紫外线诱导DNA损伤的修复的制作方法

紫外线诱导dna损伤的修复
发明领域
1.本发明涉及dna损伤修复领域，例如由于紫外线辐射引起的损伤，用于例如皮肤保护或皮肤病治疗。更具体地说，涉及组合物、核酸分子和核酸载体。


背景技术：

2.脱氧核糖核酸(dna)是生命的基础物质，在长期进化过程中发生变化，但dna的严格内环境稳定对于短期内维持个体生物是非常重要的。据信当细胞进行基本活动，例如正常的代谢过程时，dna损伤以每天数万个事件的速度发生在每个细胞中，例如内源性dna损伤，起因是复制错误和氧化损伤。外界因素，如紫外线(uv)、电离辐射和环境诱变剂(如烟草烟雾、废气等)也会引起dna损伤。
3.长期过度暴露于紫外线(uv)辐射是最常见的环境健康危害之一，可对大多数生物造成严重的毒性影响。由于细胞活性氧物质(ros)的增加，dna的间接和直接损伤以及免疫反应的抑制，紫外线辐射的有害影响目前被认为是导致光老化和皮肤癌发生的主要危险因素。
4.dna对紫外光能量的吸收可引起各种类型的损伤。虽然单链和双链断裂，以及dna
‑
蛋白质交联，都可能发生，但99％以上的紫外线损伤是由化学碱基修饰引起的。在暴露于紫外线辐射的细胞中，会形成直接和/或间接参与皮肤过早老化和光致癌性的光产物。
5.dna分子暴露于紫外光下引起dna序列中两个相邻嘧啶碱基之间的反应。这些光诱导反应导致这些碱基的二聚化。这会影响正确碱基配对，从而干扰关键细胞过程，如转录和复制。由此产生的物质称为dna光产物或光损伤。dna损伤可导致rna合成的减少，细胞周期进程的阻滞和细胞凋亡的诱导。此外，持续的dna损伤会导致基因突变，使细胞脱离生长控制，最终导致癌症。这些产物具有高度致突变性，包括两种主要类型：环丁烷嘧啶二聚体(cpd)和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光产物(64pp或6
‑
4pp或(6
‑
4)pp)。
6.jans等人在“cpd光解酶转基因对皮肤癌的有效保护”current biology,current science,gb，第15卷，第2期，第105
‑
115页中描述了cpd光解酶和拟南芥(arabidopsis)(6
‑
4)光解酶保护皮肤免受紫外线损伤的保护作用。转基因小鼠同时表达cpd光解酶和6
‑
4pp光解酶，以实现快速的光依赖性修复。使用含有拟南芥(arabidopsis thaliana)6
‑
4pp光解酶cdna的构建物，前导有鸡β
‑
肌动蛋白启动子和cmv增强子，并用人β
‑
珠蛋白基因的3'部分完成。转基因β
‑
肌动蛋白
‑6‑
4pp
‑
pl小鼠与β
‑
肌动蛋白
‑
cpd
‑
pl小鼠共育，获得双转基因动物。nakajima等人在“拟南芥中6
‑
4光产物光修复所需基因(uvr3)的克隆和表征”，nucleic acids research,信息检索有限公司(information retrieval ltd)，第26卷，第2期，第638
‑
644页中描述了拟南芥6
‑
4pp光解酶基因。
7.tanaka等人在“环丁烯嘧啶二聚体和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光产物的光再活化对sos诱导的修复缺陷型大肠杆菌中紫外线诱变的影响”，mutagenesis，第16卷，第1期，第1
‑
6页，公开了用来自大肠杆菌的cpd光解酶和/或来自拟南芥的(6
‑
4)pp光解酶体外处理紫外线
‑
照射的ptn89质粒，并将该物质转染入sos诱导的大肠杆菌。
8.环丁烷嘧啶二聚体是嘧啶环上两个c5
‑
c6双键之间的[2π+2π]环加成反应，产生一种称为环丁烷嘧啶二聚体或cpd的物质。在这种形成过程中，两个嘧啶环通过四元环丁烷环桥接在一起。紫外照射后，细胞内形成的嘧啶二聚体以cpd光产物为主，约占80％。
[0009]
嘧啶(6
‑4’
)嘧啶酮光产物(64pp)是在c5
‑
c6和c4羰基(在胞嘧啶为酮形式的情况下为亚胺)之间的[2π+2π]环加成，且形成由四元杂环桥联的二聚体(对于胸腺嘧啶是氧杂环丁烷，对于胞嘧啶是氮杂环丁烷)。烯烃和羰基之间的这种光反应也被称为帕特诺
‑
比希(patern
ò–
b
ü
chi)反应。氧杂环丁烷/氮杂环丁烷在热力学上不稳定，会分裂成由单个共价键连接的两个环组成的结构。损伤的5'
‑
部分将是嘧啶衍生物，其c6位置与3'嘧啶酮的c4位置共价连接。这种终产物被称为嘧啶(64)嘧啶酮光产物或简称(6
‑
4)光产物或(6
‑
4)pp。尽管(6
‑
4)pp是一种以较少量形成的光产物，但认为它比cpd更具细胞毒性，并且可能占所形成损伤的大约20％。
[0010]
暴露在阳光下是导致皮肤细胞基因突变的主要原因。每年，全世界数百万人患上基底细胞癌和鳞状细胞癌，这是两种最常见的皮肤癌类型。其病因与多种因素有关，包括皮肤类型、与阳光接触的频率和接触指数。此外，慢性uva和uvb暴露引起的皮肤特征性变化，即光老化，是影响更大人群的另一个主要问题。虽然特定个体可能不会因为紫外线诱导的dna损伤而患上皮肤癌，但暴露在紫外线辐射下会通过光老化导致分子紊乱，最终导致皮肤过早老化。
[0011]
慢性紫外线照射相关的皮肤分子紊乱与直接和间接的dna损伤有关。紫外线b(uvb)(300
‑
320nm)长期以来被认为是导致皮肤光老化和皮肤癌的主要原因，而uva(320
‑
400nm)的毒性却被忽略了。光老化和光致癌性的复杂分子紊乱仍不清楚，但紫外线诱导的dna损伤似乎是一个主要的始发事件。
[0012]
证据还表明，特定的分子紊乱
‑
包括端粒缩短和原癌基因的上调
‑
可能在紫外线诱导的生物组织损伤中发挥作用。端粒是一种特殊的dna，由一系列重复的ttaggg组成，形成染色体终止子。它们保护染色体末端不被酶降解，并且在每次细胞分裂后缩短。端粒长度的缩短被认为是皮肤中细胞衰老的代名词。
[0013]
值得注意的是，研究发现与编码区相比，人类端粒对紫外线诱导的dna损伤的敏感性是其7倍，而且端粒中形成的cpd几乎没有去除。虽然重复紫外线照射二倍体成纤维细胞在体外并没有导致端粒缩短，但对于重复紫外线照射对皮肤活检组织中提取的细胞中人类端粒的影响知之甚少。
[0014]
端粒长度在肿瘤发生中也很重要。在这方面，较短的端粒长度在基底角质形成细胞中可能引发染色体畸变，可能导致非黑色素瘤皮肤癌的发生。皮肤暴露于紫外线也导致原癌基因c
‑
fos的表达显著上调，c
‑
fos是人类皮肤癌中高表达的关键转录因子之一。也有证据表明，培养的来源于光损伤皮肤的角质形成细胞高表达c
‑
fos，这反过来可能促进皮肤癌的发展。
[0015]
此外，众所周知，光化性角化病的发展与围绕或待围绕光化性角化病病变的表皮中的亚临床疾病有关，且通常发展出光化性角化病病变。这些亚临床疾病构成了所谓的亚临床区域癌化。在区域癌化中观察到发生光化性角化病病变和/或鳞状细胞癌的可能性很高，这是由于紫外线辐射造成的损害导致具有发生皮肤癌的遗传风险的皮肤区域。包括已经出现光化性角化病病变或非黑色素瘤皮肤癌，并显示细胞损伤(如细胞异型性)或组织学
损伤(如角化不全)的区域，以及在分子水平上表现出与皮肤鳞状细胞癌特征相同的紫外线诱导的基因改变(例如tp53基因表达的突变或改变)的形态正常区域。在本发明中，“亚临床区域癌化”指具有在分子水平上由紫外线诱导的遗传变化的皮肤区域，而在该皮肤区域中，无法发现光化性角化病病变或非黑色素瘤皮肤癌的临床证据。
[0016]
为了抵消紫外线辐射造成的dna损伤的有害影响，所有生物体都产生了一个具有互补底物特异性的修复系统的复杂网络，使dna处于持续监控之下。dna中光损伤的去除是通过多样化和进化的高度保守核苷酸切除修复(ner)途径进行的。
[0017]
ner是一个复杂的多步过程，涉及约30种蛋白质的协同作用，依次执行损伤识别、染色质重塑、含有损伤的小寡核苷酸的切除、缺口填充dna合成和链连接。ner系统由两个亚通道组成。全局基因组ner(gg
‑
ner)在全基因组范围内运作，但其缺点是某些类型的损伤(如紫外线诱导的cpd)没有得到很好的识别，因此修复效率较低。为了防止这种损伤通过阻滞rna聚合酶ii而阻碍转录太久，进化出一种独特的ner亚通路，称为转录偶联修复(tc
‑
ner)。
[0018]
这一过程引导修复机制，优先于活跃转录dna模板链上的阻断的聚合酶，并作为gg
‑
ner修复缓慢或根本不修复的损伤的备选系统起作用。
[0019]
所有类别的许多生物体都另有一个修复系统来去除紫外线损伤，称之为光再活化。与复杂的ner途径不同，光再活化是通过光解酶来实现的，光解酶利用可见光作为能源，通过简单的酶促反应将紫外线损伤快速转换回原始的未受损碱基。为了进行该反应，光解酶配备了两种不同的发色辅因子。根据光解酶的不同，5,10
‑
甲基四氢叶酸(mthf)或8
‑
羟基
‑5‑
脱氮黄素(8
‑
hdf)作为光收集天线，将能量传递给还原的fad，即在二聚体分裂中作为反应中心的发色团。
[0020]
值得注意的是，光解酶对cpd(cpd光解酶)或6
‑
4pp(6
‑
4光解酶)显示底物特异性。光解酶存在于细菌、低等真核生物、植物和包括有袋动物在内的许多动物中。值得注意的是，尽管光再活化具有很强的保守性，但这种修复机制并不存在于胎盘哺乳动物(如人和小鼠)中，这意味着在这个亚类的进化过程中，光解酶基因已经丢失。由于不能光再活化cpd和6
‑
4pp，胎盘哺乳动物只能靠效率较低的ner系统去除这些光损伤。
[0021]
随着非黑色素瘤皮肤癌(nmsc)发病率的上升，目前预防皮肤癌的策略主要集中在建议避免阳光照射、限制青少年使用晒黑床、使用广谱uva和uvb防晒霜以及应用局部抗氧化剂。然而，这些建议并没有充分降低nmsc的流行率，开发新的方法来减少或预防nmsc不仅可以减轻痛苦，而且还可以大大降低医疗保健费用。
[0022]
由于传统的光保护策略实际上完全是预防性的，一旦发生dna损伤就没有任何价值，因此人们对鉴定能够预防、抑制或逆转过早光老化和光致癌性所需的生化变化的化合物，或通过美容或药物干预或饮食操纵产生了相当大的兴趣。通过靶向在nmc发病机制中重要的不同途径，联合多种药物或在局部防晒霜中添加化学预防剂可能为治疗非黑色素瘤皮肤癌提供新的和协同的治疗方法。对于这种光保护的令人困扰的临床问题的一种创新的方法是局部施用外源性dna修复酶。
[0023]
最近建立了两种不同方法：使用内切核酸酶和施用光解酶。内切核酸酶的应用已被证明可临床用于保护具有核苷酸切割修复缺陷的病人免于癌前和恶性皮肤病变。另一方面，在不同生物体中发现的一种异种酶——光解酶的应用，也能够在体内从正常人体皮肤
细胞中去除uvb诱导的cpd，而且似乎比核酸内切酶更有效，甚至比复杂和分步的且消耗atp的核苷酸切除修复或碱基修复机制更有效。
[0024]
核酸内切酶作用的dna修复机制与光解酶有显著差异。核酸内切酶以非光依赖性方式在cpd位点产生dna单链切口。切割机制涉及两种独立的核酸内切酶活性的依次作用：一种dna糖苷酶，其能切割二聚体5'
‑
嘧啶的糖苷键和一种脱嘧啶内切酶，其能切割两种嘧啶之间的磷酸二酯键。
[0025]
光解酶是一类光子驱动的纳米机器黄素蛋白，依赖于一种称为光再活化的直接逆向修复过程。它利用蓝光修复两种紫外线诱导的dna损伤，环丁烷嘧啶二聚体(cpd)和嘧啶酮(6
‑
4)光产物(6
‑
4pp)。因此，它只需要可见光作为能源，其中紫外线诱导的损伤几乎是瞬间发生直接逆转，因为光与导致dna损伤的紫外线辐射同时被吸收。
[0026]
光解酶/隐花色素家族由55
–
70kd的单体蛋白组成，其包含两个非共价结合的人造基团，黄素腺核苷酸(fad)和蝶呤(或在罕见情况下，脱氮黄素)，该家族的所有成员在其fad结合域内具有高度的序列相同性。
[0027]
光解酶有一个能结合dna的磷酸二酯骨架的带正电荷的小沟，和一个用于结合环丁烷嘧啶二聚体或(6
–
4)光解产物的口袋。隐花色素和光解酶之间在这些区域的序列同源性表明，两种酶具有共同的结构和生色团结合性，并可能具有相似的作用机制，尽管还没有发现隐花色素的dna修复活性。隐花色素有一个额外的c末端尾部，延伸超过与光解酶同源的区域，被认为参与信号转导和蛋白质
‑
蛋白质相互作用。光解酶所利用的循环电子转移机制已被很好表征，并可能被证明是揭示隐花色素介导的光转导机制的基础。
[0028]
光解酶家族成员与其他种类的黄素蛋白没有明显的序列同源性，这可能是因为活化的光解酶在其光激发态利用黄素，与利用基态黄素的黄素氧化还原酶相反。光解酶在进化过程中一直存在，在动物、植物和细菌中都有发现。光解酶在古细菌等古生物中都有发现，甚至在某些动物病毒中也发现了光解酶基因。迄今为止，隐花色素仅在动植物中发现，不包括秀丽线虫，尽管在细菌中发现了假定的同源物。虽然有袋动物在进化过程中既保留了光解酶又保留了隐花色素，但胎盘哺乳动物只有隐花色素，在没有光解酶的情况下，后者体内的紫外线光产物只能通过低效的核苷酸切除修复来去除。由于含有这些蛋白质的生物体的多样性，光解酶/隐花色素家族通过三种不同的标准分类：功能，发色团组成和序列同源性。
[0029]
按功能分类时，有三种不同的类别。紫外线产生的大约70
‑
80％的dna光产物是顺式,顺向(cis,syn)环丁烷嘧啶二聚体，每个碱基的c5和c6碳之间形成一个环丁烷环。第一个功能类别，环丁烷嘧啶二聚体(cpd)光解酶，进一步简称为“光解酶”，利用循环电子转移打破该键，导致天然碱基的恢复。然而，cpd光解酶不能修复(6
‑
4)光产物损伤。第二个功能类别与一种称为(6
–
4)光解酶的特定酶有关，该酶特异性结合并修复(6
–
4)光产物。嘧啶
‑
嘧啶酮(6
–
4)光产物占总uv诱导光产物的20
–
30％，通过一种氧杂环丁烷中间体，将5
′
碱基的c6连接到3
′
碱基的c4，并在5
′
碱基的c5处添加羟基形成。这种加合物的修复不能通过破坏(6
–
4)c
‑
c键来实现。(6
–
4)光解酶可能稳定氧杂环丁烷中间体，然后通过电子转移将其拆分以恢复碱基。第三个功能类别涉及隐花色素。“隐花色素”最初是作为一个通用术语创造的，用来描述已知存在但近一个世纪以来未被鉴定的植物蓝光受体。目前，这一术语被用来指不具有dna修复功能但具有已知或推测的蓝光受体功能的光解酶序列同源物。在植物中，隐
花色素响应蓝光调节多种生长过程，是植物生物学研究的重要课题。然而，由于这些色素可能构成哺乳动物和其他生物的初级昼夜节律光受体，因此对隐花色素的兴趣急剧上升。
[0030]
光解酶家族成员也可按发色团组成分类。所有的光解酶和隐花色素都在折叠的酶包埋的一个口袋内非共价地结合主要的发色团——黄素。所谓的“第二发色团”充当光天线，并通过荧光共振能量转移(fret)将激发能转移到催化性fadh辅因子。大多数光解酶，所有已知的(6
–
4)光解酶和隐花色素，含有叶酸(mthf)作为第二发色团，称为“叶酸类”。“脱氮黄素类”代表少数几个物种的cpd光解酶和隐花色素，这些物种可以合成“古老分子”8
‑
hdh，包括灰链霉菌(streptomyces griseus)、巢状无囊藻(streptomyces griseus)和热自养甲烷杆菌。
[0031]
根据序列同源性，先前提出在光解酶/隐花色素家族中有两个功能和发色团组成独立的类，即ⅰ型和ⅱ型。i型光解酶包括大多数微生物的cpd光解酶，所有(6
–
4)光解酶和隐花色素，而ii型光解酶包括动物和植物的cpd光解酶以及一些微生物光解酶。
[0032]
本领域已知通过局部施用5％咪喹莫特乳膏来施用以管控区域癌变。这种乳膏的施用在区域癌变中会引起炎症反应，而在正常细胞中不会引起这种反应，这表明受损细胞中有特殊反应。


技术实现要素：

[0033]
本发明实施方式的一个目的是提供一种能够高效率且有效修复由紫外线辐射诱导的dna损伤(例如在皮肤中)的组合物。
[0034]
本发明实施方式的优点是，可以修复由环丁烷嘧啶二聚体(cpd)和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮((6
‑
4)pp)光产物引起的dna损伤(两者)。虽然光解酶通常具有相似的一级序列和折叠结构，但传统的cpd光解酶修复由其相应的光产物而造成的损伤，不能修复(6
‑
4)pp损伤，反之亦然。
[0035]
本发明实施方式的一个优点是提供一种针对cpd和(6
‑
4)pp光产物两者的重组融合酶。
[0036]
本发明实施方式的优点是，例如在亚临床或美容应用中，可以防止或减少光老化和光致癌。
[0037]
本发明实施方式的优点是，提供一种用于紫外线诱导的dna损伤的具有高比活力(specific activity)的稳定酶。
[0038]
本发明实施方式的一个优点是提供了一种高效和高产的重组系统，其允许例如以高效率和/或低成本生产工业量的dna修复酶。
[0039]
本发明实施方式的一个优点是提供了一种dna修复酶，该酶可以从低成本和高产量系统获得，并且处于纯化状态。
[0040]
本发明实施方式的一个优点是提供了一种用于紫外线诱导dna损伤修复的组合物，该组合物可安全地施用于活细胞。
[0041]
本发明实施方式的优点是可以减少亚临床区域癌变，和/或至少潜在地可以减少现有的光化性角化病病变和/或非黑色素瘤皮肤癌(nmsc)。
[0042]
本发明实施方式的一个优点是提供了一种dna修复酶，其对紫外线损伤，特别是对cpd
‑
和6
‑
4pp光产物均具有特异性。
[0043]
提供具有良好稳定性的dna修复酶是本发明实施方式的优点。
[0044]
提供非细胞毒性和/或非热原性的dna修复酶是本发明实施方式的优点。
[0045]
上述目的是通过本发明所述的方法和装置实现的。
[0046]
在第一方面中，本发明涉及包含重组酶的组合物，该重组酶包含环丁烷嘧啶二聚体光解酶与嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶的融合物，例如，环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶可共同包含在重组酶中。重组酶，例如该融合物，还包含皮肤穿透酶。环丁烷嘧啶二聚体光解酶对应于与seq id no 1具有至少85％序列相同性的氨基酸编码序列，嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶对应于与seq id no 2具有至少85％序列相同性的氨基酸编码序列。
[0047]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，皮肤穿透肽可由dna序列seq id no 3编码。
[0048]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，重组酶可为脱氮黄素光解酶。
[0049]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，重组酶可包含一种或多种标签肽以促进重组酶的纯化。
[0050]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，所述组合物可以还包含运载体和/或赋形剂，以促进该组合物在体内或在体表上的摄取。
[0051]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，运载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时封装至少所述环丁烷嘧啶二聚体光解酶和所述嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶，例如封装所述重组酶的封装材料。
[0052]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，运载体和/或赋形剂可包含脂质体和/或热响应性聚甘油颗粒。
[0053]
在根据本发明第一方面的实施方式的组合物中，该组合物还可以包含增溶剂，皮肤渗透促进剂，防腐剂，保湿剂，胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂，乳化剂，润肤剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，分散剂和/或其任何组合。
[0054]
在第二方面中，本发明涉及一种核酸分子，其包含第一片段，所述第一片段与编码环丁烷嘧啶二聚体光解酶的seq id no:1具有至少85％的序列相同性；和第二片段，所述第二片段与编码嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶的seq id no:2具有至少85％的序列相同性。例如，核酸分子可包括编码环丁烷嘧啶二聚体光解酶的与seq id no:1(基本上)相对应的第一片段，以及编码嘧啶(6
‑
4)嘧啶光解酶的与seq id no:2(基本上)相对应的第二片段。
[0055]
根据本发明第二方面的实施方式的核酸分子可包含第三片段，其与seq id no:3具有至少85％的序列相同性，例如(基本上)对应于seq id no:3。
[0056]
根据本发明第二方面的实施方式的核酸分子可包含用于促进纯化的his标签。
[0057]
在第三方面中，本发明涉及一种核酸载体，其包含根据本发明第二方面的实施方式的核酸分子和有效地在宿主细胞中启动转录和后续的蛋白质合成的转录和翻译控制序列。
[0058]
根据本发明第三方面的实施方式的核酸载体可以与seq id no:4具有至少85％序列相同性，例如可以与seq id no:4具有至少90％序列相同性，例如可以与seq id no:4具有至少95％序列相同性，例如可以基本上与seq id no:4相同，例如，可与seq id no:4相同。
[0059]
在根据本发明第三方面实施方式的核酸载体中，宿主细胞可以是本氏烟草(nicotiana benthamiana)细胞。
[0060]
本发明特定和优选的方面在所附独立和从属权利要求中阐述。可以将从属权利要求中的特征与独立权利要求中的特征以及其它从属权利要求中的特征进行适当组合，而并不仅限于权利要求书中明确所述的情况。
[0061]
本发明的这些和其它方面将参考下文所述的实施方式披露并阐明。
附图说明
[0062]
图1示出了根据本发明实施方式的载体构建物pprp[exp]
‑
camv35s
‑
r光解酶。
[0063]
图2显示在本发明的示范性实施方式的一个示例中，使用phr/uvr3探针对phr/uvr3渗入的本氏烟草总dna的southern印迹分析结果。
[0064]
图3显示在本发明的示范性实施方式的一个示例中，phr/uvr3渗入本氏烟草的蛋白质印迹分析结果。
[0065]
图4显示在用于说明本发明实施方式的一个示例中，使用定制引物对cpd/6
‑
4光解酶渗入的烟草叶的rt
‑
pcr结果。
[0066]
图5显示在用于说明本发明实施方式的一个示例中，显示在接种后随时间间隔的蛋白质表达水平的elisa读数值。
[0067]
图6显示在用于说明本发明实施方式的一个示例中，在超螺旋dna质粒上测量的重组光解酶融合酶的比活性。
[0068]
图7显示在用于说明本发明实施方式的一个示例中，重组光解酶融合酶对比天然光解酶的比较稳定性测定。
[0069]
图8显示在用于说明本发明实施方式的一个示例中，重组光解酶融合酶对nhek细胞生长的细胞毒性作用。
[0070]
图9显示用于说明本发明实施方式的一个示例中，dna损伤诱导的彗星的减少。
[0071]
图10显示用于说明本发明实施方式的一个示例中，cpd/6
‑
4pp阳性细胞的数量。
[0072]
图11显示用于说明本发明实施方式的一个示例中细胞存活率(nhek)的增加。
[0073]
图12显示用于说明本发明实施方式的一个示例中的相对细胞存活率(nhek)。
[0074]
图13显示用于说明本发明实施方式的一个示例中，用荧光显微镜对nhek细胞上cpd/6
‑
4pp二聚物的定量。
[0075]
图14显示用于说明本发明实施方式的一个示例中，用荧光显微镜对人皮肤外植物上cpd/6
‑
4pp二聚物的定量。
[0076]
所述附图仅为示意性而不具限制性。在附图中，一些元件的尺寸可能被夸大且未按比例尺绘画以用于说明目的。
具体实施方式
[0077]
将就具体实施方式并参照某些附图对本发明进行描述，但本发明并不受此限制，仅由权利要求书限定。描述的附图仅是说明性的且是非限制性的。在附图中，一些元件的尺寸可能被夸大且未按比例尺绘画以用于说明目的。所述尺寸和相对尺寸不与本发明实践的实际减小相对应。
[0078]
此外，在说明书和权利要求书中的术语第一、第二等用来区别类似的元件，而不一定是用来描述时间、空间、等级顺序或任何其它方式的顺序。应理解，在合适的情况下，如此使用的术语可互换使用，本发明所述的实施方式能够按照除本文所述或说明的顺序以外的其它顺序进行操作。
[0079]
应注意，权利要求中使用的术语“包含”不应解释为被限制为其后列出的部分，其不排除其它元件或步骤。因此，其应被理解为指出所述特征、整体、步骤或组分的存在，但这并不排除一种或多种其它特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或添加。
[0080]
说明书中提及的“一个实施方式”或“一种实施方式”表示连同实施方式描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定全部指同一个实施方式，但可能全部都指同一个实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
[0081]
类似地，应理解，在本发明的示例性实施方式的描述中，本发明的不同特征有时组合成一个单一实施方式、特征或其描述，这是为了简化公开内容并帮助理解本发明的一个或多个不同方面。然而，本公开内容中的方法不应被理解为反映以下意图：请求保护的本发明需要比各权利要求中明确引用的具有更多的特征。并且，如同所附权利要求所反映的那样，发明方面包括的特征可能会少于前述公开的一个单一实施方式的全部特征。因此，所附权利要求书将被明确地纳入该具体说明，并且各权利要求本身表示本发明的一个独立实施方式。
[0082]
此外，当本文所述的一些实施方式包括一些但不包括其它实施方式中所包括的其它特征时，不同实施方式的特征的组合应意在包括在本发明范围内，并且形成不同的实施方式，这应被本领域技术人员所理解。例如，在所附的权利要求中，所请求保护的任何实施方式可以任何组合形式使用。
[0083]
本文的描述中阐述了众多的具体细节。然而应理解，本发明的实施方式可不用这些具体细节进行实施。在其它情况中，为了不混淆对该说明书的理解，没有详细描述众所周知的方法、步骤和技术。
[0084]
在第一方面中，本发明涉及一种组合物，其包含由dna序列seq id no:1或与seq id no:1具有至少15％的序列相同性的同源序列编码的环丁烷嘧啶二聚体光解酶(如本技术随附的序列表中所详述)。因此，环丁烷嘧啶二聚体光解酶对应于与seq id no 1具有至少85％序列相同性的氨基酸编码序列。seq id no:1序列可对应于嗜热栖热菌(thermus thermophilus)的脱氧核糖二嘧啶光解酶的编码序列，例如环丁烷嘧啶二聚体光解酶可能对应于来自嗜热栖热菌的脱氧核糖二嘧啶光解酶(cpd)全长蛋白，密码子针对本氏烟草物种优化。
[0085]
该组合物包含由dna序列seq id no:2或与seq id no:2具有至少15％的序列相同性的同源序列编码的嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶。因此，嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶对应于与seq id no 2具有至少85％序列相同性的氨基酸编码序列。seq id no:2序列可对应于来自拟南芥的(6
‑
4)光解酶的编码序列，例如嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶可对应于来自拟南芥的(6
‑
4)光解酶全长蛋白，密码子针对本氏烟草物种优化。
[0086]
因此，该组合物通过融合包含环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解
酶的组合。
[0087]
在本发明的范围内还考虑核苷酸序列和所有同源编码序列(其具有至少15％的序列相同性)的n
‑
和c
‑
端截短以及n
‑
和c
‑
端截短形式的构建物。
[0088]
环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶可在单个dna修复酶中偶联，如下文进一步详述，可有利地修复由紫外光(uv)接触引起的dna损伤。这些酶机制需要可见光，优先来自光谱的紫/蓝端，称为光再活化。光解酶结合互补的dna链并破坏某些类型的嘧啶二聚体，这些二聚体是在当同一dna链上的一对胸腺嘧啶或胞嘧啶碱基共价连接时产生的。这些二聚体导致了dna结构膨胀，称为损伤。光解酶对这些损伤有很高的亲和力，并且可逆地结合并将它们转换回原来的碱基。根据dna修复过程中使用的辅因子，如果使用黄素和叶酸作为辅因子，则光解酶归类为叶酸光解酶；如果使用黄素和脱氮黄素作为辅因子，则归类为脱氮黄素光解酶。
[0089]
在本发明的实施方式中，所述组合物进一步包含皮肤穿透肽，例如可包含皮肤穿透域(角蛋白结合肽kbp)，例如促进通过角质层向人类皮肤细胞的递送。
[0090]
皮肤穿透肽可由dna序列seq id no:3或其同源序列编码。因此，皮肤穿透肽对应于与seq id no 3具有至少85％序列相同性的氨基酸编码序列。该序列可对本氏烟草物种进行密码子优化。
[0091]
然而，在根据本发明的实施方式中，还可同样使用例如本领域已知的另一种细胞和/或皮肤穿透肽。将所述肽(例如，根据seq id no:3的前述肽或另一合适肽)掺入包含这些光解酶的重组光解酶融合酶中。
[0092]
皮肤穿透肽可与环丁烷嘧啶二聚体光解酶融合(例如偶联)以实现对角质层的良好穿透，例如使得能够修复由环丁烷嘧啶(cpd)光产物产生的dna损伤。
[0093]
所述皮肤穿透肽或另一皮肤穿透肽可与嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶融合(例如偶联)以实现对角质层的良好穿透，例如使得能够修复由6
‑
4嘧啶
‑
嘧啶酮(6
‑
4pp)光产物产生的dna损伤。
[0094]
在优选实施方式中，所述组合物包含重组酶，即重组光解酶融合酶，其包含环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶融合体。这种cpd光解酶和6
‑
4pp光解酶的工程改造的重组dna修复光解酶融合酶可以在野生型本氏烟草植株上瞬时表达。因此，该重组酶可包含环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶偶联物或由其组成。因此，重组酶可由包含两条催化性核苷酸序列seq id no:1和seq id no:2或其同源物的序列编码。
[0095]
在本发明的实施例中，重组光解酶融合酶是脱氮黄素光解酶。
[0096]
重组酶还可以包括(例如在所述融合物中)皮肤穿透酶，例如根据seq id:3的示范性皮肤穿透酶。
[0097]
蛋白质接头可掺入重组光解酶融合酶的初级结构中，以帮助融合两条或多条蛋白质序列，例如序列seq id no:1、seq id no:2和/或seq id no:3或其组合。这种蛋白质接头可包括柔性接头、刚性接头、体内可切割接头等。
[0098]
重组酶还可包含一种或多种标签肽，例如工程改造入重组光解酶融合酶的初级结构中以促进重组酶的纯化。标签肽可由以下任何一种或任何组合组成：多组氨酸标签、链霉亲和素(生物素结合)标签、鞭毛抗原标签、血凝素标签或谷胱甘肽s
‑
转移酶标签等。
[0099]
在本氏烟草植株中瞬时表达重组融合酶可有利地实现高通量平台以工业规模和/
或低成本生产化合物。然而，本发明的实施方式并不必须限于此，例如，可以同样地使用任何其他合适的表达宿主，包括但不限于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或其他植物表达系统。
[0100]
例如，图1示出用于根据本发明实施方式的组合物中的重组酶的示范性载体构建物。
[0101]
该示例性载体构建物的载体序列包括在seq id no:4中。该6118bp的示例性载体是适合于克隆宿主stbl3或替代菌株的植物常规质粒基因表达载体，其具有对氨苄西林的抗生素抗性。载体组分依次为花椰菜花叶病毒35s启动子、kozak翻译起始序列、p19沉默抑制物、6xhis标签、上文提到的根据seq id no:3的皮肤穿透肽、上文提到的根据seq id no:1的cpd光解酶、柔性融合物接头，如上所述的根据seq id no:2的6
‑
4光解酶、真蛸碱合酶聚腺苷酸化信号、puc复制起始点和氨苄青霉素抗性基因(orf)。
[0102]
根据本发明实施方式，组合物可以由高度纯化形式的重组光解酶融合酶组成，例如，条件是在该组合物中不存在任何其它蛋白质组分。然而，在本发明的其它实施方式中，所述组合物可包含附加组分，如下文简要讨论的，例如形成易于应用的医药或化妆品组合物。
[0103]
重组光解酶融合酶在组合物中的重量百分比可在0.00001％到99.99999％的范围内，例如在0.0001％到99.9999％的范围内，例如在0.001％到99.999％的范围内，例如在0.01％到99.99％的范围内，例如在0.1％到99.9％的范围内，例如在1％到99％的范围内。
[0104]
在本发明的实施方式中，组合物中重组光解酶融合酶的重量百分比约为0.001％，约0.01％，约0.02％，约0.03％，约0.04％，约0.05％，约0.06％，约0.07％，约0.08％，约0.09％，约1％，约1.5％，约2％，约2.5％，约3％，约3.5％，约4％，约4.5％，约5％，约5.5％，约6％，约6.5％，约7％，约7.5％，约8％，约8.5％，约9％，约9,5％，约10％，约15％，约20％，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更多。
[0105]
所述组合物还可包含运载体，例如医药上可接受的运载体，运载体和/或赋形剂，以促进所述组合物在身体内或身体表面上的摄取。运载体和/或赋形剂可包含无毒填充材料或由无毒填充材料组成。运载体和/或赋形剂可包括稀释剂。
[0106]
运载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时包封所述重组酶的包封材料。
[0107]
运载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时包封环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶的包封材料。
[0108]
运载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时包封环丁烷嘧啶二聚体光解酶和嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶以及皮肤穿透酶的包封材料。
[0109]
运载体和/或赋形剂可包含脂质体和/或热响应性，例如树突状聚甘油颗粒。
[0110]
合适的化妆品或药物运载体可以包括本领域已知的任何此类材料，例如，任何液体，凝胶，溶剂，液体稀释剂，增溶剂，聚合物等，其是无毒的，并且不会以有害的方式与组合物的其他成分或皮肤发生明显的相互作用。
[0111]
合适的皮肤穿透增强剂是本领域熟知的，包括低级烷醇，例如甲醇，乙醇和2
‑
丙醇；烷基甲基亚砜，例如二甲基亚砜(dmso)，癸基甲基亚砜(c10 mso)和十四烷基甲基亚砜；吡咯烷酮；脲；n,n
‑
二乙基间甲苯胺；c2
‑
c6烷二醇；二甲基甲酰胺(dmf)；n,n
‑
二甲基乙酰胺(dma)和四氢糠醇等。
[0112]
组合物还可以包含增溶剂，皮肤渗透促进剂，防腐剂，保湿剂，胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂，乳化剂，润肤剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，分散剂和/或其任何组合。
[0113]
增溶剂的实例包括但不限于亲水性醚，例如二甘醇单乙醚(乙氧基二甘醇，可作为商购获得)和二甘醇单乙醚油酸酯(可作为商购获得)；聚氧35蓖麻油，聚氧40氢化蓖麻油，聚乙二醇(peg)，特别是低分子量peg(例如peg 300和peg 400)，和聚乙二醇衍生物，例如peg
‑
8辛酸/癸酸甘油酯(可作为商购获得)；烷基甲基亚砜，例如dmso；吡咯烷酮，dma及其混合物。
[0114]
组合物可适于局部施用。该组合物可在亚临床或化妆品环境中用于预防和/或治疗光老化、光致癌化、光化性角化病、色素性干皮病和(非黑色素瘤)皮肤癌。
[0115]
该组合物可以是药物，或者在药物中使用。组合物可用作化妆品成分。
[0116]
在第二方面，本发明涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，其用作药物。
[0117]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，用于供局部施用，如供在皮肤和/或粘膜上施用的药物。
[0118]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，用于供口腔、粘膜或皮下给药的药物。
[0119]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，其用于治疗和/或预防光老化、光致癌化和/或上皮组织疾病和/或病症(例如光化性角化病、色素性干皮病)和/或(非黑色素瘤)皮肤癌的药物或化妆品。
[0120]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，用于化妆品组合物(例如乳霜或乳液)，以防止光致癌化和/或光老化。
[0121]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，用于化妆品组合物(例如乳霜或乳液)或药物，用于减少由紫外线或引起dna畸变的化学试剂造成的皮肤损伤。
[0122]
本发明的实施方式可涉及根据本发明第一方面的实施方式的组合物，用于治疗光化性角化病、色素性干皮病和/或(非黑色素瘤)皮肤癌患者的癌变区域的药物中。
[0123]
例如，通过本发明的实施方式可以有利地降低具有亚临床癌变皮肤区域的人类受试者中发生光化性角化病病变和/或非黑色素瘤皮肤癌(nmsc)的风险。根据本发明实施方式的组合物可局部应用于患者的皮肤区域癌变。例如，与健康皮肤中的表达水平相比，这种皮肤区域癌变的特征可以是tp53、p21和/或pcna的表达水平增加和/或cpi
‑
17的表达水平降低。
[0124]
例如，可减少由于暴露于紫外线(例如，由于晒黑和/或晒伤)或由于暴露于突变化合物(例如dna嵌入剂、dna甲基化剂)而导致的皮肤老化，包括职业暴露(本文称为光老化和光致癌化)。可局部施用本发明实施方式的组合物。组合物可包含一定量的重组融合酶，皮肤或细胞穿透肽(作为单独分子或作为融合蛋白构建物的一部分)以及可接受且可用于局部施用蛋白质的运载体作为活性成分。局部给药形式包括但不限于精华、喷雾剂、软膏、乳膏、乳液、洗液、凝胶或防晒霜。本领域技术人员已知的各种添加剂可包括在本发明的局部制剂中。添加剂的实施例包括但不限于增溶剂、包括封装方法的皮肤穿透增强剂、防腐剂(例如抗氧化剂)、保湿剂、凝胶剂、缓冲剂、表面活性剂、乳化剂、润肤剂、增稠剂、稳定剂、保湿剂、分散剂和化妆品或药物运载体。
[0125]
本发明的实施方式实现了一种在具有结构畸变的位置切割dna分子的方法，其中dna可在畸变附近被稳定重组的融合光解酶蛋白切割，如上文所述。结构畸变可由单链(ssdna)或双链(dsdna)dna分子中畸变部位紫外线损伤引起的错配所致。对dna的累积损伤可导致皮肤不美观和老化外观，尤其是在面部、颈部和胸部，如果该损伤未被修复，则本发明可以基本上纯的形式供应给皮肤用于体外反应，或可提供用于体内反应，包括但不限于局部施用的组合物(以软膏、药膏、乳膏、乳液、液体或透皮贴片的形式)，其结果是减少对皮肤细胞的损伤和减少皮肤的表观老化。可修复单链dna和双链dna中cpd和(6
‑
4)光产物导致的损伤，结果是减少dna结构畸变和突变引起的皮肤损伤。
[0126]
在本发明的另一方面中，实施方式涉及编码对应于seq id no:1和seq id no:2的多肽片段的核酸分子，并且任选地还涉及seq id no:3或其同源物，以及含有此类核酸或多肽片段的重组细胞、组织和动物，针对多肽片段的抗体、利用多肽片段的实验、含有多肽片段的药物和/或化妆品制剂以及与上述所有相关的方法。
[0127]
根据本发明实施方式的核酸分子可包含与seq id no:1具有至少85％序列相同性的第一片段，其编码环丁烷嘧啶二聚体光解酶，以及与seq id no:2具有至少85％序列相同性的第二片段，其编码嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮光解酶。该核酸分子可进一步包含第三片段，该第三片段与seq id no:3具有至少85％的序列相同性。核酸分子可进一步包含用于促进亲和纯化的标签，例如his标签。
[0128]
在又一方面，本发明涉及核酸载体，根据上文所述的本发明先前方面的实施方式的核酸分子，以及有效地在宿主细胞中启动转录和后续的蛋白质合成的转录和翻译控制序列。
[0129]
图1示出了根据本发明实施方式的载体构建物pprp[exp]
‑
camv35s
‑
r光解酶。
[0130]
核酸载体可包含编码来自嗜热栖热菌的脱氧核糖二嘧啶光解酶的核苷酸序列，例如seq id no:1，以及来自拟南芥的(6
‑
4)光解酶的编码序列或共表达his标签和/或皮肤穿透肽序列，以及有效地在宿主细胞中启动转录和后续的蛋白质合成的转录和翻译控制序列。在表达本发明有his标签的形式时，期望通过蛋白酶切割(例如使用凝血酶)去除his标签部分(优选在亲和纯化，但也包括任何其他适当的纯化方法后)，但是his标签的存在不会对活性，皮肤穿透性(在所体现的皮肤穿透序列或其他皮肤/细胞穿透肽融合蛋白的情况下)或储存期间的稳定性产生负面影响。
[0131]
本文所述的新型工程改造的重组光解酶融合酶可减少紫外线辐射对dna的损伤，从而提高皮肤细胞在紫外线照射下的存活率。因此，该试剂可有利地用于降低和/或预防由阳光照射引起的人类皮肤癌和皮肤光老化的程度或风险。本发明的工程改造的蛋白质可配制成化妆品以及医药产品。
[0132]
使用任何嘧啶二聚体特异性dna糖化酶(pdg)的潜在限制是其底物特异性不包括识别6
‑
4pp。然而，根据本发明实施例的组合物具有非常广泛的底物特异性，其包括cpd和6
‑
4pp两者。
[0133]
令人惊讶地发现，本发明实施方式的重组融合酶的特性，连同易于获得的工艺、纯化和稳定性，使其成为一种合适的分子，可用于亚临床和/或化妆品领域的酶治疗技术的开发。
[0134]
在本氏烟草植株中可以获得大量高度纯化的经生化修饰、活性重组光解酶融合蛋
白。为了促进纯化的重组光解酶融合蛋白通过角质层进入人类皮肤细胞，可将皮肤穿透肽(角蛋白结合肽，kbp)融合到n端。为了促进重组光解酶融合蛋白的迅速和简单的纯化，可将6xhis标签(也称为多组氨酸标签、his6标签和/或六组氨酸标签)附接到蛋白质的n端。我们已经证明重组光解酶融合酶具有酶活性。
[0135]
本氏烟草(n.benthamiana)是一种特别适合在生产环境中瞬时表达重组蛋白的生物反应器。这种小型观赏植物具有较高的叶茎比，在水培栽培中非常高产。本氏烟草可耐受转染载体，并在转染后5
‑
7天内提供最大程度的异源蛋白质合成。扩大这种生物反应器的规模是种植更多的植物，而不是重新设计过程。
[0136]
植物具有所有的真核细胞机器来精确地生产人类和动物的蛋白质。因此，生物反应器是独立植株。植物非常适合表达复杂的蛋白质，如单克隆抗体，并可尽量减少风险，因为不支持人类或动物病原体的生长。
[0137]
对于下文讨论的所有农业渗入试验，使用5至7周龄的本氏烟草植株。
[0138]
本氏烟草种子在温室中生长。本氏烟草幼苗和萌发在led光照下24小时/天，7天/周进行。选择了与光合作用的作用光谱相匹配的红色和蓝色二极管(25％蓝色和75％红色)。其它波长没有生产性。led聚光在植物上。与其他商业解决方案相比，该系统中植物生长到可用成熟度的速度快20％。在26.6℃下，用相同的土壤和肥料使种子萌发。
[0139]
对于感兴趣的基因的生物合成，用两种基因：嗜热栖热菌(菌株hb8/atcc 27634/dsm 579)phr基因(uniprot:p61497，版本95，2017年6月7日)，拟南芥uvr3基因(uniprot:o48652，版本101，2017年10月25日)，皮肤渗透肽序列(aacssspskhcgg)，以柔性融合接头(ggggsggggsggggs)为模板，生物合成新型工程改造的重组融合酶。在基因的5
′
端和3
′
端分别加入ecori和bglii的限制性位点。密码子的使用得到优化，基因合成由genscript公司完成。将完整的2859bp片段克隆到puc57载体中，以便于基因亚克隆入植物表达载体。参见图1以获得载体图谱和所附核苷酸序列seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3。
[0140]
由于天然phr和uvr3基因采用串联稀有密码子，可能降低翻译效率，甚至破坏翻译机制，因此通过将密码子接受指数(cai)由0.70提高到0.88来使用本氏烟草的密码子使用偏好。为了延长mrna的半衰期，对gc含量和不利峰进行了优化。影响核糖体结合和mrna稳定性的茎环结构被破坏。此外，还筛选并成功修饰了负顺式作用位点。
[0141]
为了构建植物表达载体，用ecori和bglii消化，从puc57
‑
r光解酶中切下2859bp的片段化orf，亚克隆到pppp[exp]
‑
camv35s二元载体中，位于35s启动子控制下。通过限制性消化确认转化的集落。从所选集落中提取重组质粒pcambia
‑
phr/uvr3，转化入农杆菌进行农杆菌渗入试验。
[0142]
在2.5kv、25mf和400ω条件下，利用电穿孔技术，将pprp[exp]
‑
camv35s
‑
phr/uvr3构建体转化到根癌农杆菌(a.tumefaciens)菌株gv3101 c58c1和lba4404以及野生型菌株a4、at06、at10和at77中。将转化细胞铺到含50mg/ml氨苄西林(sigma
‑
aldrich)的lb琼脂培养基上。
[0143]
采用先前所述的根癌农杆菌菌株采用农渗法在本氏烟草中瞬时表达。100μ转化的农杆菌冷冻细胞储液接种在5ml lb肉汤(thermo fisher scientific)中，并添加50mg/ml氨苄西林。培养物在28℃孵育过夜，以220rpm振摇。用500μl接种到50ml lb培养基中。培养细胞在28℃孵育，以220rpm振摇，直到培养物达到o.d.600＝0.6。以6000rpm的转速离心收
获细胞，然后再悬浮在50毫升mes缓冲液(10mmmes；ph值5.5，10mm mgcl2)。该混合物与120μm乙酰丁香酮在室温下培养2.5小时，加到渗入缓冲液(1x ms，10mm mes，2.5％葡萄糖)中的农杆菌悬液中。为了研究单糖对vir基因诱导的影响，将不同比例的葡萄糖(0、1、2或4％)添加到渗入缓冲液(1xms、10mm mes、200μm乙酰丁香酮)中的农杆菌悬液中。5
‑
7周龄的本氏烟草在真空室内通过将本氏烟草植株的气生组织浸没到农杆菌悬液中，并施加50
‑
400毫巴真空30、45或60秒渗入。
[0144]
最理想的渗入通常在50
‑
100mbar下进行60秒。一旦真空被破坏，从真空室中取出渗入的本氏烟草植株，用水彻底漂洗，并在与渗入前生长相同的生长条件下生长5
‑
7天。为了避免任何变动性，在每个试验中，对叶片和叶片上的位置，相似年龄的每株植物的同等大小的叶片进行农杆菌渗入。
[0145]
对于southern印迹分析，在不同的时间间隔(渗入后4、6、8、和10天)收获具有pprp[exp]
‑
camv35s phr/uvr3构建体的独立农杆菌渗入叶片，并以未渗入的植物为对照。用dneasy植物dna小试剂盒(qiagen)提取渗入叶片的dna，用核酸内切酶ecori片段化。以从puc57
‑
rphotolyase中释放的重组2859bp片段化orf为探针。分别使用生物素deca标记dna标记试剂盒(thermofisher scientific)和生物素显色检测试剂盒(thermo fisher scientific)进行标记和检测。(参见图2)
[0146]
在蛋白质印迹分析中，收集单片农杆菌渗入的本氏烟草叶片并在液氮中研磨。用sds提取缓冲液(2％sds，0.2％溴酚蓝，10％甘油)提取总蛋白，用14500g4℃离心20分钟澄清上清液。将上清液转移到新鲜试管中，测定蛋白质含量(bradford试验
‑
1976)。总蛋白质(40μg)经sds
‑
page分离后转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。将聚偏二氟乙烯膜封闭至少2小时，然后用兔抗cpd光解酶和兔抗
‑
(6
‑
4)光解酶以1:500稀释液进行检测。充分洗涤后，将膜与以1:5000稀释的适当的二抗孵育，然后与碱性磷酸酶偶联。用bcip/nbt(amresco)进行免疫检测。(参见图3)
[0147]
为了通过实时聚合酶链式反应(rt
‑
pcr)检测嵌合基因，使用illustra rnaspin小试剂盒(ge healthcare)从农杆菌渗入的叶片中提取总rna。设计核心区寡核苷酸对，检测核心区是否存在phr和uvr3基因；正向引物：
[0148]5′‑
gcacgattcagcaagcaagg
‑3′
，反向引物：
[0149]5′‑
cggtacctctacctatttgagttttg
‑3′
。用iii和taq
‑
dna聚合酶进行一步法实时pcr。该反应产生了预期的1352bp的基因核心区片段。(参见图4)
[0150]
采用直接elisa法确认农杆菌渗入后的转基因表达。用elisa提取缓冲液(2％pvp，0.03m na2so3)提取总蛋白。elisa 96孔板(thermo fisher scientific)涂有250μl抗原和总可溶性蛋白，然后在4℃培养过夜。第二天用洗涤缓冲液洗涤平板三次，每次5分钟。加入250μl封闭缓冲液(pbs
‑
吐温20，5％低脂牛奶)，封闭剩余的蛋白质结合位点，室温下培养2.5小时。
[0151]
用pbs和吐温20洗涤后，在阻断缓冲液中1:1000稀释抗
‑
cpd和抗6
‑
4pp抗体，在每孔中加入250μl。平板在37.5℃的湿室内培养3.5小时。将平板倾析并洗涤三次，每次5分钟。向平板中加入250μl底物缓冲液(0.3g(nan3)，96ml二乙醇胺，600ml h2o)，然后在室温下培养直至显色。使用自动elisa阅读仪(biobase 2000)，在630nm波长下最终读取吸光度，每次15分钟。elisa值表示成波长处(λ＝640a
°
)的平均吸光度。与阴性对照(c
‑
)比较,s3、s5、s7、
s10渗入样品经15分钟和30分钟读数时间后显示阳性结果。本氏烟草叶内phr和uvr3基因在渗入后第5天达到最高表达水平，在渗入后第7天和第10天表达水平下降。(参见图5)
[0152]
用固定化金属亲和螯合层析(imac)纯化蛋白。为了将金属离子固定在螯合sepharose fast flow上，使200mm niso4(sigma
‑
aldrich)溶液通过柱(ge life sciences)。用含有0.02％叠氮化物的蒸馏水洗涤柱，以除去过量的niso4。然后用10柱体积的缓冲液anis(50mm tris
‑
hcl，ph 7.4，50mm nacl，100mm咪唑，10mmβ
‑
巯基乙醇，0.02％(w/v)叠氮化物)，流速为3ml/分钟平衡柱。将anis缓冲液中的粗提物加到镍螯合sepharose fast flow(柱体积10ml)色谱柱(ge
‑
life
‑
sciences)上。用至少10柱体积的缓冲液anis洗涤柱，然后切换至线性梯度，将咪唑浓度从100mm(缓冲液anis)增加至500mm(缓冲液bnis，50mm tris
‑
hcl，ph 7.4，50mm nacl，500m咪唑，10mmβ
‑
巯基乙醇，0.02％(w/v)叠氮化物)。
[0153]
为了浓缩靶蛋白，使用超滤。将蛋白质溶液加入体积为10ml或50ml的搅拌槽(millipore sigma)中,并通过截留分子量为30kda的超滤截留盘再生纤维素膜(millipore sigma)。使用离心过滤装置(millipore sigma)根据供应商的说明书，实现小体积蛋白质(300
–
600μl)的浓集。为了保留目标蛋白质，选择了膜的排阻极限。
[0154]
采用紫外/可见光谱法，通过光度法测定蛋白质浓度，符合比尔
‑
朗伯定律：a＝∈λx
·
c
·
d，
[0155]
其中a是吸光度，∈是特定波长λ下的摩尔消光系数，单位为m
‑1cm
‑1，c是吸收样品的浓度，单位为mol
‑
l
‑
1，d是比色皿的路径长度，单位为cm。
[0156]
利用载脂蛋白光解酶的摩尔消光系数∈280nm＝106340m
‑1cm
‑1测定变性条件下蛋白质的浓度。用fad合成酶的摩尔消光系数∈280nm＝28500m
‑1cm
‑1和麦芽糖结合蛋白的摩尔消光系数∈280nm＝66350m
‑1cm
‑1之和测定与麦芽糖结合蛋白融合的fad合酶的浓度。麦芽糖结合蛋白的序列由供应商genscript提供，280nm处的摩尔消光系数由expasy的protparam工具计算(http://www.expasy.ch)。
[0157]
检测比活性，将300ng/μl的含有25个潜在cpd位点和25个潜在6
‑
4pp位点的3217bp超螺旋质粒，在冰上用100j/m2的紫外光照射。将0j/m2和100j/m2辐照的1.5μg质粒(含或不含光解酶)在缓冲溶液(12.5mm na2hpo4、12.5mm nah2po4、1mm edta、0.1mm dtt和100mm nacl)和10mm dtt(thermo fisher science)中以20μl反应体积室温避光孵育5分钟。然后在室温下在近紫外可见光(75w ge黑
‑
光，ge照明)下孵育反应物1小时。将250ng的每个超螺旋质粒样品(与或不与15单位我们的重组融合酶)、缓冲液(12.0mm na2hpo4、12.5mm nah2po4、1mm edta、0.1mm dtt和100mm nacl)在37℃孵育1小时。反应通过1％trevigel 5000凝胶(trevigen)在1x tae缓冲液和20ng/ml溴化乙锭中的电泳进行解析，并在紫外光下观察。正如预期的那样，重组融合酶仅在存在光再活化光的情况下作用于紫外线辐射的dna。该酶在有或无光的情况下没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性，并且对未辐照dna的转化效率没有影响。我们计算出酶的比活力为5x106单位/mg，周转率分别为2.6个二聚体/cpd光解酶分子/分钟和1.8个嘧啶(6
‑
4)嘧啶酮/(6
‑
4)光解酶。1单位在一小时内修复了70％的1μg经100j/m2紫外光照射的超螺旋质粒，在光再活化过程中使用365nm蓝光，速率为2mw/cm。用cpd/6
‑
4pp特异性融合光解酶处理后，修复被检测为超螺旋质粒转变为松弛的开环形式的丧失。(参见图6)
[0158]
此外，重组融合酶在4℃和22℃通过相对稳定性分析证实非常稳定。为了与重组光解酶融合酶溶液相关联，将含有天然cpd光解酶和6
‑
4光解酶活性的组分用牛血清白蛋白(bsa，thermo fisher scientific)调节到20ng/μl的浓度，分成若干管。一半的试管存放在4℃，剩下的试管储存在22摄氏度的温度下。对重组光解酶融合酶溶液使用同样的操作。
[0159]
天然cpd光解酶、(6
‑
4)光解酶和重组光解酶融合酶制备物分别在4℃和22℃下储藏，并在2年的贮藏期内对其酶活性进行扫描。通过琼脂糖凝胶电泳(thermo fisher scientific)定量松弛的经辐照质粒的百分比。天然cpd光解酶和(6
‑
4)光解酶活性在室温下贮藏的第一天都下降了。另一方面，重组光解酶融合酶的活性保持在100％左右，直到贮藏期结束。这些值在4℃保持在75
‑
85％之间，期限为24个月。(参见图7)
[0160]
重组光解酶融合酶可通过角质层直接导入细胞，在细胞中对因损伤(例如由于紫外线辐射或其他可导致单链和双链dna内畸变的有害因素)造成的dna畸变发挥其有益效果。皮肤穿透肽部分(角蛋白结合肽，kbp)与重组光解酶融合酶的融合使我们能够直接将蛋白质输送入人皮肤角质形成细胞(正常人表皮角质形成细胞，nhek，promocell)。角质形成细胞在原理印证研究中很有用，因为它们代表了可以发展成基底细胞癌和鳞状细胞癌的前体细胞，这是长期暴露在阳光下导致的最常见的人类皮肤癌。通过免疫细胞化学和蛋白质印迹分析，确定了将蛋白质导入人皮肤细胞的最佳条件(将细胞与蛋白质在pbs缓冲液中在室温下孵育30分钟)。
[0161]
作为初步研究，进行细胞毒性试验，以确定所用剂量在细胞效应试验中是否耐受和可用。在溶解度试验后选择的条件下，将产物溶解在培养基中。细胞与重组光解酶融合酶一起培养至少24小时。在最后3小时内，将wst1试剂(罗氏)添加到培养基中。该试剂含有四氮唑盐，一种紫色指示剂，被代谢活跃的细胞裂解成黄色指示剂甲变黄的程度与活细胞的数量成正比。在450nm测量吸光度。此外，用显微镜观察细胞形态。处理的最终浓度设定为最高15μg/毫升。
[0162]
通过评估该蛋白质介导的潜在细胞毒性或细胞抑制作用测定了重组光解酶融合酶对nhek细胞生长的影响。接触能够防止紫外线诱导的dna损伤和细胞毒性的重组光解酶融合酶剂量不会对细胞生长或活力产生任何可测量的影响。我们的结论是，在所测试的剂量下，重组光解酶融合酶是无毒的。(参见图8)
[0163]
为了检验重组光解酶融合酶是否能降低紫外线照射对细胞dna的损伤水平，进行了四种类型的研究。
[0164]
第一项研究是基于一种定制的彗星试验，其原理是含有未配对损伤的核dna在紫外线照射和接触碱后片段化，导致碎裂的dna片段迁移出细胞核，形成一个“彗星”，然后对细胞/dna载玻片制备物进行电泳。这种彗星通过染色dna的显微镜检分析来观察和量化。因此，这样的检测测定了细胞dna损伤水平的整体水平。紫外线照射的nhek接触无毒剂量的重组光解酶融合酶后，显示dna损伤诱导的彗星明显减少，表明它可以启动体内紫外线损伤的修复。为了直接评估紫外线照射后人nhek中cpd和(6
‑
4)pp光产物的水平，通过使用抗cpd和(6
‑
4)pp的单克隆抗体直接免疫细胞化学分析证实了这一观察结果。我们的重组光解酶融合酶显示细胞中总cpd和6
‑
4pp水平降低了约45
‑
50％，因此能够启动修复和消除由紫外线引起的人角质形成细胞中的高度细胞毒性的dna损伤。(参见图9和10)
[0165]
为了进一步研究我们的重组光解酶融合酶是否能提高紫外线照射后的细胞存活
率，利用集落形成试验进行了第二项研究。该分析用于在各种紫外线暴露条件下进行多个实验。我们的结果表明，我们的重组光解酶融合酶增加了紫外线照射后nhek的存活率，细胞存活率平均增加约2.5倍，并且我们的重组光解酶融合酶赋予细胞存活率的增加是该dna修复酶特异的，因为对照蛋白绿色荧光蛋白(gfp，thermo fisher scientific)在紫外线照射后孵育没有效果。(参见图11和12)
[0166]
第三项研究是在nhek上进行的，n＝最少3，其中：将nhek接种于96孔板细胞培养基中，37℃、5％co2孵育24小时。用重组光解酶融合酶处理紫外线照射的细胞。然后洗涤细胞，固定于福尔马林。通透化后，细胞与抗体抗cpd和抗
‑6‑
4pp一起孵育，并用与alexa488(alexa488，赛默飞世尔科技公司)连接的二抗显示。最后，用dapi(4'，6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚，二盐酸盐，thermo fisher scientific)标记细胞核。标记的蛋白质将通过自动荧光显微镜(lumascope 720自动荧光显微镜，etaluma)进行观察和定量。用图像分析(image j)对测定的荧光进行分析，并对cpd和6
‑
4pp阳性细胞的数量进行定量。检测到cpd和6
‑
44pp显著降低。(参见图13)
[0167]
第四项研究是在人皮肤外植体(genoskin)上进行的)，这是一种全厚度的皮肤活检，其嵌入固体和滋养基质中，而表皮表面保持与空气接触。皮肤活检牢固地嵌入基质中，防止局部施用的制剂的任何侧向扩散。实验以水凝胶为载体进行，一式三份(n＝3)。处理后，皮肤外植体用福尔马林固定，石蜡包埋，切片。用免疫荧光标记cpd(环丁烷嘧啶二聚体)和6
‑
4pp(嘧啶二聚体：6,4光产物)，并用荧光显微镜(dm5000b，leica microsystems)观察。用图像分析(image j)对测定的荧光进行分析，并对嘧啶二聚体阳性细胞的数量进行定量。检测到cpd和6
‑
44pp显著降低。(参见图14)
[0168]
基于本文提供的数据，我们在人类皮肤角质形成细胞培养系统和人类皮肤外植体系统，两个紫外线光致癌化研究的合适和公认的模型中得出结论：我们的重组光解酶融合酶在细胞接触纯化的蛋白质后穿透细胞并定位于细胞核；启动紫外线辐射引起的细胞毒性、致突变性和致癌性dna损伤的修复；而且它能在无毒剂量下提高紫外线损伤细胞的存活率。我们的重组光解酶融合酶所提供的保护程度在生物学上具有重要意义，因为即使细胞dna修复能力的微小增加也可以转化为对光老化和光致癌化的重要的附加保护作用，特别是在紫外线照射的情况下，否则会导致dna损伤，其特征是单链和双链dna的畸变。
[0169]
此外，我们还证明了通过农杆菌渗入本氏烟草成功实现了一种稳定的、生物有效的生物合成重组光解酶融合酶的表达。另外，用于该重组酶的表达系统能够以较低的成本生产出大量的重组产物，具有原始商业化价值；如果工艺在工业水平上得到优化，在不重新设计工艺的情况下仅需充分扩大种植规模，这种生产水平就仍然可以提高。
[0170]
上述方法包括新型重组光解酶融合酶的制备和纯化方法；以及其作为化妆品和/或医药配方的一部分的用途，其旨在修复由紫外线照射产生的dna损伤和/或细胞异常和/或治疗，防止和预防过早光老化和光致癌化、光化性角化病、色素性干皮病和非黑色素瘤皮肤癌。