一种体外模拟细胞因子释放对间接靶细胞表型影响的方法与流程

本发明涉及免疫治疗中细胞因子释放研究领域，特是car-t细胞与其对应靶细胞共孵育时其细胞因子释放对间接靶细胞的体外研究。

背景技术：

自2010年以后，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptormodified-tcells,car-t)疗法取得不断突破，在急性淋巴细胞白血病，b细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、等多种血液肿瘤和部分实体瘤显示出良好的疗效。2017年，美国fda批准两项car-t药物上市。car-t广泛应用的同时也带来了许多不良反应，其中最常见最严重的是细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome,crs)。crs是在90年代t细胞单抗okt3治疗中第一次定义的。目前大多数临床常用的单克隆抗体crs发生率较低，但在基于t细胞的免疫疗法中发生率相当高，这些疗法多在临床早起发展阶段，包括双特异性抗体(dual-affinityretargetingantibodies,dart),t-cellreceptormodified-tcells(tcr-t)或car-t，其中car-t治疗后crs发生率最高。car-t治疗后crs，以发热，高血压，凝血功能异常，毛细血管渗漏等为主要表现。接受治疗的患者中，约54-91％发生crs，严重crs发生率为8.3-43％。crs发生的主要机制目前尚不完全清楚，主要是car-t回输到体内后识别抗原阳性的靶细胞(肿瘤细胞或正常细胞)或者其他t细胞肿瘤免疫疗法导致t细胞大量活化、增殖，杀伤靶细胞并且大量释放细胞因子。所释放的细胞因子进一步活化旁观者免疫细胞(单核细胞，巨噬细胞，t细胞，b细胞等)或者非免疫细胞(如内皮细胞)，导致这些细胞释放大量细胞因子，形成瀑布效应从而导致crs的发生，并出现相应的临床症状。[1,2]。

参见附图1，car-t细胞回输后识别肿瘤细胞，活化扩增并释放il-6、il-10、gm-csf、ifn-γ、tnf-α等细胞因子，激活体内免疫细胞如单核/巨噬细胞、t细胞和dc细胞，以及非免疫细胞如内皮细胞，扩大细胞因子释放的数量及种类。此外，il-6及sil-6rα可通过gp130作用于大多数细胞。肾上腺素通过单核/巨噬细胞以及t细胞，在刺激诱导下α1-和α2-肾上腺素能受体水平会升高，并增加细胞因子及儿茶酚胺类激素(肾上腺素，去甲肾上腺素及多巴胺)释放，进一步加重炎症

在crs中，活化的t细胞释放il-2，sil-2rα，il-6，sil-6r，gm-csf，ifn-γ等细胞因子和趋化因子，其他旁观者免疫细胞，如单核/巨噬细胞(释放il-1ra，il-10，il-6，il-8，cxcl10(ip-10)，cxcl9(mig)，ifn-α，ccl3(mip-1α)，ccl4(mip-1β)，以及sil-6r，树突状细胞(dc)等[3]。近两年研究表明，内皮细胞及单核/巨噬细胞的激活，在crs的发生发展中起着越来越重要的作用。[1,4-7]进一步研究crs状态下，机体内正常细胞，尤其是免疫细胞在免疫表型及功能上发挥的变化，成为更深入了解crs的重要途径。

此外，cd123分子是目前aml治疗的重要靶点，但在car-t治疗及单抗药物治疗的临床试验中，出现了造血系统抑制、内皮细胞渗漏综合征(cls)、crs等严重的毒副作用。[8,9]据文献报道，cd123在huvec细胞中可被ifn-γ，tnf-α等诱导表达[10,11]。因此，研究crs状态下cd123在各种细胞中的表达变化情况尤为重要。

但是，目前研究crs的手段尚有限且不够成熟。目前主要有两种已建立的crs模型，一种是用scid-beige小鼠建立的，t细胞及肿瘤细胞是人源的而单核巨噬等细胞时鼠源的，其对crs的模拟程度有一定局限[5]。另一种模型采用的小鼠是基因修饰的人源化nsg小鼠，能产生人il-3，scf和gm-csf，从而促进人t，b及单核细胞发育，更好地模拟crs[4]。但目前建模技术难度较大，成本较高，国内尚无成品，并且无法体现人内皮细胞在crs中的作用。

目前体外研究car-t功能的常用方法是将t细胞与靶细胞共孵育后检测靶细胞凋亡情况以及细胞因子释放。这种方法能够证明t细胞体外直接接触靶细胞所产生的效应，但无法模拟car-t细胞在活化后由于细胞因子分泌而对其他细胞间接产生的影响。transwell通透性支持物是连接于一个塑料杯状嵌套物的多微孔膜的结构，其结构如附图2所示，1为transwell，2为上层隔室，3为微孔膜，4为下层隔室。目前主要应用有转运实验，分泌实验，药物趋向性/侵袭实验及共培养实验。0.4μm孔径transwell允许细胞因子自由通过但是细胞无法通过。为了在体外模拟car-t细胞与靶细胞共孵育后细胞因子分泌对其他细胞的影响，本发明采用transwell设计了一种体外模拟crs状态下研究间接靶细胞免疫表型等指标，应用于体外取了了较好的实验效果，目前该方法国内外均无相关公开。

技术实现要素：

近年来，细胞免疫疗法不断取得突破，尤其是car-t细胞疗法。但是，随着car-t细胞疗法的更多临床试验及应用，crs的防治及机制研究显得越来越重要。目前体外实验方法中，尚缺乏有效模拟crs对其他细胞影响的模型。本模型中，transwell上层隔室中car-t与肿瘤细胞共孵育模拟了car-t回输后在高肿瘤负荷状态下活化及扩增时，大量释放细胞因子的状况。而下层隔室中间接靶细胞处在与car-t及肿瘤相同的细胞因子状态下，但是不会和car-t及肿瘤细胞直接接触，是研究crs状态下细胞因子对间接靶细胞影响的良好的体外模型。

该模型用于体外模拟crs有以下优势：

1.可研究细胞多样，除了内皮细胞，pbmcs中cd3+、cd56+、cd14+、cd11c+细胞，cd34+g-pbmcs，本模型还可用于car-t细胞、肿瘤细胞、平滑肌细胞等多种悬浮或贴壁细胞，研究体外car-t与肿瘤细胞孵育的同时，所释放的细胞因子对间接靶细胞的间接影响，而排除直接接触影响的干扰。例如，在transwell中加入效应细胞与靶细胞，在下层放入同种靶细胞，可对比单独细胞因子作用对间接靶细胞的影响，从而实验直接接触与间接作用效应的分离。

2.car-t细胞回输到人体后，在人体血管腔中或脏器中识别靶抗原阳性细胞释放大量细胞因子，使血液或具体的细胞因子浓度升高。在此过程中，对大量靶抗原阴性的细胞的作用往往是非直接识别造成。本模型相比较直接孵育，更能模拟crs状态下旁分泌以及对远距离细胞的影响。

3.便于收集与检测间接靶细胞。由于有transwell隔开，收集下层隔室细胞可直接用于检测，避免了与上层隔室细胞分离的困难。

4.可排除car-t细胞直接接触间接靶细胞所产生的效应，单独研究细胞分泌物(以细胞因子为主)对间接靶细胞的作用。由于样本取材的限制，效应细胞与间接靶细胞往往不来自于同一供体。如果直接将效应细胞与间接靶细胞共孵育，由于mhc不匹配，可能会产生同种异体排斥反应从而对实验结果造成干扰。采用本模型进行研究，不同供体来源的效应细胞与间接靶细胞可以共同孵育，而不用考虑mhc不匹配所引起的排斥反应对实验的干扰。

附图说明

图1现有技术中crs诱发示意图

图2本发明体外crs模型示结构示意图

图3cd123-car-41bbz-egfr逆转录病毒载体结构示意图sp：信号肽；vl：轻链的可变区；lk：铰链区；vh：重链的可变区；h：cd8a铰链；tm：cd8跨膜区；2a：p2a肽。tegfr：截短型人表皮生长因子受体

图4流式检测细胞表型结果a分选后cd3阳性率及car-t转染后car表达效率b不同肿瘤细胞cd123表达效率

图5采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对huvec的cd123表达水平的影响内皮细胞cd123表达水平变化，数据表示为(n＝6或4)control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图6采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后细胞因子elisa检测结果上清细胞因子检测，数据表示为(n＝3)标识代表与huvec共孵育的细胞。control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图7a图是孵育前g-pbmcs来源cd34+细胞cd34、cd38、cd123阳性率检测；b图是采用该模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对cd34+细胞的cd123表达水平的影响情况control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图8采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd3+细胞的cd123表达水平的影响情况control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图9采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd56+细胞的cd123表达水平的影响情况control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图10采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd11c+细胞的cd123表达水平的影响情况cd11c+细胞cd123表达情况control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图11采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd14+细胞的cd123表达水平的影响情况control组代表未处理组。两样本之间比较采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

具体实施方式

如附图2所示，本发明采用的体外crs模型，包含上层隔室2、微孔膜3和下层隔室4，其中a细胞和b细胞培养在上层隔室里，靶细胞培养在下层隔室里。具体模型建立方法将于下文详述。

一、准备材料

1.标本采集：用edta-k2抗凝管采集aml患者或健康供者外周血标本10ml，通过ficoll密度梯度离心法获取健康人外周血单个核细胞(pbmcs)及原代aml肿瘤细胞。k562，molm-13细胞购于atcc细胞库。人原代脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvec)购于美国sciencell公司。

2.实验用试剂：transwell(12mm底面积，0.4μm孔径；美国corning公司)；rpmi1640培养基(美国gibco公司)；胎牛血清(fbs，法国biowest公司)；磷酸盐缓冲液(pbs，美国gibco公司)；青霉素/链霉素双抗溶液(美国gibco公司)；xvivo-15无血清免疫细胞培养基(美国lonza公司)；淋巴细胞分离液(ficoll，美国ge公司)；cd3/cd28分选及活化磁珠(美国thermofisher公司)；内皮细胞培养基(ecm，美国sciencell公司)；edta-k2抗凝管(中国insepack公司)；磁性颗粒集中仪(mpc，美国thermofisher公司)；乙二胺四乙酸缓冲液(edta,德国macs公司)；cd34microbeadkitultrapure(德国macs公司)；流式抗体(美国biolegend公司)；抗人cd123-apc或pe，抗人cd11c-fitc，抗人cd56-pe，抗人cd3-percp，抗人cd19-fitc，抗人cd14-pe，抗人cd66b-percp，抗人cd38-fitc流式抗体均购置于美国biolegend公司，人tnf-α，ifn-γ，il-2，il-3，il-4，il-6因子elisa检测试剂盒(中国联科生物公司)

二、方法

(一)实验分组

在huvec细胞作为间接靶细胞的实验中，根据不同a细胞及b细胞将实验分为以下12组：对照组、nt组、cart123组、molm-13组、k562组、aml-2组、nt+molm-13组、cart123+molm-13组、nt+k562组、cart123+k562组、nt+aml-2组、cart123+aml-2组。在cd34+细胞及pbmcs实验中，在以上基础上增加了ifn-γ1000iu/ml处理组、tnf-α1000iu/ml处理组、ifn-γ+tnf-α1000iu/ml处理组及il-4100ng/ml处理组。

(二)细胞制备

1.a细胞制备：包括cart123细胞以及nt(未转染组)细胞。靶向cd123的car结构为抗-cd123scfv-41bb-cd3ζ-tegfr(见附图2)。附图3中缩写采集健康志愿者外周血10ml，ficoll分离pbmcs。采用美国thermofisher公司的cd3/cd28磁珠按照cd3+细胞与磁珠1:1比例混合于15ml离心管，室温轻轻晃动40分钟，置于磁力架上，2分钟后轻轻吸去贴壁细胞，加入pbs重悬细胞，400g离心细胞后去上清，加入完全培养基(xvivo-15+10％体积比fbs+il-250iu/ml)，按照5×10⁵/ml细胞数接种细胞。48小时后用逆携带car目的基因的转录病毒感染细胞。每1-2天添加或更换新鲜培养基，细胞密度控制在5×10⁵-2×10⁶/ml。转染后5天检测car表达效率，见附图4的a图。a图为分选后cd3阳性率及car-t转染后表达效率检测，car阳性率可达81.7％，cd3阳性率达92.5％。

2.b细胞制备：靶细胞包括靶抗原阴性：人红白血病细胞系k562(atcc)，以及靶抗原阳性：人急性髓系白血病molm-13(atcc)，以及患者外周血来源原代aml细胞aml-2及aml-3。原代aml细胞选择高肿瘤负荷的aml患者外周血标本，分离获得pbmcs，通过流式细胞仪检测cd45/ssc设门，幼稚细胞群较高组(＞80％)。各靶细胞cd123表达比例见附图4的b图。脐血与pbs按1:2稀释，50ml离心管中加入20mlficoll密度梯度淋巴分离液，倾斜离心管，缓慢加入30ml稀释后各血样至分离液上层。4℃下400×g离心30分钟，吸取中层灰白色单个核细胞层至50ml离心管中，加入5倍体积pbs混匀后400×g离心10分钟清洗2次，加入含0.5％bsaedta缓冲液300μl重悬并计数。采用德国美天尼公司cd34磁珠分选技术，将上述单个核细胞悬液分别加入100μlfcrblockingreagent和cd34microbeadsultrapure混匀后置于4℃冰箱孵育30分钟。孵育完成后加入10mlmacs缓冲液1700rpm离心10分钟，去上清加入macs缓冲液500μl重悬。500μlmacs缓冲液预湿分选柱，将上述悬液过柱子后，500μlmacs缓冲液清洗3次，将分选柱移出磁场，加入2mlmacs缓冲液，迅速用配套活塞推出液体至15ml离心管中，计数备用。通过流式细胞仪检测靶细胞cd123表达水平。

c细胞制备：huvec、人pbmcs以及动员后人pbmcs(g-pbmcs)来源cd34+细胞。huvec在体外用ecm培养基培养至融合度80-90％左右，胰蛋白酶消化至细胞漂浮，加入等量fbs中和胰蛋白酶，再加入5倍体积的rpmi1640培养基400g离心5分钟。离心后细胞去上清，用ecm培养基重悬并按合适密度接种传代。若细胞用于共培养，则用rpmi1640+10％fbs培养基重悬细胞后待接种。为保持huvec性状，实验均采用7代以前huvec细胞。

cd34+细胞制备流程：采用德国美天尼公司cd34磁珠分选技术，将pbmcs分别加入100μlfcrblockingreagent和cd34microbeadsultrapure混匀后置于4℃冰箱孵育30分钟。孵育完成后加入10mlmacs缓冲液1700rpm离心10分钟，去上清加入macs缓冲液500μl重悬。500μlmacs缓冲液预湿分选柱，将上述悬液过柱子后，500μlmacs缓冲液清洗3次，将分选柱移出磁场，加入2mlmacs缓冲液，迅速用配套活塞推出液体至15ml离心管中，计数备用。

(三)细胞共培养

在嵌套有transwell的12孔板中，加入1mlrpmi1640+10％fbs，静置30分钟以上，使培养液在transwell内外平衡。在2mm底面积，0.4μm孔径transwell中(嵌套在12孔板中)，按分组在上层隔室加入相应细胞。

对照组：1.空白对照组：不加入细胞；2.效应细胞单独组：加入1×10⁵cart123或nt细胞；靶细胞单独组：加入5×10⁵靶细胞，分别包括k562，molm-13及原代aml组(在huvec实验中为aml-2，pbmcs及cd34+实验中为aml-3；效应细胞与靶细胞共孵育组，即实验组：靶细胞1×10⁵+效应细胞5×10⁵，分别为nt+molm-13组、cart123+molm-13组、nt+k562组、cart123+k562组、nt+aml-2组、cart123+aml-2组。每组3个副孔，其中对照组多准备6孔以做流式检测对照。在下层加入目标细胞，包括

1.目标细胞huvec：在下层加入用rpmi1640+10％fbs重悬的huvec细胞(7代以前)，使融合度大概50％，总体积为1.5ml。培养36h左右后，小心移去transwell，吸去下层培养基(-80℃冻存以备检测细胞因子)，pbs洗一遍，胰蛋白酶消化细胞后，用等体积fbs中止消化，加入pbs离心细胞，去上清，准备流式检测。

2.目标细胞pbmcs或cd34+细胞：在下层加入用rpmi1640+10％fbs重悬的pbmcs或分选后的cd34+细胞，每孔总体积为1.5ml。培养24-36h左右，小心移去transwell，吸取下层细胞悬液，离心去上清后准备流式检测。

孵育实验中培养基均为rpmi1640+10％fbs。

(四)流式检测

采用bdaccuri^tmc6流式检测仪。通过磁珠分选后的cd34+表型通过fitc标记的cd38，pe标记的cd34，及apc标记的cd123检测。目标细胞为huvec或cd34+细胞时，每孔培养后细胞调整为100μl，加入cd123抗体，并用对照组细胞做一管cd123阴性对照；目标细胞为pbmcs时，将每孔培养后细胞悬液均分为两管，每管细胞悬液100ul，1管加入fitc标记的cd11c，pe标记的cd56，percp标记的cd3，apc标记的cd123；2管加入fitc标记的cd19，pe标记的cd14，percp标记的cd66b，apc标记的cd123，并分别做各通道单标组以做补偿调整以及阴性对照组。

各管涡旋震荡后室温下避光孵育15min，加入适量pbs，500×g室温水平离心5min，弃上清液，加入pbs100μl上机测定。

(五)细胞因子检测

冻存的细胞因子通过elisa检测细胞因子tnf-α，ifn-γ，il-2，il-3，il-4，il-6水平。

三、统计学分析方法

采用graphpadprism7软件进行统计处理，两组之间上述数据比较采用t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。实验结果为三个独立样本重复并表示为平均值±sem。

四、结果

(一)、靶向cd123的car-t细胞鉴定及功能验证

靶向cd123的car-t细胞构建示意图(图1)，

通过包装逆转录病毒感染cd3/cd28磁珠分选活化48h后的t细胞，5天后检测cd3+细胞比例可大于98％，t细胞感染效率可达约80％。(图4a)检测不同细胞来源cd123表达情况。(图4b)k562细胞系几乎不表达cd123，molm-13细胞系、原代细胞aml-2、aml-3均高表达cd123。

(二)、huvec细胞cd123表达比较

在crs模型下层培养36h后各组huvec细胞cd123表达情况。由附图5可见，在靶向cd123的car-t细胞与不同aml细胞孵育时，甚至靶向cd123的car-t细胞单独孵育时，huvec的cd123水平均明显上调。附图5显示了cd123表达平均荧光强度(mfi)的情况。在car-t单独组、car-t与k562、molm-13及aml-2孵育组cd123％及mfi均明显上调。

(三)、elisa检测细胞因子水平比较

crs模型中孵育36小时后培养，通过elisa检测培养上清中不同细胞因子表达情况。(图5)ifn-γ、tnf-α、il-2、il-3、il-4、il-6在car-t细胞与肿瘤细胞共孵育组均明显上调，il-6在car-t单独组也出现明显上调。

(四)、cd34+细胞中cd123表达比较

孵育前，流式检测显示cd34+、cd38+、cd123+比例分别为72.5％，75.6％，56.9％。附图7的a图是孵育前g-pbmcs来源cd34+细胞cd34、cd38、cd123阳性率检测，可以看到在crs模型下层培养36小时后各组cd34+细胞cd123表达情况。附图7的b图是采用本模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对cd34+细胞的cd123表达水平的影响情况，在car-t细胞与molm13、k562、aml-3细胞孵育组，ifn-γ及tnf-α组cd34+磁珠分选后细胞cd123水平均明显上调。

(五)、pbmcs中不同表型细胞cd123表达比较

附图8为采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd3+细胞的cd123表达水平的影响情况，可见cd3+细胞cd123表达无显著差异。

附图9是采用该模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd56+细胞的cd123表达水平的影响情况，可见cd56+细胞cd123变化无显著差异。

附图10是采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd11c+细胞的cd123表达水平的影响情况cd11c+细胞cd123表达情况。从附图10可见cd123％在aml-3组，tnf-α、il-6处理组下调，在nt与k562孵育组，ifn-γ处理组及il-4处理组上调，有显著统计学差异。cd123mfi在molm-13组、nt与molm-13孵育组，nt与k562孵育组，car-t与aml-3孵育组及il-4处理组上调有显著统计学差异，其中il-4处理组上调最明显。在ifn-γ及tnf-α处理组cd123mfi下调有显著统计学差异。

附图11是采用本发明模型研究靶向cd123的car-t孵育与aml肿瘤细胞孵育后对pbmcs中cd14+细胞的cd123表达水平的影响情况。由附图11可知，cd123％没有显著变化，cd123mfi在car-t组，nt与molm-13孵育组，car-t与molm-13孵育组，ct与k562孵育组，nt与aml-3孵育组，car-t与aml-3孵育组及il-4处理组明显上调。

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