一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂及提取方法。

背景技术：

脂肪血管基质组分(stromalvascularfraction，svf)是脂肪组织经消化、离心去除成熟的脂肪组织、结缔组织，得到一种含间充质干细胞(6.7％)、内皮前体细胞(2％)和单核细胞/巨噬细胞(10％)等多种细胞的混合物。脂肪组织及骨髓中均可提取出svf细胞，但在脂肪组织中，1％～10％的有核细胞被认为是干细胞，而骨髓中只有0.0001～0.01％的有核细胞是干细胞。可以从一克脂肪组织中获得的干细胞数量约为5000-200000个细胞。

svf细胞中的干细胞可分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子和外泌体。这些物质对周围组织器官有积极的影响，如缓解炎症、改善微循环等。植入组织内的干细胞，也可分化成组织特异性细胞。如svf在关节炎治疗方面有较好的治疗效果。2011，pak采用自体svf和富血小板血浆和透明质酸成功地治疗了2例人类膝关节骨关节炎患者。此后临床治疗关节炎越来越广泛，据临床研究资料显示，已有研究人员对1114例关节炎患者予以临床治疗。2013年，pak等人治疗了91位患者，其中65％的人群表述治疗3个月后有效果；bui等人对2级和3级21位关节炎患者予以svf治疗，vas评价及lysholm评价均显示患者在8.5个月关节功能得到改善。

目前关节炎治疗主要有药物治疗如非甾体类抗炎药(nsaids)、类固醇和透明质酸(ras)；物理疗法如针灸、职业训练等；手术治疗如关节腔穿刺、关节置换、关节矫形等；免疫及生物治疗如干细胞移植、血浆置换等。药物治疗、物理疗法，都旨在纠正症状，而不是治疗潜在的原因。当药物治疗和物理疗法治疗失败时，患者通常进行全膝关节置换(tkr)或全髋关节置换术(thr)手术。tkr和thr手术均具有较高的发病率和死亡率。全膝关节置换术后的第30天死亡率为0.18％，5.6％的患者出现并发症。全髋关节置换术后30天和90天的死亡率分别为0.24％和0.55％。：svf采用患者自身脂肪组织，回输到体内不会出现任何副作用，且细胞治疗不需对关节进行破坏性处理，通过svf自发迁移至受损部位而生成软骨组织。细胞回输后仅需静养几天即可进行正常的生活、工作。svf还可对关节炎症、肌腱缺失、髌骨软骨软化、半月板缺失等关节部位均有一定的治疗效果。

目前svf细胞提取一般将脂肪组织清洗离心后加入等体积的胶原酶以150-280rpm，37℃振荡消化30-60min，离心获得沉淀物，沉淀物清洗离心过滤获得svf细胞。但这种组织消化方式中的酶消化作用过长及振荡产生的剪切力均对细胞活率有较大影响。

技术实现要素：

鉴以此，本发明提出一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂及提取方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：胶原酶、海藻糖及明胶。

进一步的，所述提取试剂包括以下原料：0.1-1w/w％胶原酶溶液、2-10w/w％的海藻糖溶液及0.05-0.15w/w％的明胶溶液。

进一步的，所述胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液的体积比为0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。

进一步的，所述胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液为dmem培养基。

进一步的，人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：

s1、采集脂肪组织，用ph值为7.2-7.4的pbs清洗2-4遍；

s2、清洗后的脂肪组织去除洗涤液，加入提取试剂，在30～40℃振荡消化30-60min，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞；

s3、加入生理盐水洗涤沉淀细胞，900～1400rpm离心2～8min去除上清，沉淀加入8～12倍体积量的生理盐水重悬细胞，80～120μm过滤svf细胞；

s4、svf再次离心，8～12倍体积量生理盐水重悬细胞，用20～60μm滤器过滤细胞，得到svf细胞。

进一步的，所述s2步骤的振荡频率为150-280rpm。

进一步的，所述s3步骤加入5～10倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞。

进一步的，人自体脂肪血管基质成分应用于现有临床治疗技术对骨关节炎、关节软骨缺损、软骨损伤与退变等疾病治疗。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种脂肪血管基质组分的提取试剂，由dmem配制的胶原酶，海藻糖及明胶组成的混合溶液，本发明的海藻糖溶液对细胞膜蛋白有保护作用，胶原酶溶液和明胶溶液可促进细胞增殖迁移，可提高溶液粘稠度，降低剪切力对细胞的破坏。其中的svf用生理盐水洗涤，并用滤网去除细胞液中的块状物质；本发明能够减少组织或细胞离心，降低离心转速及离心时间，减少剪切力对细胞的破坏，达到保护细胞，提高脂肪组织中细胞存活率的目的；可提供一种临床级脂肪svf制备方法，应用于现有临床治疗技术对骨关节炎、关节软骨缺损、软骨损伤与退变等疾病治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3细胞图；

图2为对比例1细胞图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：0.1w/w％胶原酶溶液、2w/w％的海藻糖溶液及0.05w/w％的明胶溶液，将体积比为0.8：0.8：1.2的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型dmem的svf提取试剂。

实施例2

一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：1w/w％胶原酶溶液、10w/w％的海藻糖溶液及0.15w/w％的明胶溶液，将体积比为1.2：1.2：0.8的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型dmem的svf提取试剂。

实施例3

一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：0.5w/w％胶原酶溶液、4w/w％的海藻糖溶液及0.15w/w％的明胶溶液，将体积比为1:1:1的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型dmem的svf提取试剂。

上述实施例1～3还提供人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：

s1、取50ml脂肪组织，加入ph值为7.2的pbs反复振荡洗涤，待静置分层后，吸弃下层洗涤液，反复2次至洗涤液无色。

s2、将脂肪组织分装到2支50ml离心管中，加入等体积的svf提取试剂，置于30℃振荡培养箱中，以150rpm振荡消化30min，待肉眼观察不到有团块状物质即可停止消化。

s3、加入5倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，将消化的组织放入离心机中，以900rpm离心2min，去除上层油脂、消化液，沉淀加入8倍体积生理盐水重悬细胞，80μm过滤svf细胞。

s4、svf再次离心，8倍体积量重干细胞培养基悬细胞，接种于t75培养瓶中。

实施例4

本实施例按照实施例3的提取试剂，人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：

s1、取50ml脂肪组织，加入ph值为7.4的pbs反复振荡洗涤，待静置分层后，吸弃下层洗涤液，反复4次至洗涤液无色。

s2、将脂肪组织分装到2支50ml离心管中，加入等体积的svf提取试剂，置于40℃振荡培养箱中，以280rpm振荡消化60min，待肉眼观察不到有团块状物质即可停止消化。

s3、加入10倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，将消化的组织放入离心机中，以1400rpm离心8min，去除上层油脂、消化液，沉淀加入8倍体积生理盐水重悬细胞，120μm过滤svf细胞。

s4、svf再次离心，12倍体积量重干细胞培养基悬细胞，接种于t75培养瓶中。

实施例5

本实施例按照实施例3的提取试剂，人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：

s1、取50ml脂肪组织，加入ph值为7.3的pbs反复振荡洗涤，待静置分层后，吸弃下层洗涤液，反复4次至洗涤液无色。

s2、将脂肪组织分装到2支50ml离心管中，加入等体积的svf提取试剂，置于37℃振荡培养箱中，以220rpm振荡消化40min，待肉眼观察不到有团块状物质即可停止消化。

s3、加入8倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，将消化的组织放入离心机中，以1100rpm离心5min，去除上层油脂、消化液，沉淀加入10倍体积生理盐水重悬细胞，100μm过滤svf细胞。

svf再次离心，10倍体积量重干细胞培养基悬细胞，接种于t75培养瓶中。

对比例1

一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂，所述提取试剂由0.5w/w％胶原酶溶液、配制成低糖型dmem的svf提取试剂；

人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：

s1、取50ml脂肪组织，加入ph值为7.2-7.4的pbs反复振荡洗涤，待静置分层后，吸弃下层洗涤液，反复4次至洗涤液无色。

s2、将脂肪组织分装到2支50ml离心管中，加入等体积的svf提取试剂，置于37℃振荡培养箱中，以150-280rpm振荡消化30-60min，待肉眼观察不到有团块状物质即可停止消化。

s3、将消化的组织放入离心机中，以1100rpm离心5min，去除上层油脂、消化液，沉淀加入10倍体积生理盐水重悬细胞，100μm过滤svf细胞。

s4、svf再次离心，10倍体积量重干细胞培养基悬细胞，接种于t75培养瓶中。

一、svf细胞量对比

分别按照实施例3和对比例1的方法提取svf细胞，重复制备svf细胞3个样本，每个样本取5份，分别计算平均细胞数量及用台盼蓝计算细胞成活率。

结果如下表：

表1：svf细胞数量活率对比

由表1可知，采用实施例3方法所制备出的svf细胞数量及活率均高于对比例1所制备的细胞数量。与对比例1采取的svf细胞制备方法比，实施例3制备svf制备方法更具优势，获得细胞数量及活率分别提高了22％及35％。

二、svf培养第9天脂肪干细胞形态和数量

将对比例1和实施例3制备的三个样本，以相同细胞数量接种于三个t175培养瓶中，连续培养8天，每三天换液一次，于培养第9天取标本一培养的细胞，在显微镜下观察，结果见附图1-2。

三、svf中脂肪干细胞的成活率

用胰酶消化离心后计算干细胞数量，测算svf细胞中干细胞的成活率。结果见表2。

表2：svf中脂肪干细胞的成活率

由图可知，实施例3所得细胞形态细胞量较多，呈螺旋状生长，细胞融在一起，细胞形态较好。对比例1所得细胞数量较少，未成螺旋状生长，且部分细胞未融合在一起，部分细胞较短。

对培养9天的细胞进行消化，对比例1所获得细胞数量较实施例3细胞少，但细胞活率基本一致。可能主要原因是实施例3所获得的细胞量较对比例1获得的细胞量多，在培养过程中因接种的起始细胞量多，进而促进细胞增殖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。