得的sts-ea-馏分18(实施例3中的洗脱溶剂为二氯甲烷(或乙酸乙酯):甲醇(或乙醇)的混合比例为3:1的3个馏分的第2个馏分)减压浓缩后，在下述分离方法10的条件下实施硅胶柱色谱，从而分馏为24个小分馏物。

分离方法10

使用的设备：快速硅胶柱

色谱柱：玻璃柱(25.0×200mm)

溶剂：(a)二氯甲烷(氯化亚甲基)

(b)甲醇

流动相组成：(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为20:1开始洗脱

(a)溶剂:(b)溶剂的体积比按照10:1、7:1、5:1、3:1、2:1、1:1变化

分步溶剂量：400ml

10:1(小馏分3、4、5、6)，7:1(小馏分7、8、9、10)，5:1(小馏分11、12、13、14)，3:1(小馏分15、16、17、18)，2:1(小馏分19、20、21、22)

将上述小馏分17至21(上述分离方法10中的洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为3:1的4个小馏分的第3个和第4个馏分、以及洗脱溶剂为二氯甲烷:甲醇的混合比例为2:1的4个小馏分的第2个至第4个馏分)在下述分离方法11的条件下，通过hplc分离法，分离了上述分馏物的含有成分。其结果，分离了1.6mg的相当于图4的峰b的化合物b，24.8mg的相当于图4的峰r的化合物r，5.5mg的相当于图4的峰s的化合物s，2.3mg的相当于图4的峰t的化合物t，9.3mg的相当于图4的峰u的化合物u，6.4mg的相当于图4的峰v的化合物v，4.1mg的相当于图4的峰w的化合物w，0.6mg的相当于图4的峰x的化合物x。

分离方法11

使用的设备：jascolc-2000plus

色谱柱：phenomenexlunac-18rphplc柱(21.2×250mm，10μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa的乙腈

(b)含有0.02％的tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为10:90开始洗脱

从0分钟至40分钟，将(a)溶剂的比例维持在10％

从40分钟至70分钟，将(a)溶剂的比例从10％增加至18％

从70分钟至180分钟，将(a)溶剂的比例从18％增加至22％

从180分钟至260分钟，将(a)溶剂的比例从22％增加至100％

流动相流速：6.5ml/min

对应于从上述实施例4和5以及比较例2中分离的所有物质(化合物1至5、以及化合物c至x)的hplc峰如图4的决明子芽提取物hplc色谱的每个峰的标记所示。包括具有上述化学式1至化学式5的结构的萘并吡喃酮衍生物(化合物1至5)的共29种物质为可从上述实施例1中获得的量的从决明子芽提取物中分离的成分。此外，根据hplc分析色谱，上述29种物质相当于决明子芽提取物的主要构成成分。

[实施例6]从决明子芽提取物中分离的化合物1至5的结构鉴定

为了鉴定上述实施例4和5中所分离的化合物1至5的结构，对各化合物利用质谱仪(massspectrometer，ms)和核磁共振仪(nmr)实施了分析。

(1)化合物1的鉴定

通过利用了agilent1100高效液相色谱-质谱仪(hplc-esi-ms)的ms测定，上述实施例4中所分离的化合物1的分子量确定为664，通过紫外线(perkinelmer343polarimeter)、红外线(thermoscientificnicoletis50)、比旋光度(perkinelmerlambda35)光谱资料、以及利用了核磁共振仪(bruker400mhz,100mhznmr)的¹h和¹³cnmr谱(spectrum)分析，将其结构确定为作为具有下述化学式1的结构的萘并吡喃酮衍生物的7-羟基酸模素-红镰霉素-8'-o-吡喃葡萄糖苷。上述化合物1为目前为止未曾报道的新型化合物，仅在决明子芽中作为主要成分中的一种分离出来，这是由于在决明子或完全生长的决明子植株中不含有或者以极微量含有而未被发现。

[化学式1]

分子式c34h32o14；esi-ms：m/z665[m+h]⁺；红外线吸收带vmax3384、2936、1631、1373、1204、1059cm^-1；紫外线吸收带(meoh)λmax(logε)240(4.3)，282(4.2)；比旋光度[α]²²d-20(c0.05，meoh)；

¹hnmr(甲醇-d4，400mhz)：δ7.18(1h，s，h-10)，6.97(1h，d，j＝2.0hz，h-5)，6.92(1h，s，h-9)，6.34(1h，brs，h-5')，6.12(1h，s，h-3)，5.12(1h，dd，j＝7.5，3.5hz，h-1”)，3.98(1h，dd，j＝12.0，2.0hz，h-6”a)，3.78(1h，dd，j＝12.0，5.5hz，h-6”b)，3.75(3h，s，ome-8)，3.58(1h，t，j＝8.0hz，h-2')，3.55(1h，dd，j＝5.0，2.0hz，h-5”)，3.51(1h，重叠(overlapped)，h-3”)，3.48(1h，t，j＝9.0hz，h-4”)，2.63(3h，s，me-10')，2.41(3h，s，me-11)，1.98(3h，s，me-11')，¹³cnmr(cdcl3，500mhz)：δ208.1(c-9')，184.1(c-4)，170.1(c-2)，161.3(c-8)，160.9(c-5)，156.2(c-6')，156.1(c-8')，154.7(c-6)，152.4(c-10a)，150.9(c-1')，139.8(c-9a)，137.1(c-4'a)，132.4(c-3')，122.4(c-2')，120.6(c-4')，111.9(c-7)，108.4(c-8'a)，106.2(c-5a)，105.8(c-3)，103.1(c-1”)，102.9(c-5')，102.8(c-7')，102.5(c-4a)，101.4(c-10)，97.0(c-9)，77.4(c-5”)，76.7(c-3”)，73.5(c-2”)，69.7(c-4”)，61.0(c-6”)，54.8(ome-8)，31.4(c-10')，19.4(c-11)，16.1(c-11')

(2)化合物2的鉴定

通过利用了agilent1100高效液相色谱-质谱仪(hplc-esi-ms)的ms测定，上述实施例5中所分离的化合物2的分子量确定为272，通过利用了核磁共振仪(bruker400mhznmr)的¹hnmr谱(spectrum)分析，推断为如下述化学式2所示的结构的作为萘并吡喃酮衍生物的异决明内酯(isotoralactone)。此外，将nmr资料与现有文献(kitanaka,s.etal.phytochemistry,1981,20,1951-1953)的资料进行比较，鉴定了其结构。

[化学式2]

分子式c15h12o5；esi-ms：m/z273[m+h]⁺；

¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ13.30(1h，s，oh-10)，9.41(1h，s，oh-9)，6.92(1h，s，h-5)，6.59(1h，d，j＝2.5hz，h-6)，6.56(1h，d，j＝2.0hz，h-8)，4.93(1h，d，j＝2.0hz，h-11)，4.62(1h，d，j＝2.0hz，h-11)，3.90(3h，s，ome-7)，3.80(1h，s，h-4)

(3)化合物3的鉴定

通过利用了agilent1100高效液相色谱-质谱仪(hplc-esi-ms)的ms测定，上述实施例5中所分离的化合物3的分子量确定为272，通过利用了核磁共振仪(bruker400mhznmr)的¹hnmr谱分析，将其结构推断为如下述化学式3所示的结构的作为萘并吡喃酮衍生物的决明内酯(toralactone)。此外，将nmr资料与现有文献(newman,a.g.etal.jamchemsoc2016,138,4219-4228)的资料进行比较，鉴定了其结构。

[化学式3]

分子式c15h12o5；esi-ms：m/z273[m+h]⁺；

¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ13.56(1h，s，oh-5)，9.44(1h，s，oh-9)，7.00(1h，s，h-5)，6.64(1h，d，j＝2.5hz，h-6)，6.55(1h，d，j＝2.5hz，h-8)，6.25(1h，s，h-4)，3.92(3h，s，ome-7)，2.28(3h，s，me-11)

(4)化合物4的鉴定

通过利用了agilent1100高效液相色谱-质谱仪(hplc-esi-ms)的ms测定，上述实施例5中所分离的化合物4的分子量确定为288，通过利用了核磁共振仪(bruker400mhznmr)的¹hnmr谱分析，将其结构推断为如下述化学式4所示的结构的作为萘并吡喃酮衍生物的决明蒽酮(torosachrysone)。此外，将nmr资料与现有文献(gill,m.etal.austjchem2000,53,213-220)的资料进行比较，鉴定了其结构。

[化学式4]

分子式c16h16o5；esi-ms：m/z289[m+h]⁺；

¹hnmr(甲醇-d4，400mhz)：δ9.80(1h，s，oh-9)，6.90(1h，s，h-5)，6.57(1h，d，j＝2.0hz，h-6)，6.51(1h，d，j＝2.0hz，h-8)，3.91(3h，s，ome-7)，3.08(2h，brs，h-4)，2.86(2h，brs，h-2)，1.44(3h，s，me-11)

(5)化合物5的鉴定

通过利用了agilent1100高效液相色谱-质谱仪(hplc-esi-ms)的ms测定，上述实施例5中所分离的化合物5的分子量确定为288，通过利用了核磁共振仪(bruker400mhznmr)的¹hnmr谱分析，将其结构推断为如下述化学式5所示的结构的作为萘并吡喃酮衍生物的红镰霉素(rubrofusarin)。此外，将nmr资料与现有文献(alemayehu,g.etal.phytochemistry,1993,32,1273-1277)的资料进行比较，鉴定了其结构。

[化学式5]

分子式c15h12o5；esi-ms：m/z273[m+h]⁺；

¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ9.68(1h，s，oh-9)，7.00(1h，s，h-10)，6.59(1h，d，j＝2.5hz，h-9)，6.48(1h，d，j＝2.0hz，h-7)，6.04(1h，s，h-3)，3.91(3h，s，ome-7)，2.41(3h，s，me-11)

[试验例1]决明子芽提取物的抗氧化效果评价

(1)决明子提取物和决明子芽提取物的dpph自由基清除效果比较

将上述比较例1中制造的决明子提取物(st)和上述实施例1中制造的决明子芽提取物(sts)各自按照1000ppm、500ppm、250ppm、125ppm的浓度溶解于甲醇后，使100μl的上述比较例1的决明子提取溶液和100μl的上述实施例1的决明子芽提取物分别与100μl的dpph在黑暗条件下反应40分钟，在517nm处测定了吸光度，作为阳性对照组，使用了抗坏血酸(l-ascorbicacid)。将通过上述吸光度测定并用下述式得出的dpph自由基清除效果示于图1。

如图1所示，可知上述实施例1的决明子芽提取物(sts)的dpph自由基清除效果与上述比较例1的决明子提取物(st)相比，在各浓度下均高出1.7倍以上。

(2)决明子提取物和决明子芽提取物的abts在线抗氧化色谱测定结果比较

将上述比较例1中制造的决明子提取物(st)和上述实施例1中制造的决明子芽提取物(sts)以相同的浓度溶解于酒精水溶液，根据下述分析条件，实施了abts在线抗氧化高效液相色谱(hplc)。

abts在线抗氧化hplc分析条件

使用的设备：agilent1200系统

色谱柱：rpc-18hplc柱(4.6×150mm，5μm)

溶剂：(a)含有0.02％的tfa(trifluoroaceticacid，三氟乙酸)的乙腈

(b)含有0.02％tfa的水

流动相组成：在0分钟以(a)溶剂:(b)溶剂的体积比为10:90开始洗脱

从0分钟至30分钟，将(a)溶剂的比例从10％增加至100％

从30分钟至37分钟，用(a)溶剂100％洗脱

流动相流速：0.7ml/min

abts组成：含有0.08mm的abts和0.12mm的过硫酸钾(potassiumpersulfate)的水

abts流速：0.35ml/min

检测器检测波长：紫外线254nm；734nm

其结果，决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)显示出非常不同的抗氧化成分样态。决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)均在保留时间15分钟以前观察到了由具有抗氧化活性的类黄酮、萘衍生物构成的成分，但在决明子芽提取物(sts)中，与决明子提取物(st)相比，上述成分的含量增加的同时，在15分钟以后，进一步观察到了具有抗氧化活性的萘、蒽醌衍生物。图2的(a)和(b)是对决明子和决明子芽提取物实施abts在线抗氧化hplc的结果，是紫外线(uv)检测器分别检测254nm(向上方标记的蓝色线的色谱图)、734nm(向下方标记的红色线的色谱图)波长而得到的色谱。

[试验例2]决明子提取物(st)和在各种光条件下栽培的决明子芽提取物的abts在线抗氧化色谱测定结果比较

将上述实施例1中制造的决明子芽提取物(sts)和上述实施例2中制造的7种在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)溶解于酒精水溶液，根据与上述试验例1相同的分析条件，实施了abts在线抗氧化高效液相色谱(hplc)。

其结果，在上述实施例2的5种在各种光条件下栽培的决明子芽提取物中，共同观察到了具有抗氧化活性的构成成分，但根据光条件，显示出成分的含量变化。图3的a、b、c、d、e、f为分别对作为上述6种决明子芽提取物的sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645、sts-780提取物实施abts在线抗氧化hplc的结果，是紫外线(uv)检测器分别检测254nm(表示吸收254nm的uv的成分的峰)和734nm波长(通过对abts显示出抗氧化作用的成分的峰和峰的面积表示抗氧化程度)而得到的色谱。

基于图3的色谱，对在遮光条件和荧光灯以及各特定波长的光条件下栽培的决明子芽提取物的抗氧化成分概况观察的结果，按照栽培过程中照射的光波长不同，抗氧化成分的含量和组成存在不同，但在特定条件未发现消失或新出现的成分。图3的(a)至(f)的所有色谱中，检测出具有本发明的上述化学式1的结构的新型萘并吡喃酮成分(实施例4中所分离的化合物1)是最显著的抗氧化峰或主要抗氧化峰，具有上述化学式2至化学式5的结构的4种萘并吡喃酮成分(实施例5中所分离的化合物2至5)同样在图3的(a)至(f)的色谱中检测为抗氧化成分。除了在普通的光条件下栽培的决明子芽提取物(sts-c)的色谱(b)和在465nm的led照明下栽培的决明子芽提取物(sts-465)的色谱(d)以外，在(a)、(c)、(e)和(f)色谱中上述实施例4和5中所分离的化合物1至5的有效成分检测出相对高的含量。

[试验例3]实施例1和2的7种决明子芽提取物的视网膜祖细胞(r28)保护效果

为了确认上述比较例1和实施例1中分别获得的决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)、以及上述实施例2中获得的在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645、sts-780)的视网膜祖细胞(r28)保护效果，实施了如下所述的实验。

具体而言，r28细胞在包含有10％的fbs(fetalbovineserum，胎牛血清)、100u/ml的青霉素(penicillin)、100μg/ml的链霉素(streptomycin)的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，达尔伯克改良伊格尔培养基)/低糖(lowglucose)培养基中，在37℃培养箱中，在5％的co2条件下进行培养，每2天使用0.05％的胰蛋白酶(trypsin)传代培养后，在96孔板中以1×10⁴的密度接种，培养24小时。将上述7种提取物以图5的(a)至(c)的浓度处理到上述培养的r28细胞中，2小时后，添加10mm的谷氨酸(glutamate)和0.5mm的bso(buthioninesulphoximine，丁硫氨酸亚砜胺)，培养22小时。然后，为了测定细胞生存率，处理10μlez-cytox并维持2小时，在450nm下测定了uv吸光度。

在图5中，(a)是将在3种浓度下改变上述比较例1的决明子提取物(st)、上述实施例1的决明子芽提取物(sts)、上述实施例2的光条件而栽培的5种决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645、sts-780)保护r28细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果通过细胞生存率表示的结果。在5中，(b)和(c)是将各自的5种浓度下的上述比较例1的决明子提取物(st)和上述实施例1的决明子芽提取物(sts)保护r28细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果通过细胞生存率表示的结果。

如图5的(a)所示，在所有的提取物处理组中，均显示了保护ht-22细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果，但与决明子提取物相比，显示出决明子芽提取物(sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)在绝大部分的浓度中保护r28细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果更优异，特别是，如图5的(b)和(c)所示，确认了上述实施例1的决明子芽提取物(sts)与上述比较例1的决明子提取物(st)相比，r28细胞保护效果显著优异。

[试验例4]从实施例5和6的决明子芽提取物中分离的化合物1至5的视网膜祖细胞(r28)保护效果确认

为了确认上述试验例3的决明子芽提取物(sts)的视网膜祖细胞(r28)保护效果比决明子提取物(st)的效果更优异的原因，比较了实施例5和6的化合物1至5对r28细胞的保护效果。

通过与上述试验例3相同的方法，测定r28细胞的生存率，并且代替比较例1、实施例1和2的决明子提取物(st)、决明子芽提取物(sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)，对实施例5和6的化合物1至5用50μm、16.6μm、5.55μm进行了处理，将其结果示于图6。

如图6所示，显示了化合物1至5保护r28细胞免受由谷氨酸诱发的神经毒性的效果，上述化合物是决明子芽提取物(sts)中含量相对很高或决明子芽提取物(sts)中主要存在的化合物，因此可以确认决明子芽提取物(sts)对r28细胞的保护效果比决明子提取物(st)的效果更优异的原因。

[试验例5]实施例1和2的7种决明子芽提取物的海马神经细胞(ht-22)保护效果

为了确认上述比较例1和实施例1中获得的决明子提取物(st)和决明子芽提取物(sts)、以及上述实施例2中获得的在各种光条件下栽培的决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645、sts-780)的海马神经细胞(ht-22)保护效果，实施了如下所述的实验。

具体而言，ht-22细胞在包含有10％的fbs(胎牛血清)、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的dmem(达尔伯克改良伊格尔培养基)/低糖培养基中，在37.5℃培养箱中，在5％的co2条件下进行培养，每2天使用0.05％的胰蛋白酶传代培养后，在96孔板中以3×10³的密度进行接种，培养24小时。将上述7种提取物以图7的(a)至(c)的浓度处理到上述培养的ht-22细胞中，2小时后，添加5mm的谷氨酸，培养22小时。然后，为了测定细胞生存率，处理10μlez-cytox，维持2小时，在450nm下测定了uv吸光度。

在图7中，(a)是将在3种浓度下改变上述比较例1的决明子提取物(st)、上述实施例1的决明子芽提取物(sts)、上述实施例2的光条件而栽培的5种的决明子芽提取物(sts-c、sts-385、sts-465、sts-645、sts-780)保护ht-22细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果通过细胞生存率表示的结果。在图7中，(b)和(c)是将5种浓度下的上述比较例1的决明子提取物(st)和上述实施例1的决明子芽提取物(sts)保护ht-22细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果通过细胞生存率表示的结果。

如图7的(a)所示，在所有的提取物处理组中，均显示了保护ht-22细胞免受由谷氨酸诱发的氧化应激的效果，特别是，如图7的(b)、(c)所示，确认了上述实施例1的决明子芽提取物(sts)与上述比较例1的决明子提取物(st)相比，显示出优异的ht-22细胞保护效果。

[试验例6]从实施例5和6的决明子芽提取物中分离的化合物1至5的海马神经细胞(ht-22)保护效果确认

为了确认上述试验例5的决明子芽提取物(sts)的海马神经细胞(ht-22)保护效果比决明子提取物(st)更优异的原因，比较了实施例5和6的化合物1至5和比较例2的化合物a至x对r28细胞的保护效果。

通过与上述试验例5相同的方法，测定了ht-22细胞的生存率，并且代替比较例1、实施例1和2的决明子提取物(st)、决明子芽提取物(sts、sts-c、sts-385、sts-465、sts-645和sts-780)，对实施例5和6的化合物1至5用50μm、16.6μm、5.55μm进行了处理，将其结果示于图8。

如图8所示，显示了分别相当于实施例5和6的化合物1至5和比较例2的峰k和峰t的化合物k和化合物t保护ht-22细胞免受由谷氨酸诱发的神经毒性的效果。即，上述化合物1至5为决明子芽提取物(sts)中含量相对非常高或决明子芽提取物(sts)中主要存在的化合物，因此可以确认决明子芽提取物(sts)的ht-22细胞保护效果比决明子提取物(st)的效果更优异的原因。

上述试验例1、试验例4和试验例6中评价的各成分的生理活性如下述表1所示。下述表1涉及从实施例1的决明子芽提取物(sts)中分离的成分的生理活性。

<表1>从决明子芽提取物中分离的成分的生理活性

o显著的活性；x无活性；w弱活性。