一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在制备豆乳中的应用的制作方法

本发明涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在制备豆乳中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

醇类物质是一类重要的挥发性物质，在番茄、苹果和甜瓜果实等天然食品中，醇类物质是其主要的风味物质(乜兰春，孙建设，黄瑞虹.果实香气形成及其影响因素[j].植物学通报,2004,21(5):631-637.)，同时在许多发酵食品中，微生物发酵产生的醇类物质对发酵食品的风味起重要作用。酸豆乳是由乳酸菌发酵豆乳形成的一种新型大豆产品，乳酸菌的代谢有效地降低酸豆乳中的豆腥味和大豆低聚糖，使得其比豆乳具有更为广泛接受度(leblancjg,silvestronia,connesc,etal.reductionofnon-digestibleoligosaccharidesinsoymilk:applicationofengineeredlacticacidbacteriathatproducealpha-galactosidase[j].genetmolres,2004,3(3):432-440.)，但是由于乳酸菌对不同豆腥物质的代谢效果不同，发酵豆乳中残留的豆腥味物质(如2-戊基呋喃)仍制了其消费水平。虽然国内外已有一些研究通过添加水果、牛奶和谷物等辅料来改善其不良风味(codar,laneraa,trania,etal.yogurt-likebeveragesmadeofamixtureofcereals,soyandgrapemust:microbiology,texture,nutritionalandsensoryproperties[j].internationaljournaloffoodmicrobiology,2012,155(3):120-127.)，但仍需从根本上解决导致风味品质不佳的原因，才能更有利于该类产品的发展。

乳酸乳球菌作为一种传统的干酪发酵剂，近年也逐渐被应用在发酵乳中作为附属发酵剂。由于该乳酸菌是植物起源，其在植物基体系中具有一定的应用潜力，但少有研究关注。golomb等人(golombbl,marcoml.lactococcuslactismetabolismandgeneexpressionduringgrowthonplanttissues[j].journalofbacteriology,2015,197(2):371-381.)发现植物环境中分离的乳酸乳球菌在植物体系中具有优良的生长产酸能力，能够用于制备酸豆乳。

以外，目前乳酸菌发酵改善酸豆乳品质的相关研究主要集中在降低豆腥味和改善口感方面，对于通过微生物发酵提高酸豆乳风味品质的研究较少。部分乳酸菌经亮氨酸代谢能产生3-甲基丁醇，一种水果香风味物质，其中包括乳酸乳球菌，而植物起源的乳酸乳球菌在植物基体系中有一定的应用潜力。

综上，研究开发一种高产3-甲基丁醇的乳酸乳球菌，以其作为发酵剂应用于豆乳发酵，以改善发酵豆乳的风味，提升发酵豆乳的品质，是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)ccfm1092，于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60807，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供了一种具有高含量3-甲基丁醇的豆乳的制备方法，所述方法具体步骤为：将保存的乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092接种至培养基中进行培养后，再进行2～3次传代培养，至菌种浓度为10⁸～10⁹cfu/ml接种至大豆豆乳中，使菌株在体系中的终浓度至少为10⁵cfu/ml，将接种好的样品放置于35～40℃的培养箱中发酵6～8h后，再置于2～6℃的环境下进行成熟发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳中的终浓度至少为10⁵～cfu/ml。

本发明提供了一种含有所述乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092的发酵剂，所述发酵剂的制备方法为：取200～600μl的乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092接种于10～30mlmrs液体培养基中，30℃下活化2至3代，待乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092达到10⁸cfu/ml以上活菌数时，8000rpm下离心15min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于10⁶cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，待细胞浓度不低于10⁷cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为生理盐水或ph值为5～8的0.1～1m磷酸盐缓冲液，所述保护剂为浓度为10～25％(w/v)的蔗糖溶液和/或5～20％(w/v)的脱脂乳粉。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水和/或生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为15％～20％(w/v)的蔗糖溶液和/或10～15％(w/v)的脱脂乳粉。

本发明提供了一种发酵剂制备豆乳的方法，所述方法为将发酵剂以1～10％的添加量添加至大豆豆乳中，在37℃中发酵6～8h后，3～5℃下过夜放置，并保持24h～48h发酵得到豆乳。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将发酵剂以2～8％的添加量添加至大豆豆乳中。

在本发明的一种实施方式中，所述大豆豆乳的制备方法为：称取50～200g干大豆加水过夜浸泡，浸泡后的大豆在沸水中煮沸后继续煮1～5min，按照与干大豆质量比1:3～8的比例加入水，50～70℃水研磨5～10min继续煮至沸腾，煮沸后继续煮3～10min，冷却后100～150目纱布过滤，90～120℃灭菌5～15min，冷却到15℃～35℃。

本发明提供了一种所述乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在制备酸豆乳、发酵豆乳饮料中的应用。

本发明提供了一种所述发酵剂在制备豆乳、发酵豆乳饮料中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法安全健康：本发明中应用的乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092是可用于食品的安全菌株；

2、本发明乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092产酸快，6h即能ph降至4.64、达到发酵终点，并能很好地利用豆乳中的蔗糖，蔗糖利用率为65％；

3、本发明乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092能有效提高发酵豆乳中3-甲基丁醇含量，达到476.05μg/kg，并且能有效降低豆乳中主要豆腥味物质2-戊基呋喃的含量，2-戊基呋喃经发酵后未检出，有利于豆乳品质特性的提高。

生物材料保藏

本发明所提供的lactococcuslactissubsp.lactis，于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60807，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在mrs固体培养基上的菌落照片。

图2为乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092的革兰氏染色菌株在1000倍显微镜下的镜检照片。

图3为乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳中生长情况。

图4为乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳发酵过程中ph的变化。

图5为乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳中发酵后蔗糖的含量。

具体实施方式

mrs固体培养基：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、柠檬酸氢二胺2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801ml/l、无水乙酸钠2.0g/l、七水硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、三水磷酸氢二钾2.6g/l，加入蒸馏水完全溶解后按1.5％(m/v)的量添加纯化琼脂粉，115℃灭菌20min。

mrs液体培养基：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、柠檬酸氢二胺2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801ml/l、无水乙酸钠2.0g/l、七水硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、三水磷酸氢二钾2.6g/l，加入蒸馏水完全溶解后，115℃灭菌20min。

活菌数的检测方法：采用国标《gb4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

ph检测方法：采用ph计测量。

蔗糖含量的检测：参考hati等(hatis,vijs,mandals,etal.α-galactosidaseactivityandoligosaccharidesutilizationbylactobacilliduringfermentationofsoymilk[j].journaloffoodprocessingandpreservation,2014,38(3):1065-1071.)的方法采用高效液相色谱(hplc)测定豆乳发酵后蔗糖含量。称取2g豆乳样品加入1.5ml超纯水稀释后60℃孵育10min，依次加入0.25ml0.5mol/l亚铁氰化钾溶液、0.25ml0.5mol/l乙酸锌溶液和1.0ml乙腈，缓慢混合后在室温下静置4h，9000g离心8min，取上清液经0.22μm滤膜过滤后，利用hplc对蔗糖含量进行分析。液相色谱条件：选择waters氨基柱(4.6mmid×250mm)，流动相乙腈：水＝70:30，流速1ml/min，选择蒸发光散射检测器，进样体积20μl。根据标准品出峰时间进行物质定性，用峰面积外标法定量。

挥发性物质含量的检测：参考li等(lic,liw,chenx,etal.microbiological,physicochemicalandrheologicalpropertiesoffermentedsoymilkproducedwithexopolysaccharide(eps)producinglacticacidbacteriastrains[j].lwt-foodscienceandtechnology,2014,57(2):477-485.)的方法采用固相微萃取气相色谱-质谱联用(spme-gc-ms)测定豆乳中挥发性物质的含量。称取5g发酵豆乳样品至20ml萃取瓶中，依次加入1g氯化钠和2μl0.1mg/ml的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液。采用固相微萃取方法提取发酵豆乳中的挥发性成分，萃取探头是涂抹厚度为85μm的car/pdms，萃取探头插入密封的萃取瓶后，萃取头暴露于样品上部的空气中，50℃萃取30min，解吸5min。气相色谱条件及升温程序：选择rtx-wax毛细管(30m×0.25mm，0.25mm)，进样口温度225℃，分流比10，载气(氦气)流速1ml/min。升温程序设置初始温度30℃，保持3min，以15℃/min升温至225℃，保持5min。质谱条件：离子化方式ei，发射能量70ev，发射电流200μa，检测器电压1.4kv，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围m/z30～500。将gc-ms得到的谱图，在nist2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用峰面积归一化法定量。

实施例1：乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092菌株分离鉴定方法

(1)制备合适的样品稀释梯度并培养

将-80℃冰箱中贮藏的云南大理牛乳甘油样品取出，置于冰上解冻。震荡混匀后取0.5ml样品加入4.5ml无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释至10^-1，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5ml稀释液加入4.5ml无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释至10^-2，以此类推，直至稀释到10^-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于mrs固体培养基平板上，倒置，放于37℃厌氧下培养36～48h，并及时观察。

(2)划线分离与纯化

将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，在mrs固体培养基平板上进行二次划线，放于37℃厌氧下培养36～48h至长出单菌落；重复上述划线步骤，直至每个平板上长出单一菌落。

(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验

挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果(革兰氏染色和过氧化氢酶接触实验步骤均可参照《微生物学》杨文博等主编，高等教育出版社，2010)；筛选出革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的菌；筛选出革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的菌。

(4)菌种保存

将平板上长出的每种菌株的单菌落挑入5ml液体mrs培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20～24h，吸取1ml菌液至保菌管中，6000rpm离心3min，倾去上清，加入1ml30％(v/v)无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

(5)16srdna序列扩增

吸取1ml菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行pcr扩增，流程如下：

①扩增体系20μl：

其中模板量为1μl，双向引物各1μl，taq酶mastermix为10μl，ddh2o为7μl。

所用引物为27f：agagtttgatcctggcctca；

1492r：ggttaccttgttacgactt。

②扩增条件：

预变性：95℃3min；第一步变性：94℃1min；第二步退火：60℃30s；第三步延伸：72℃2min；将第一步至第三步进行30次循环；第四步最后延伸：72℃5min；第五步保持：12℃10min。

(6)琼脂糖凝胶电泳

称取80ml琼脂糖加入锥形瓶中，加入80ml1xtae，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μl核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入pcr扩增产物，每个孔中加入2μlpcr扩增产物，120v下跑胶15min，结束后取出置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录pcr成功样品的编号，将成功的pcr产物置于4℃冰箱中保藏。

(7)测序与鉴定

将pcr成功的样品送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行检测，根据反馈的序列结果，在美国国家生物技术信息中心(ncbi)序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行blast检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。经分析鉴定，本发明提供的菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)。

(8)菌株保藏

将步骤(7)中的菌株于2019年10月16日于广东省微生物菌种保藏中心进行保藏。

实施例2：乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳中生长特性

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092接种于液体mrs培养基中，在30℃下培养24h后，以2％(v/v)的接种量接种至新鲜液体mrs培养基中，进行传代培养，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/ml。取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于大豆豆乳中，使体系中的活菌数达到10⁶～10⁷cfu/ml。将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔3h取样，检测发酵过程中活菌数的变化，结果如图3所示。由图3可知，发酵6h后菌株ccfm1092活菌数增量达到1.94个数量级。

实施例3乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳中的产酸特性

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092接种于mrs培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/ml。取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于豆乳中，使体系中的活菌数达到10⁷cfu/g。将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔3h取样，检测发酵过程中ph的变化，实验结果如图4所示，发酵6h后菌株ccfm1092的ph降至4.64，到达发酵终点(豆乳发酵至ph为4.5～4.7时即达到发酵终点)，因此菌株ccfm1092有较快的产酸速率。

实施例4：乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在豆乳发酵中的应用

大豆豆乳的制备方法：称取干大豆100g加1l去离子水过夜浸泡，浸泡后的大豆在沸水中煮沸后继续煮2min，加入600ml去离子水60℃研磨6min继续煮至沸腾，煮沸后继续煮5min，冷却后用120目纱布过滤，105℃灭菌10min，冷却至室温。

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/ml。取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于大豆豆乳中，使体系中的活菌数达到10⁶～10⁷cfu/ml，将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵。

(1)测定发酵后豆乳中含糖量，如图5所示。由图5可知，发酵前豆乳中蔗糖含量为2.70g/l，乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在到达发酵终点(6h)后蔗糖含量较低，为0.93g/l，蔗糖是大豆豆乳中主要的碳水化合物，因此筛选的乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092具有在大豆豆乳中发酵的潜力。

(2)测定发酵后挥发性物质含量，如表1所示。由表1可知，乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在发酵6h后，酸豆乳中未检出豆腥味物质2-戊基呋喃，3-甲基丁醇含量为476.05μg/kg，3-甲基丁醇是一种重要的风味物质，因此筛选到的乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092产香特性优良。此外，乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092在发酵6h后，酸豆乳中2,3-丁二酮和乙偶姻含量分别为34.89μg/kg和13.93μg/kg，它们是奶香味的主要物质，有助于改善发酵豆乳的风味；而乙酸、己酸和辛酸含量分别为78.18μg/kg、15.31μg/kg和4.40μg/kg，有助于改善发酵豆乳的品质。

表1豆乳中挥发性物质含量

对比例1

具体实施方式同实施例2，区别在于，将ccfm1092替换为来源于中国青海西宁地区曲拉样品中筛选出的乳酸乳球菌乳酸亚种dqhxnq05m30，其筛选过程同乳酸乳球菌乳酸亚种ccfm1092发酵后活菌数增量为1.30个数量级。

对比例2

具体实施方式同实施例3，区别在于，将ccfm1092替换为来源于中国青海西宁地区曲拉样品中筛选出的乳酸乳球菌乳酸亚种dqhxnq05m30，发酵6h后ph仅降至6.14，且发酵12h后ph仅降至6.18，且仍未到达发酵终点。

对比例3

具体实施方式同实施例4，区别在于，将ccfm1092替换为来源于中国青海西宁地区曲拉样品中筛选出的乳酸乳球菌乳酸亚种dqhxnq05m30。

(1)测定发酵后豆乳中含糖量，发酵6h后蔗糖含量为1.76g/l，发酵12h后蔗糖含量为1.72g/l。

(2)测定发酵后挥发性物质含量，如表1所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。