抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术：

金黄色葡萄球菌是骨科感染最常见的细菌(rumian,l.,etal.,matersciengcmaterbiolappl,2016.69:p.856-64.；wright,j.a.ands.p.nair,intjmedmicrobiol,2010.300(2-3):p.193-204.)金黄色葡萄球菌可以侵入包括成骨细胞和巨噬细胞在内的宿主细胞，逃避机体的免疫监视和免疫清除作用，并且在宿主细胞内能够存活和繁殖一段时间，从而构成了一个可能导致复发性感染的储库(chwarz-linek,u.,m.andj.r.potts,mol.microbiol.,2004.52(3):p.631-41.)。目前临床所应用的大多数抗生素对胞内菌的作用能力有限，使得感染难以被消除，除非延长抗生素的治疗时间，增加剂量或者联合应用抗生素。这就解释了为什么在应用β-内酰胺类抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染时，抗菌效力会逐渐降低以及急性感染是如何转变为慢性感染的。虽然大环内酯类抗生素能够穿透细胞，但是抗胞内菌效力不足(mor,n.,etal.,antimicrob.agentschemother.,1994.38(12):p.2738-42.)传统抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染的效率正在降低，因此，需要一种新的抗菌药物，除了抗浮游菌，还应在在不损伤宿主细胞的同时有效的抗胞内菌。

抗菌肽在低浓度下对多种微生物(包括在许多情况下对传统抗生素具有耐药性的微生物)有效。传统的抗生素通过靶向细菌生长中的各种生物合成过程(包括蛋白质，rna，dna，肽聚糖和叶酸合成等)来杀死或抑制细菌的生长，而抗菌肽通常不针对特定的微生物分子，而是直接与微生物膜相互作用并迅速渗透，换句话说，它们主要通过裂解机制起作用。它们的氨基酸组成决定了其结构性质，如两亲性、阳离子电荷、形状和大小，有利于与微生物表面的相互作用、插入脂质双分子层，进而破坏稳定并损害细菌膜的物理完整性。目前提出了几种不同的模型来描述这种作用方式的后果，包括桶形壁和环形孔的机理，聚集通道的形成以及类似洗涤剂的地毯效应(brogden,k.a.,natrevmicrobiol,2005.3(3):p.238-50.)。

与传统的抗生素相比，抗菌肽除了具有广谱的抗菌性能，毒性小，还具有其他的生物活性如调节机体的免疫等。其可直接抗菌和通过调节机体防御系统清除细菌，细菌不容易产生耐药性，且抗菌肽可以进入到细胞内发挥免疫调节作用，同时具有复杂及未知的生物活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽及其制备方法与应用，解决传统抗菌药物不能有效抗胞内菌问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽tat-kr-12是通过化学共价接枝将人源抗菌肽ll-37的生物活性片段kr-12与细胞穿透肽tat接合在一起得到。

优选地，所述生物活性片段kr-12的序列如seqidno：2所示。

优选地，所述细胞穿透肽tat的序列如seqidno：3所示，该序列负载正电荷，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。

优选地，所述人源抗菌肽ll-37的序列如seqidno：4所示。

优选地，所述的化学共价接枝具体为：将人源抗菌肽ll-37的生物活性片段kr-12与细胞穿透肽tat通过固相多肽合成法制备，随后用高效液相色谱(hplc)纯化多肽。

本发明还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12在制备抗浮游菌药物中的应用。

本发明还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12在制备抗细胞内细菌感染药物中的应用。

优选地，所述应用中细胞内细菌的类型为金黄色葡萄球菌(atcc25923)，它能够进入细胞内，并且在具有感染能力的同时存活于细胞内一段时间。

本发明还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12在制备抑制炎症反应药物中的作用。

优选地，所述抑制炎症反应为抑制巨噬细胞炎症反应，具体为抑制炎症因子肿瘤坏死因子(tnf-α)，白介素-1β(il-1β)，诱导型一氧化氮合酶(inos)及相关炎症基因的表达。

更优选地，所述巨噬细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7，此细胞株源自雄性abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。

抗菌肽kr-12序列为krivqrikdflr，该序列是一种缘于人源抗菌肽ll-37的生物活性片段。该抗菌肽kr-12除具有较广谱的抗菌能力并且对间充质干细胞没有细胞毒性。细胞穿透肽tat(序列ygrkkrrqrrr,hiv-1tat蛋白残基47-57)负载正电荷，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。目前已经被广泛应用于膜不渗透生物大分子的胞内传递。

细菌内化到细胞内是慢性感染及再次感染的主要原因，目前大多抗菌药物对于细胞内的细菌无效,本发明将抗菌肽kr-12与穿透tat通过固相多肽合成法制备的新型抗菌肽tat-kr-12，在不损害细胞的同时具有抗胞内菌的效果。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种抗浮游菌和胞内菌感染的新型抗菌肽及其应用，通过化学共价接枝的方法将人源抗菌肽ll-37的生物活性片段kr-12与细胞穿透肽tat接合在一起形成一种新型抗菌肽tat-kr-12。新合成的抗菌肽tat-kr-12不仅具有抗浮游菌作用，并且在具有良好的生物相容性的同时具有抗胞内菌的效果，除此之外，这种新型抗菌肽还具有抗炎效果。

(3)本发明的新型抗菌肽的制备方法为固相多肽合成法，使用不溶性高聚物为载体，通过其活性基团将反应物之一固定在高分子载体上，使有机合成在固相上进行的方法，合成后用高效液相色谱(hplc)纯化多肽，纯度在95％以上。该方法技术成熟，工艺简单，效率高，成本低，能够合成具有任意单体序列的多肽。

(3)本发明抗菌肽产品不产生溶血性，生物相容性良好，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌株都具有较好的抗菌作用。更重要的是，针对临床上常用的抗菌药物不能有效抗胞内菌的缺点，本发明的新型抗菌肽抗胞内菌效果良好，并且还具有抗炎特性。所以，本发明产品抗菌肽在治疗临床胞内菌感染中能够得到较佳的应用。

附图说明

图1：本发明的抗菌肽kr-12，tat和tat-kr-12的螺旋投影图；

图2：本发明的抗菌肽kr-12，tat和tat-kr-12的溶血活性检测结果；

图3：本发明的抗菌肽kr-12，tat和tat-kr-12的细胞毒性检测结果；

图4：本发明的抗菌肽kr-12，tat和tat-kr-12的细胞质膜去极化结果；

图5：本发明的抗菌肽tat-kr-12处理后的细菌扫描电镜图；其中，a为金黄色葡萄球菌处理前，b为金黄色葡萄球菌经tat-kr-12(2×mic)处理2小时后，c为大肠杆菌处理前，d为大肠杆菌经tat-kr-12(2×mic)处理2小时后；

图6：本发明的抗菌肽tat-kr-12体外抗胞内菌的结果测定；其中，a为对照组，万古霉素组，tat-kr-12组体外抗胞内菌统计图，b为细菌培养板上生长的单细胞菌落照片；

图7：脂多糖(lps)作用下tat-kr-12的抗炎作用；a为elisa测量炎症因子il-1β的分泌水平统计图，b为elisa测量炎症因子tnf-α分泌水平统计图；

图8：本发明的抗菌肽tat-kr-12体内抗浮游菌及胞内菌测定；a为浮游菌感染皮肤细菌涂板定量；b为在治疗周期中，第3天，5天和7天的小鼠大体照片；c为胞内菌感染皮肤细菌涂板定量；d为在治疗周期中，第3天，5天和7天的小鼠大体照片。

具体实施方式

以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。

1.肽的制备：

通过在rink酰胺mbha树脂上基于标准fmoc的固相合成技术制备肽。二环己基碳二亚胺(dcc)和1-羟基苯并三唑(hobt)被用作偶联剂，并且在每个偶联循环中添加了10倍过量的fmoc氨基酸。在室温下用tfa/h2o/硫代苯甲醚/苯酚/乙二硫醇/三异丙基硅烷(81.5：5：5：5：2.5：1，v/v/v/v/v/v/v)的混合物裂解并脱保护2小时后，将粗制肽重复用乙醚萃取，并在分析型vydacc18柱(长度：250mm，内径：20mm，孔径：粒径：15mm)上通过反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化。使用适当的0-90％水/乙腈梯度洗脱。

采用上述方法合成抗菌肽kr-12，细胞穿透肽tat，以及新型抗菌肽tat-kr-12，各肽的氨基酸序列为：krivqrikdflr(seqidno：2)，ygrkkrrqrrr(seqidno：3)，ygrkkrrqrrrkrivqrikdflr(seqidno：1)。经高效液相色谱分析，每种肽纯度在95％以上。

图1为抗菌肽kr-12，tat和tat-kr-12的螺旋投影图：在二维平面上每种肽段的氨基酸组成及其排列方式。

表1为kr-12，tat和tat-kr-12的物理化学特性。

表1

2.抗菌肽kr-12，tat以及tat-kr-12最小抑菌浓度(mic)的测定：

分别将金黄色葡萄球菌(atcc25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc43300)和表皮葡萄球菌(atcc,35984)，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(mrse,atcc,287)，大肠杆菌(atcc,25922)在mhb培养基中培养至对数生长期，采用改进的临床实验室和标准研究所肉汤微稀释法测定多肽的mic值，以确定其体外抗菌活性。麦氏比浊法调整细菌浓度为1×10⁶cfu/ml。细菌与溶液充分混合后立即各取出100μl细菌悬液置于96孔板中，将多肽溶解于0.01％醋酸和0.2％牛血清白蛋白(bsa)中进行稀释。各取100μlmhb稀释抗菌肽使其浓度分别为1024，512，256，128，64，32，16，8，4，2μg/ml置于96孔板中，每组重复3孔，以含微生物细胞的肉汤培养基为阴性对照，未接种的肉汤培养基为阳性对照。恒温培养箱37℃静态培养24h后记录各组细菌的最低抑菌浓度(mic)。结果判定：取检测不到细菌生长的孔作为最小抑菌浓度。

表2为肽的最小抗菌浓和最小杀菌浓度测定结果，从表中可以看出，接枝细胞穿透肽后，tat-kr-12的体外抗菌和杀菌能力明显增强。说明了新型抗菌肽tat-kr-12不仅抗菌谱广，而且抗菌效果好。

表2

3.抗菌肽kr-12，tat以及tat-kr-12的溶血活性检测：

将新鲜收集人血用肝素离心以除去血沉棕黄层，并将获得的红细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次，以1,000g离心10分钟，并在pbs中重悬至4％(v/v)。用pbs(35mm磷酸盐缓冲液，0.15mnacl，ph7.4)洗涤新鲜人红细胞(hrbc)三次，并以1000g离心5分钟。将pbs中抗菌肽的两倍连续稀释液(浓度测试范围为8，16，32，64,128,256,512,1024μg/ml)加入到96孔板的每个孔中(总体积：100μl)。将等体积(100μl)的4％w/vhrbc的pbs悬浮液加入到每个孔中以达到200μl的最终体积。将板在37℃下孵育1小时，然后通过以1000g离心5分钟使细胞沉淀。将上清液(100μl)转移至透明的96孔板中。通过测量414nm处的吸光度来检测血红蛋白(moleculardevices，sunnyvale，ca，usa)。使用pbs(apbs)测定零溶血的值(阴性对照)，而使用0.1％(v/v)tritonx-100(atriton)确定100％溶血(阳性对照)。溶血百分比计算如下：hemolysis％＝(asample-apbs)/(atritonx-100-apbs)×100

图2为肽的溶血活性检测结果。图中结果表明，即使在浓度高达1024μg/ml时，tat-kr-12没有显示任何明显的溶血活性，说明本发明的新型抗菌肽没有溶血活性，具有良好的生物相容性。

4.抗菌肽kr-12，tat以及tat-kr-12的细胞毒性检测：

从液氮罐中取出含rbmscs冻存管，直接浸入37℃恒温水中进行孵育，并不时摇动使其尽快融化，待其融化后，取出，70％的酒精进行喷洒消毒，放入超净台中，打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液，加到50ml离心管中并加10ml培养液，混匀，离心，1000rpm×5min离心。弃上清，加入10ml培养液重悬细胞，接种至培养皿，37℃培养箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。待细胞长到80％的融合时，胰酶消化收集，用于本实验。利用cck-8检测抗菌肽对rbmscs增殖的影响，96孔板中每孔加100μl上述传代3次以上的rbmscs，使最终细胞量为5×10³个/孔，将96孔板放入恒温培养箱37℃、5％co2条件下培养24h后，小心吸去上清，每孔加入不同浓度的抗菌肽(1000，500，250，100，50，10，5μg/ml)100μl，新鲜培养液作为阴性对照。在预设的时间点(1d，3d，5d)，吸去孔中液体，向每孔加cck-8工作液100μl，96孔板放回培养箱孵育2h，测量450nm的od值。

图3为肽的细胞毒性检测结果。从图中结果可以看出，与不加肽的对照组相比，在第三天，tat-kr-12浓度高达500μg/ml的情况下未显示任何明显的生长抑制作用。在第5天，tat-kr-12在浓度不超过100μg/ml情况下，具有良好的生物相容性。

5.细胞质膜去极化实验：

使用膜电位敏感探针，荧光染料disc3-5(sigmaaldrich)检测到肽诱导的细菌细胞质膜去极化活性。将大肠杆菌atcc25922细菌在细菌培养基mhb中在恒定振荡下以220rpm在37℃培养至对数中期，通过以1000g离心10分钟收获，用洗涤缓冲液(10mmhepes，5mm葡萄糖和50μg/ml^-1的cacl2，ph7.4)洗涤细胞两次，并在同一缓冲液中重悬至2×10⁸cfu/ml。加入disc3(5)的终浓度为1.5μm，并在保持避光的环境温度下孵育，以使染料吸收和荧光猝灭。30分钟后，将细菌细胞在测定缓冲液中稀释50倍，然后将45μl加到384孔黑色聚苯乙烯板(corning，cls3573)中。将tat-kr-12(0.25、1、4xmic)添加到细菌悬浮液中，并使用m1000promulti-mode酶标仪监测荧光变化30分钟。加入不同浓度的肽后，通过disc3-5发出的荧光强度变化(激发λ＝622nm，发射λ＝670nm)来监测膜的去极化。在存在膜选择性荧光探针disc3(5)的情况下测量了肽使膜去极化的能力。disc3(5)，一种荧光探针，集中在通电的膜上，其荧光受膜电位梯度的影响，从而增加了其发射强度。

图4为细胞质膜去极化结果。从图中结果可以看出，在kr-12处理后未观察到荧光增加；相反，在加入tat-kr-12处理后，荧光强度随时间有明显的变化，表明了tat-kr-12能够使细胞质膜去极化。

6.扫描电镜检测抗菌肽tat-kr-12对细菌细胞膜的破坏：

对于扫描电镜样品制备，将大肠杆菌atcc25922和金黄色葡萄球菌atcc25923细菌在细菌培养基mhb中在恒定振荡下以220rpm在37℃培养至对数中期，通过以1000g离心10分钟收获，洗涤三次并用10mmpbs稀释至od600值为0.2。将细胞在37℃下孵育120分钟，其中实验组肽的浓度为2×mic，对照组加入等量的pbs。然后，通过在5000g离心5分钟收获细胞，用pbs洗涤三次，用2.5％(w/v)戊二醛在4℃固定过夜，然后用pbs(ph7.2)洗涤两次。用梯度乙醇(50％，70％，80％，90％和100％)将细胞脱水10分钟，并在100％乙醇中脱水15分钟。然后，将细胞在100％乙醇和叔丁醇和无水叔丁醇的混合物(v：v＝1：1)中转移15分钟。最后，将样品在临界点干燥器中用液态co2脱水，涂覆金钯，然后使用扫描电镜(hitachis-4800，sem)观察。

图5为经tat-kr-12处理后细菌的扫描电镜图。经tat-kr-12(2×mic)处理2小时后，部分金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜被完全破坏，形态完全丧失，而未处理组显示完整的细胞膜结构。

7.抗菌肽tat-kr-12的体外抗胞内菌效果测定：

本节所用细胞为raw264.7巨噬细胞。约5×10⁵的raw264.7接种在24孔板中，细胞在37℃，在含有5％co2的细胞培养箱中培养过夜，以确保细胞粘附。将金黄色葡萄球菌atcc25923细菌在mhb中在恒定振荡下以220rpm在37℃培养至对数中期，通过以1000g离心10分钟收获，洗涤三次，并定量至3×10⁸cfu/ml。约13.3μl(感染复数＝10)定量的细菌感染raw264.7细胞1小时。随后，用冰pbs轻洗细胞2遍，再用含有50μg/ml庆大霉素的培养基培养细胞2小时。去除庆大霉素后，以加pbs组为阴性对照组，万古霉素(10mic)组为阳性对照组，加入抗菌肽tat-kr-12(10mic)的为实验组，再次培养6小时和24小时。在预设的时间点，用tritonx-100冰上裂解细胞15分钟。用冰pbs梯度稀释至适合倍数，将裂解液涂布到细菌培养板上，37℃培养24小时后，计数细菌培养板上生长的单细胞菌落数目，并比较在不同时间点抗菌肽tat-kr-12与万古霉素抗胞内菌的效果。

图6为tat-kr-12体外抗胞内菌的结果测定。从图中可以得出，经过6h和24h的治疗后，万古霉素组抗胞内菌效果较差，和pbs处理组没有统计学差异，而tat-kr-12能够显著抑制胞内菌的繁殖，抗胞内菌效果良好。说明了我本发明的新型抗菌肽在体外能够有效的抗胞内菌。

8.tat-kr-12对脂多糖(lps)诱导的细胞因子的作用：

将raw264.7细胞以5×10⁵/ml的密度铺在24孔培养板上，并孵育过夜。随后，在细胞中加入抗菌肽tat-kr-12，对照组加入无菌pbs，随后共孵育1小时，然后在37℃下用lps(100ng/ml)刺激15-18h。在预设的时间收集细胞上清液，并用酶联免疫吸附法在测定样品中炎症细胞因子tnf-α和il-1β的分泌水平。根据制造商的说明，测定的检出限为：tnf-α为0.12–1000pg/ml，il-1β为1.5–1000pg/ml。

图7为在脂多糖(lps)作用下tat-kr-12的抗炎作用。tnf-α和il-1β的分泌水平，从结果图中可以看出与未加肽的lps组相比，tat-kr-12能够有效抑制tnf-α和il-1β的分泌。说明了tat-kr-12在体外具有抗炎特性。

9.tat-kr-12体内抗浮游菌及胞内菌测定：

6-8周龄的雌性balb/c小鼠(体重25-30g)，购自上海slaccas公司，用于所有实验。

(1)浮游细菌皮下感染模型

对于小鼠背部皮肤，在手术前通过腹膜内注射3％戊巴比妥(1ml/kg-1)麻醉小鼠，并置于无菌悬垂布上以在手术过程中提供无菌条件。此后，将小鼠背部剃毛并用70％洗必泰酒精擦拭，并随机分配到适当的研究组(每组5只小鼠)。接下来，皮下注射与等体积的高压灭菌的1微载体微球(131到220um；sigma-aldrich，美国)混合的5×10⁷cfu/侧翼菌株。细菌接种后一小时，在脓肿附近皮下注射tat-kr-12(20mg/kg)以测定其再体内的抗浮游菌效果，无菌生理盐水作为阴性对照；万古霉素(20mg/kg)作为阳性对照。

(2)胞内菌皮下感染模型

为了进行胞内菌感染研究，通过腹腔注射100μl5×10⁸cfu/mls.aureus感染小鼠。24小时后处死腹腔感染的小鼠，并用5ml预冷的pbs冲洗腹膜。将腹膜洗涤液在台式离心机中在1,500r.p.m，4℃的条件下离心5分钟。收集含有腹腔巨噬细胞，并在37℃下用50μg/ml溶葡萄球菌素处理细胞20分钟，以杀死污染的细胞外细菌。用预冷的的pbs洗涤来自供体小鼠的腹膜细胞3次，以除去溶葡萄球菌素后离心汇集细胞；将来自五只供体的细胞皮下注射到受体小鼠的背部。细胞接种后一小时，在脓肿附近皮下注射tat-kr-12(20mg/kg)以测定其再体内的抗浮游菌效果，无菌生理盐水作为阴性对照；万古霉素(20mg/kg)作为阳性对照。

每24小时给药一次，连续治疗七天。为了评估tat-kr-12对小鼠体内浮游和胞内菌感染的治疗效果，每天检查小鼠的体重，并定期观察伤口并拍照。在治疗结束时将小鼠处死。为了确定感染的组织样品中的细菌数量，将背部脓肿皮肤无菌切除，并在生理盐水(1.0ml)中匀浆，然后铺在tsa琼脂平板上，37℃培养24小时，随后计数脓肿部位的细菌数量。

(3)tat-kr-12体内抗浮游菌效果的测定

图8是tat-kr-12体内抗浮游菌及胞内菌测定。如图8所示，a为浮游菌感染皮肤细菌涂板定量，与未经治疗对照组相比，tat-kr-12治疗组感染部位的细菌明显减少；b为在治疗周期中，第3天，5天和7天的小鼠大体照片：经过万古霉素和tat-kr-12处理的小鼠的皮损坏死面积较小，并且损伤的愈合更快，而对照组中的感染部位皮肤严重化脓，破溃。

(4)tat-kr-12体内抗胞内菌效果的测定

如图8所示，c为胞内菌感染皮肤细菌涂板定量，与未经治疗对照组相比，tat-kr-12治疗组感染部位的细菌明显减少。d为在治疗周期中，第3天，5天和7天的小鼠大体照片：tat-kr-12治疗组小鼠的皮损坏死面积较小，并且损伤的愈合更快，而未经任何治疗的对照组中的感染部位皮肤严重化脓，经过高浓度万古霉素的治疗组，感染虽然被抑制，但是效力要低于tat-kr-12治疗组，7天时大体照片中仍然有脓肿存在。

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<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

<120>抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽tat-kr-12及其制备方法与应用

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