一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法。

背景技术：

原代人肝细胞(phh)被认为是肝细胞治疗的最理想细胞，更是药物代谢评估和建模研究的金标准细胞。但是在phh体外培养过程中，极低的增殖速率以及代谢功能的缺失阻碍了phh的应用。其重要原因在于，终末分化细胞在体内功能的稳定高度依赖于微环境信号的精确时空调控，而分离出的原代细胞通常会失去其核心基因表达特征和特定功能。为了攻克这个难题，研究者提出了很多用来体外长期维持肝细胞功能的方法，包括3d成球培养，胶原-凝胶三明治培养，与非实质细胞共培养，肝基因的表观调控以及通过增加氧供等方式优化培养微环境。但这些培养方法需要特殊的培养设备和复杂操作技术，这就在一定程度上限制了phh用于评估药物有效性分析方法的选择，以及在高通量测序中的适用性。(参考文献：gómez-lechónmj,tolosal,condei,etal.competencyofdifferentcellmodelstopredicthumanhepatotoxicdrugs.expertopindrugmetabtoxicol,2014,10(11):1553-1568.；xuj,duy,dengh.directlineagereprogramming:strategies,mechanisms,andapplications.cellstemcell,2015,16(2):119-134.)

deng在研究中发现，通过使用5个小分子(5c培养基)：forskolin,sb431542,dapt,iwp2和ldn193189，可以维持低温保存和新鲜分离的phh的肝功能长达30天，并且5c培养的肝细胞具有cyp代谢活性以及乙肝病毒感染的能力。(参考文献：xiangc,duy,mengg,etal.long-termfunctionalmaintenanceofprimaryhumanhepatocytesinvitro.science,2019,364(6438):399-402.)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法。鉴于细胞功能的体外长期维持需要复杂的信号调节网络，我们发明了一种使用小分子组合的化学策略通过调节内在信号网络以实现对特定细胞靶点的调控。这种体外通过小分子组合长期维持肝细胞数量和功能的方法，在药物代谢评估和体外建模中具有一定应用价值，为药物代谢评估和肝细胞治疗提供了基础保证。

本发明的第一方面，提供一种在体外长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法，所述的方法为以2×10⁴-3×10⁴/cm²接种密度，在肝细胞扩增培养基中培养人原代肝细胞(低于这个密度，原代肝细胞会发生可逆转化，转化为肝前体细胞；高于这个密度，原代肝细胞可能会出现细胞密度过高，加速肝细胞衰老死亡进程)。

进一步的，所述的接种密度为3×10⁴/cm²。

进一步的，所述的肝细胞扩增培养基为：

液体基础培养基为dmem/f12，1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，50ng/ml表皮生长因子，20ng/ml白介素-6，20ng/ml肝细胞生长因子，20ng/ml成纤维细胞生长因子-2，1μm的chir9902，10μm的y-27632，1.25μm的acetylcysteine和1μm的a83-01。

在本发明的一个实施方式中，所述的在体外长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法，具体为：

a)生物安全柜中，将10ml培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热20分钟；

b)将冻存的原代肝细胞从液氮迅速转移至37℃恒温水浴锅中，在水中顺时针旋转解冻约90-120秒，直至冻存管中只有小块碎冰漂浮；

c)利用钝枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至含有10ml预热的肝细胞扩增培养基的15ml离心管中，轻微上下颠倒2-3次混匀；

d)室温放置30-45分钟后(每15分钟轻轻颠倒混匀一次)，再进行低速离心(50×g，常温离心5分钟)；

e)去上清，用5ml肝细胞扩增培养基重悬细胞，用台盼蓝排除法测定肝细胞的存活率和细胞总量；

f)按活细胞数2×10⁴-3×10⁴/cm²(优选3×10⁴/cm²)密度，接种到胶原包被培养板中摇匀，在37℃/5％二氧化碳培养箱中培养；

g)培养6-8小时后，观察贴壁状态，换液；之后每2天换液一次。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的在体外长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法培养得到的原代肝细胞在药物研发中的应用。

本发明优点在于：

本发明通过在肝细胞扩增培养基中高密度培养，可以至少在30天内维持原代肝细胞(phh)功能，用于原代肝细胞的药物研发，为原代细胞体外长时间培养和功能维持提供新的方法。

附图说明

图1.原代肝细胞形态；

图2.原代肝细胞功能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

一、实验材料

本实施例所用的重组蛋白hgf购于peprotech公司；而其余的小分子化合物如y27632、a83-01和chir99021等均购于targetmol公司；所用的原代细胞购于bioreclamationivt公司，并使用特定的细胞培养基(即肝细胞扩增培养基)培养；青霉素与链霉素双联合抗生素以及后续用于原代肝细胞维持实验所用的基础培养基购于源培生物科技公司；胎牛血清(fbs)购于gibco公司；培养的原代肝细胞所用的基质胶matrigel均购于bd公司。

二、实验方法

1、细胞复苏及接种

将冻存的细胞从液氮罐取出后，迅速于37℃水浴锅中摇晃直至其完全融化，4℃，700rpm离心3分钟后，弃尽上清，加入1ml新鲜培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液。将制备好的单细胞悬液按照一定比例稀释好后，取20ul细胞悬液轻轻靠近细胞计数室的斜面，待其虹吸进细胞计数室后，在显微镜下观察并分别计数四大方格内的细胞总数，并按照下面的公式计算细胞浓度：细胞浓度＝细胞数/毫升原悬液＝四大格细胞总数×10000×稀释倍数/4。按照2×10⁴-3×10⁴/cm²接种密度进行接种，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中进行培养，每隔2-3天换液。

2、细胞形态学观察

先用肉眼对培养细胞的培养基颜色和澄清度进行初步观察，然后在显微镜低倍和高倍镜下仔细观察细胞的形态、密度和生长状态进行仔细观察，并选取代表性视野进行拍照记录。

3、细胞分泌alb，aat检测

用条件培养基维持原代肝细胞状态，每3天留取一次细胞上清，在留取上清前24小时，更换新鲜培养基，隔天收集上清，冻存于-80℃冰箱备用。根据alb和aatelisa试剂盒，进行定量检测。

4、尿素合成及氨清除检测

将3mmnh4cl溶液加入细胞培养孔中，反应24h后将反应后的上清吸取1ml于1.5ml的ep管中，3000rpm离心5min，去沉淀，吸取800ul上清于新的1.5ml的ep管样品备用，将细胞用pbs清洗2次，加入1ml0.25％t/e消化5min，counterstar细胞计数仪计数。按照尿素分析试剂盒进行样本检测，将得到的od值代入标准曲线公式中，求出相应尿素浓度。

5、统计学分析

采用graphpad7生物统计软件对相应的实验数据进行分析，采用双尾非配对t检验和one-wayanova方差分析比较两组或多组不同处理之间的差异。所有的统计数据，至少使用了三个独立的样品或重复实验的数据，数据均以means±s.e.m.的形式表示，其中ns为无显着性，*p<0.05被认为存在统计学差异，其中**，p<0.01，***，p<0.0001。

三、实验结果

1、原代肝细胞形态学

用肝细胞扩增培养基进行原代肝细胞的状态维持，分别于细胞培养的第0，3，7，14，21，24，28天镜下观察细胞形态并拍照。

实验结果：见图1，通过形态学观察，经过28天培养，肝细胞能够维持多角形形态，基本与原代肝细胞形态一致。

2、原代肝细胞功能

分别于细胞培养的第0，3，7，10，14，21，28天留取培养细胞的上清，分别用elisa方法检测细胞alb，aat分泌水平，尿素检测试剂盒检测细胞尿素合成能力以及氨清除试剂盒检测肝细胞解毒能力。

实验结果：见图2，通过elisa方法检测，肝细胞扩增培养基可以在一个月内有效维持肝细胞对alb和aat的分泌能力，同时，尿素合成和氨清除能力与原代维持在同一水平。

综上所述，通过在肝细胞扩增培养基中高密度培养，可以至少在30天内维持原代肝细胞(phh)功能，为原代细胞体外长时间培养和功能维持提供了新的方法。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。