黏附能力降低的牛支原体基因缺失的突变株的制作方法

本发明是申请号为2019101283763，申请日为2019年2月21日提交申请的分案申请。

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到牛支原体mbov_0503基因缺失突变菌株t4.4和该基因编码的功能未知蛋白mbov0503。突变位点位于牛支原体基因组586830位点后，位于mbov_0503基因313位点后。与野生菌株相比，该突变株对宿主细胞的黏附能力显著缺陷，对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力显著降低。重组蛋白rmbov0503可以黏附于宿主细胞和细胞膜蛋白。该突变株和蛋白可望在牛支原体致病机制和免疫防控领域具有应用前景。

背景技术：

牛支原体(mycoplasmabovis，m.bovis)主要导致牛支气管肺炎，同时还可导致乳腺炎、关节炎、流产等多种疾病，严重危害世界养牛业。在欧洲，每年约三分之一的犊牛肺炎由牛支原体引起，损失高达5.76亿欧元；在美国，由牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺炎所造成损失每年达到1.08亿美元(rosengarten等，1999)。我国2008年华中农业大学首次报道牛支原体肺炎，此后发现全国绝大部分省市均有牛支原体肺炎，发病率为80％以上，病死率平均为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。同时，牛乳腺炎的流行也很普遍(张慧等，2015)，给我国养牛业造成了巨大经济损失。

黏附是支原体感染和致病的第一步，也是研究支原体病防控措施的重要靶点。关于牛支原体的黏附机制研究尚处于初级阶段，至今似乎未发现与人肺炎支原体类似的主要黏附蛋白和顶端黏附细胞器。然而，已报道了一些黏附相关蛋白如α-enolase(song等，2012)、vsps(sachse等，2000)和nadhoxidase(zhao等，2017)，但这些蛋白的功能研究大部分基于重组蛋白，在牛支原体水平的实际黏附过程中所起作用尚不清楚。为了了解牛支原体的黏附基因，申请人利用牛支原体突变体库、细胞黏附和转移小室(transwell)跨膜传播试验等，鉴定了黏附缺陷突变体。本发明涉及一株细胞黏附能力缺陷突变体，突变基因为mbov_0503；该基因编码功能未知蛋白mbov0503，本发明证明该蛋白为一种黏附相关蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株黏附能力降低的牛支原体基因缺失的突变株t4.4。牛支原体mbov0503蛋白可以独立黏附于宿主细胞，其突变菌株t4.4相较野生菌株呈现显著的黏附缺陷表型，对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力较野生菌株均降低。基于黏附、对细胞间紧密连接的破坏和跨膜传播能力等是支原体感染和致病的毒力相关因子，该突变株可望在牛支原体致病机制和免疫防控领域有潜在应用前景。

为了实现本发明的目的，申请人所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因缺失突变体库中筛选出一株黏附缺陷菌株t4.4。进一步验证确定该突变菌株的对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力较野生菌株均显著降低。该突变菌株缺失基因为未知基因mbov_0503，其n端具有一个跨膜结构域，经进一步验证，该基因编码的蛋白mbov0503具有黏附宿主细胞的能力。本发明为阐明牛支原体致病机制提供了理论依据，并为开发特异性防控制剂提供了潜在靶点。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株hb0801，命名为牛支原体hb0801，mycoplasmabovishb0801，于2010年2月1日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2010040。进一步利用pmt85转座子载体构建了牛支原体hb0801的随机突变体文库。本发明在此基础上，首先利用细胞模型从突变体库中筛选黏附缺陷的突变株，获得黏附缺陷表型最显著的突变株命名为牛支原体t4.4，mycoplasmabovist4.4，于2018年8月31日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2018581。对该突变株突变基因鉴定，确定为mbov_0503缺失株。进一步以牛支原体hb0801(基因组在genbank上的登录号为cp002058)基因组为模板克隆该基因。克隆过程中，根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行了基因修饰，即将牛支原体色氨酸密码子uga突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子ugg，共进行了5个密码子的突变，以保证其在大肠杆菌中表达。

经过人工突变后的牛支原体基因mbov_0503的核苷酸序列是序列表seqidno：13的1-1509位碱基所示的序列，其长度为1509bp；其中在该序列的354位，549位，810位，1023位和1050位发生等位基因突变；

该牛支原体mbov0503蛋白基因编码的蛋白质序列如序列表seqidno：14所示，共编码502个氨基酸残基。

将本发明的牛支原体mbov_0503基因的核苷酸序列，通过构建质粒载体pet-30a-mbov_0503转化大肠杆菌dh5α得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pet-30a-mbov_0503，escherichiacolipet-30a-mbov_0503，于2018年9月12日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2018614。该菌株在iptg诱导下，表达mbov_0503基因编码的重组蛋白rmbov0503。

经过验证，本发明纯化的重组蛋白rmbov0503对宿主细胞及细胞膜均具有黏附功能。

本发明所述的牛支原体突变菌株对胎牛肺细胞(embryonicbovinelung，ebl)黏附能力、对牛肾细胞(madin-darbybovinekidneycells，mdbk)跨膜传播能力和细胞间紧密连接破坏能力均显著降低，相关检测方法如下：

黏附能力检测：利用菌落计数法，化学染色法和elisa方法对牛支原体hb0801和t4.4的黏附能力进行检测。将hb0801和t4.4菌株分别培养至对数末期并计数，同时将ebl细胞铺于24孔细胞培养板培养过夜使其形成单层细胞层，将处理好的牛支原体以感染比为1000加入贴壁细胞中，反应30min后，洗涤未黏附的牛支原体，并利用预冷的ddh2o将细胞涨裂，释放黏附于ebl细胞的支原体，进行菌落计数。提取ebl细胞膜蛋白，并将膜蛋白包被于elisa板，并将mbov0503蛋白与细胞膜蛋白进行孵育，利用elisa方法检测目的蛋白对膜蛋白的黏附，利用化学染料对牛支原体/mbov0503蛋白及ebl细胞骨架进行染色，利用荧光显微镜观察确定牛支原体突变菌株/mbov0503蛋白对ebl细胞具有黏附能力。

跨膜传播能力和细胞间紧密连接破坏能力：利用transwell模型，通过菌落计数法和化学染色法对牛支原体hb0801和t4.4的跨膜传播能力和细胞间紧密连接的破坏能力进行检测。将hb0801和t4.4菌株分别培养至对数末期并计数，同时将mdbk细胞(由本实验保存)铺于transwell小室，培养3天，使其形成紧密连接，将处理好的牛支原体以感染比为1000加入小室中，同时设置hb0801感染组为阳性对照，未感染组为空白对照，反应不同时间取transwell下室培养基适量进行菌落计数，确定牛支原体突变菌株对mdbk的穿透能力显著下降，通过对transwell小室膜进行染色，利用荧光显微镜观察，确定牛支原体突变菌株对紧密连接的破坏能力降低。

本发明具有以下优点：

1、本发明的t4.4菌株是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得黏附能力显著降低的突变菌株。

2、本发明的t4.4菌株，基因突变位点位于牛支原体基因组586830位点后，位于mbov_0503基因313位点后。

3、本发明的牛支原体mbov_0503基因是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得的黏附相关基因，并根据大肠杆菌密码子偏爱性进行了人工修饰。并成功表达重组蛋白，证实重组蛋白rmbov0503具有黏附能力。

4、本发明的t4.4菌株已被发明人证实相较于野生菌株，其对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力显著降低。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是本发明牛支原体黏附缺陷菌株定量检测分析图。方框所示为黏附缺陷最显著的突变菌株t4.4。

图2：是本发明实施例中空质粒pet-30a的质粒图谱。pet-30a为商业化质粒，购自novagen公司。

图3：是本发明制备的重组质粒pet-30a-mbov_0508的图谱。重组质粒pet-30a-mbov_0503是由pet-30a质粒和突变后的mbov_0503基因全长(除跨膜区外)经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图4：是本发明纯化的牛支原体rmbov0503蛋白胶图。附图标记说明：泳道m：蛋白质marker；1：纯化的牛支原体rmbov0503重组蛋白。

图5：是本发明牛支原体mbov0503重组蛋白对ebl细胞及膜蛋白的黏附能力检测图。附图标记说明：a：mbov0503与ebl细胞的黏附，b：阴性血清预孵过的mbov0503与ebl细胞的黏附，c：多抗孵过的mbov0503与ebl细胞的黏附，d：阴性对照。e：mbov0503与ebl细胞膜蛋白的黏附；f：mbov0503与ebl细胞膜蛋白的黏附抑制(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns分别代表与bsa组比较数据有差异，差异显著，差异极其显著，没有差异)。

图6：是本发明牛支原体生长曲线检测图。

图7：是本发明牛支原体t4.4对ebl细胞黏附能力检测图。附图标记说明：a：共聚焦检测牛支原体对ebl细胞的黏附，绿色荧光为牛支原体单抗和酶标二抗alexa-488标记牛支原体野毒株和t4.4，红色荧光为罗丹明鬼笔环肽标记ebl细胞骨架，蓝色荧光为dapi标记ebl细胞核，pbs作为阴性对照；b：牛支原体不同温度下对ebl细胞的黏附。

图8：是本发明牛支原体跨膜传播能力及对细胞间紧密连接破坏能力检测图。a：tranwell跨膜传播计数结果；b：共聚焦检测牛支原体对细胞紧连接的破坏能力，用鼠源的抗zo-1抗体作为一抗，用酶标二抗igg-alexa488对紧密连接蛋白zo-1进行标记(绿色)，用dapi对mdbk细胞核进行染色(蓝色)。hb0801感染组为阳性对照，nc组为空白对照。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表seqidno：1是扩增mbov_0503基因片段的正向引物0503a1的序列。

序列表seqidno：2是扩增mbov_0503基因片段的反向引物0503a2的序列。

序列表seqidno：3是扩增mbov_0503基因片段的正向引物0503b1的序列。

序列表seqidno：4是扩增mbov_0503基因片段的反向引物0503b2的序列。

序列表seqidno：5是扩增mbov_0503基因片段的正向引物0503c1的序列。

序列表seqidno：6是扩增mbov_0503基因片段的反向引物0503c2的序列。

序列表seqidno：7是扩增mbov_0503基因片段的正向引物0503d1的序列。

序列表seqidno：8是扩增mbov_0503基因片段的引物0503d2的序列。

序列表seqidno：9是扩增mbov_0503基因片段的引物0503e1的序列。

序列表seqidno：10是扩增mbov_0503基因片段的反向引物0503e2的序列。

序列表seqidno：11是扩增mbov_0503基因片段的正向引物0503f1的序列。

序列表seqidno：12是扩增mbov_0503基因片段的反向引物0503f2的序列。

序列表seqidno：13是本发明人工突变牛支原体mbov_0503基因的核苷酸序列，序列长度为1509bp。其中：在该序列的354位，549位，810位，1023位和1050位发生等位基因突变。

序列表seqidno：14是本发明的牛支原体mbov0503基因编码的蛋白质序列。

实施例1：牛支原体黏附缺陷突变体的筛选鉴定

1.牛支原体黏附缺陷突变体的初筛

(1)牛支原体突变菌株培养和计数：牛支原体突变体库由申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室构建，保存于-80℃，本试验初筛197株转座子插入不同orf的牛支原体突变体，以1：1000的比例接种液体培养基(pplo粉末10.5g，丙酮酸钠粉末0.5g，酵母2.5g，加入440mlddh2o定容并于121℃高温蒸汽灭菌18min，加入10％的马血清50ml，10×mem5ml，40万单位/ml青霉素溶液1ml，酚红生长指示剂500μl)复苏，置于37℃，5％co2培养箱中培养36h，即到达对数期后，再以1：1000的比例重新接种于上述液体培养基中，培养至对数末期，进行cfu计数，即将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μl适当稀释度的菌液涂布于pplo固体培养基(500mlpplo液体培养基中加入琼脂7.5g)，倒置于37℃，5％co2培养箱中培养3-7d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：cfu/ml＝菌落数×稀释度×100，计数后的菌液作为每次试验的感染菌液。试验前以12000rpm离心收集支原体沉淀，再用等体积的细胞培养基将沉淀重悬。

(2)raw264.7细胞的培养和计数：小鼠腹腔巨噬细胞细胞系raw264.7(atcctib-71)，用含10％fbs的dmem完全培养基在(hyclone)5％co2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长至80％满的单层细胞时，用刮铲将贴壁细胞轻轻挂下，并用适当体积的dmem完全培养基吹打制成细胞悬液，对细胞悬液用血球计数板进行计数，计数方法简述如下：取重悬均匀的细胞悬液适量沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，使盖片下充满悬液，在高倍显微镜下对血球计数板四周及中间的5个小格中的细胞进行计数，细胞数/ml＝(5个小格的细胞数/20)×稀释倍数×10⁶。

(3)对小鼠巨噬细胞(raw264.7，本实验室保存)细胞黏附能力改变的牛支原体突变体初筛：将raw264.7细胞以每孔1×10⁵接种于24孔板中，于37℃，5％co2条件下过夜培养，使细胞贴壁生长，显微镜下鉴定细胞状态良好之后，以感染比为1000加入用磷酸盐缓冲液(pbs，(配方：kcl0.2g，nacl8g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸馏水，ph＝7.6)涤过的牛支原体突变菌株，同时设置牛支原体野生菌株hb0801为阳性对照，以细胞完全培养基为阴性对照组，于37℃，5％co2温箱中黏附1h后，用灭菌内开的pbs洗涤未黏附的牛支原体3-4次，然后用预冷内开的ddh2o处理细胞，使细胞涨裂释放黏附的菌株，并利用移液枪反复吹打，使黏附的牛支原体均匀分布，然后进行cfu计数。初步筛选出19株黏附缺陷突变体。

2.用胎牛肺细胞对黏附能力改变的牛支原体突变株进行复筛

为了进一步确定初筛突变菌株对宿主细胞的黏附能力，利用胎牛肺细胞(embryonicbovinelungcell，ebl)对初筛得到的的19株牛支原体突变株进行复筛，将ebl细胞铺于24孔板中，每孔1×10⁵个细胞，于37℃，5％co2条件下培养12h，使细胞贴壁生长，之后按感染比为1：1000分别加入牛支原体野生株和本发明制备的突变菌株，在37℃下作用1h，并对黏附于ebl细胞的牛支原体进行培养和菌落计数，计数结果显示：t4.4突变菌株黏附能力降低最显著(图1)。

实施例2：牛支原体mbov0503蛋白的表达

1.牛支原体mbov_0503基因的克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体基因组中编码色氨酸的密码子uga在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子uga突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子ugg。申请人为了表达牛支原体mbov_0503基因，利用自行设计的pcr引物对该基因进行了相应5个密码子的突变，具体步骤是：以牛支原体hb0801(基因组genbank登录号为cp002058)中的mbov_0503基因为模板，利用如下设计的6对引物(编号分别为：0503a1/0503a2，0503b1/0503b2，0503c1/0503c2，0503d1/0503d2，0503e1/0503e2，0503f1/0503f2)分别扩增出突变后的mbov_0503基因的6个片段，然后，以突变后的6个片段为模板，利用0503a1/0503f2引物对扩增得到突变后的mbov_0503基因的全序列，全核苷酸序列长度为1509bp(见序列表seqidno：13中1-1509位碱基所示的序列，其编码区也是1-1509位碱基对应的序列)。

扩增mbov_0503全基因所用的6对引物序列如下所示：

(1)引物0503a1/0503a2，扩增片段在mbov_0503基因中的位置为586656-587028碱基处，pcr扩增产物长度为373bp。具体的引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503a1：5’

cgcggatccttcaaaattaatttagaaaagaaaaatgtaattag3’，(对应序列表seqidno：1所示的序列)。

2)反向引物0503a2：5’tatagttaggcgtaaagctccagtatata3’，(对应序列表seqidno：2所示的序列；下划线部分为突变位点，即由t突变为c)

(2)0503b1/0503b2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为587014-587220碱基处，pcr扩增产物长度为207bp，具体的引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503b1：5’ttacgcctaactataatgaaaaaaatatg3’(对应序列表seqidno：3所示的序列)。

2)反向引物0503b2：5’catctttaaaataataccagcctgggt3’,(下划线部分为突变位点，即由t突变为c；对应序列表seqidno：4所示的序列)。

(3)0503c1/0503c2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为587212-587479碱基处，pcr扩增产物长度为268bp，具体的引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503c1：5’ttaaagatggcattttacacttaataattgg3’(对应序列表seqidno：5所示的序列)。

2)反向引物0503c2：5’ttactgtctaaaaaccactgataatactttg3’(下划线部分为突变位点，即由t突变为c；对应seqidno：6所示的序列)。

(4)0503d1/0503d2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为587468-587695碱基处，pcr扩增产物长度为228bp，具体引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503d1：5’tttagacagtaatgagcataacgaacac3’(对应序列表seqidno：7所示的序列)。

2)反向引物0503d2：5’ttatataaatatctaaaccaagggacattt3’(下划线部分为突变位点，即由t突变为c；对应序列表seqidno：8所示的序列)。

(5)0503e1/0503e2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为587682-587727碱基处，pcr扩增产物长度为46bp，具体引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503e1：5’agatatttatataataatttatggaccgaaaatt3’，(下划线部分为突变位点，即由a突变为g；对应序列表seqidno：9所示的序列)。

2)反向引物0503e2：5’cagttgaaagtaaattttcggtccataaattatt3’，(对应序列表seqidno：10所示的序列)。

(6)0503f1/0503f2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为587718-588164碱基处，pcr扩增产物长度为447bp，具体引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503f1：5’ctttcaactgaagtaaacagtgatgatt3’，(对应序列表seqidno：11所示的序列)。

2)反向引物0503f2：5’

ccgctcgagttatacattataaaaatattttatttttaatctttgtaca3’，(对应序列表seqidno：12所示的序列)。

(7)0503a1/0503f2扩增片段在mbov_0503基因中的位置为586656-588164碱基处，pcr扩增产物长度为1509bp，具体引物对的序列如下所述：

1)正向引物0503a1：5’

cgcggatccttcaaaattaatttagaaaagaaaaatgtaattag3’，(下划线部分为bamh1酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表seqidno：1所示的序列)。

2)反向引物0503f2：5’

ccgctcgagttatacattataaaaatattttatttttaatctttgtaca3’，(下划线部分为xhoi酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表seqidno：12所示的序列)。

上述6个片段的pcr反应体系如下：

模板dna2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，各自对应的引物各2μl，加超纯水36μl。

分别回收以上六个片段的pcr扩增产物，以得到的pcr扩增产物混合物为模板，使用引物0503a1/0503f2扩增突变后的mbov_0503基因，其pcr反应体系如下：每个片段2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，引物各2μl，加超纯水23.5μl。上述引物由天一辉远生物科技有限公司合成。

回收mbov_0503基因的扩增产物，用bamhⅰ和xhoi酶切，同时将pet-30a质粒(图2)(购自默克中国有限公司)用bamhⅰ和xhoi进行双酶切。将酶切后的mbov_0503基因和pet-30a质粒用dna连接酶(t4dnaligase)连接，得到重组质粒pet-30a-mbov_0503(图3)。用该重组质粒pet-30a-mbov_0503转化大肠杆菌dh5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌bl21，将该大肠杆菌在lb液体培养基中培养至od＝0.6时取1ml菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.8mm，37℃摇床诱导表达3小时。取1ml菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1ml磷酸盐缓冲液即pbs(配方：kcl0.2g，nacl8g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸馏水，ph＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30ul的pbs和30ul上样缓冲液【1mtris-hcl(ph＝6.8)1ml，200mmddt0.31g，4％sds0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2ml，7ml超纯水】重悬。100℃沸水中煮沸10min。用sds-page凝胶电泳鉴定是否表达。

将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建质粒载体pet-30a-mbov_0503转化到大肠杆菌dh5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pet-30a-mbov_

0503,escherichiacolipet-30a-mbov_0503，于2018年9月12日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2018614。

2.牛支原体rmbov0503重组蛋白的表达和纯化

将重组的大肠杆菌bl21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500ml的pbs洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500ml的pbs洗一次。弃掉上清后加入30ml的pbs重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μl上清加入30μl上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μl的pbs和30μl上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过sds-page凝胶电泳后，确定rmbov0503蛋白大部分表达于上清中。

rmbov0503蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mlni-nta金属螯合his蛋白纯化介质填料(购自ge公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mlddh2o洗涤；

(3)加入12ml的bindingbuffer(20mmna3po4，0.5mnacl，20mm咪唑，ph＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mlbindingbuffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mlwashingbuffer缓冲液(20mmna3po4，0.5mnacl，60mm咪唑，ph＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mlelutebuffer缓冲液(20mmna3po4，0.5mnacl，1m咪唑，ph＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μl上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置sds-page聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μl/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120v)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白(图4)

实施例3：重组蛋白rmbov0503黏附能力的检测

1.重组蛋白rmbov0503对ebl细胞黏附检测

(1)铺1×10⁵ebl细胞于24孔板爬片中，于37℃，5％co2条件下进行细胞贴壁培养；

(2)将10μg的mbov0503与ebl细胞互作1h，反应体积为200μl，以便蛋白与细胞充分接触，并设置以下对照：只加mem基础培养基(hyclone)的作为空白对照；将rmbov0503用抗mbov0503的多克隆抗体于37℃孵育1h；将rmbov0503用鼠阴性血清37℃孵育1h；

(3)封闭：用内开的pbs洗涤未黏附的蛋白，动作轻柔，洗涤5次，每次沿不同的方向加入pbs洗涤，加入5％脱脂牛奶在室温条件下封闭2h，用pbs洗涤3次；

(4)固定和透化处理：每孔加入1ml商业化的4％多聚甲醛在室温条件下固定30min，用pbs缓冲液洗涤3次后，加入10％的tx-100室温条件下作用5min，进行透化处理；

(5)一抗孵育：将鼠源抗(本实验室制备)rmbov0503的抗血清进行1:500稀释，按200μl/孔加入各孔中，室温下反应1h，用pbs洗涤3次；

(6)二抗孵育：利用羊抗鼠488(thermofisher，绿色荧光)二抗对rmbov0503进行标记，室温下孵育45min，用pbs洗涤3次；

(7)用罗丹明鬼笔环肽标记ebl细胞骨架，室温遮光作用30min，pbs洗涤之后，加入dapi对细胞核进行标记，在室温作用5min；

(8)制片：用镊子小心将爬片捞出，吸取水分后，倒置于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，用滤纸除去多余的抗荧光淬灭剂后，置于荧光共聚焦显微镜下检测，确定重组蛋白rmbov0503可以粘附于ebl细胞(图5中的a图-d图)。

2.重组蛋白rmbov0503对ebl细胞膜蛋白的黏附检测

(1)ebl细胞膜蛋白的提取

1)将ebl(本实验室保存)细胞用含10％fbs的mem培养基(hyclone)进行扩大培养；并按照细胞膜蛋白提取试剂盒(novagen)进行膜蛋白提取，具体步骤如下；

2)用内开的pbs洗涤细胞并用刮铲将细胞刮下，700g，4℃条件下离心5min，收集0.2-10×10⁸细胞；

3)用3ml预冷的pbs洗涤ebl细胞2-3次；

4)加入2ml的homogenizationbuffermix于冰冷的环境中震荡裂解细胞；

5)将匀浆转移到1.5ml的离心管管中，于700g，4℃条件下离心10min收集上清；

6)将离心所得上清转移到新的1.5ml离心管中，1000g，4℃条件下离心30min，收集沉淀即为细胞膜蛋白，用300μl预冷的pbs重悬沉淀，测定浓度后并于-80℃保存。

3.elisa检测rmbov0503与ebl细胞膜蛋白黏附

(1)膜蛋白包被酶标板：将ebl细胞膜蛋白以100μl/孔，400ng，包被于elisa板中，每组设置3个重复，并设置等量的牛血清白蛋白(bsa)为阴性对照组。4℃包被过夜，然后用pbst洗涤3次，之后加入pbst稀释的5％的脱脂牛奶，37℃封闭2h。

(2)rmbov0503与膜蛋白粘附反应：将封闭之后的板子用pbst洗涤3次，拍干，加入倍比稀释的rmbov0503，37℃作用1h，用pbst(含0.05％吐温-20的pbs缓冲液)洗涤3次；然后加入1:300稀释的鼠源抗rmbov0503的多克隆抗体，37℃条件下反应1h，用pbst洗涤3次；加入1:3000稀释的羊抗鼠igg酶标二抗(southernbiotech)，37℃条件下反应1h；加入显色液tmb(武汉科前生物制品有限公司)作用避光反应10min后，加入终止液，于od630测定吸光值。确定rmbov0503对ebl细胞膜蛋白的粘附作用呈剂量依赖性(图5e)。

(3)rmbov0503抗血清的黏附抑制：将400ng的pbst稀释的蛋白与倍比稀释的抗rmbov0503的多克隆抗体与37℃提前孵育1h，将处理过的rmbov0503加入封闭好的elisa板子中，100μl/孔，每组3个重复，另设置未加抗体的组别作为阳性对照，37℃作用1h；pbst洗涤3次；然后加入鼠源抗rmbov0503的抗血清(1:300稀释)；pbst洗涤3次；加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg(southernbiotech)(1:3000稀释)作为二抗，37℃反应1h；加入显色液作用10min后，加入终止液tmb(武汉科前生物制品有限公司)，于od630测定吸光值。确定rmbov0503的抗血清可以抑制重组蛋白对ebl细胞膜蛋白的粘附作用(图5中的f图)。

实施例4：牛支原体生长曲线的检测

取牛支原体hb0801和t4.4以1：1000的比例接种pplo液体培养基，静置，于37℃，5％co2培养箱中培养36h即到达对数期后，进行cfu计数。将计数好的牛支原体用pplo培养基稀释成10⁵cfu/ml，按1：10比例接种至pplo培养基中，静置于37℃，5％co2培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数。将牛支原体计数结果对取样时间点作图，获得生长曲线。比较不同菌株各时期的生长情况，结果显示突变菌株与野生菌株的生长速度一致(图6)。

实施例5：牛支原体对ebl细胞黏附能力的验证

1.牛支原体不同温度下对ebl细胞黏附能力测定

铺ebl细胞于24孔板中，每孔1×10⁵，37℃，5％co2条件下培养12h，使细胞贴壁生长，之后以感染比为1000加入牛支原体野毒株和突变菌株于不同温度下(4℃，37℃，42℃)反应1h，pbs洗涤未黏附的牛支原体，预冷的ddh2o使细胞吸水涨破后，收集菌液并进行菌落计数。

2.牛支原体与ebl细胞的黏附能力的可视检测

(1)将ebl细胞以1×10⁵/孔接种于24孔细胞爬片上，于37℃，5％co2条件下培养12h，使细胞贴壁生长；

(2)用内开的pbs洗涤ebl细胞2-3次，按感染比为1000加入100μlcfda-se化学染料标记的菌液(约含1×10⁸cfu)至相应的细胞孔中，分别于37℃孵育1h，每孔液体总体积为200μl，以使细胞能够充分接触支原体。空白组加入等量的细胞培养基；

(3)用常温储存的内开pbs缓冲液洗涤细胞5次，每次沿不同的方位缓慢加入，除去未黏附于ebl细胞的牛支原体；

(4)用1ml4％多聚甲醛于室温条件下对细胞固定30min，pbs洗涤之后，加入200μl罗丹明鬼笔环肽，对ebl细胞骨架进行染色，室温避光作用30min。pbs洗涤之后，加入200μl的dapi对细胞核染色10min；

(5)将爬片从24孔板中捞出，用吸水纸吸取玻片水分，倒放入滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，荧光共聚焦显微镜下观察。

菌落记数法和荧光显微镜可视检测法显示，t4.4突变株对ebl细胞的黏附能力较野生菌株显著降低(图7)。

黏附是病原定殖并诱导疾病发生的首要条件(razinandjacobs，1992)，不仅有利于其突破宿主细胞的屏障结构，持续增殖，向深层组织侵袭，而且可以激发宿主免疫反应引起疾病发生，因此黏附也被认为是支原体感染的毒力因素。在突变菌株中，t4.4对宿主细胞的黏附能力降低最显著，提示其在与宿主细胞相互作用中具有重要意义。

实施例6：牛支原体跨膜传播能力和对mdbk细胞间紧密连接破坏能力的检测

1.牛支原体细胞跨膜传播能力检测

(1)mdbk细胞间紧密连接的检测：以1×10⁵细胞/孔将mdbk细胞接种于24孔transwell小室中。37℃，5％co2条件下培养3d，换液后进行渗透性检测，即每孔加入100μl0.4％台盼蓝，于1min、5min、10min、30min，分别收集下室液体100μl，置于96孔板中，于od580条件下测定吸光度值，测定标准：当作用30min后od580＜0.1说明此时细胞之间形成紧密连接，可以用于感染实验。

(2)牛支原体跨膜传播能力的检测：待mdbk细胞形成紧密连接后，用内开的pbs洗涤上室的细胞2次，每孔下室加入600μldmem完全培养基，该体积需覆盖上室，取对数末期的牛支原体菌株，经计数和洗涤处理后按moi为1000加入上室中，分别于反应后6h、12h，24h收集下室培养基100μl，用于菌落计数。检测结果显示，t4.4突变株对mdbk的跨膜传播能力较野生菌株显著降低(图8)。

2.牛支原体对mdbk细胞间紧密连接破坏能力的检测

(1)mdbk细胞间紧密连接的检测：以1×10⁵细胞/孔将mdbk细胞接种于24孔transwell小室中。37℃，5％co2条件下培养3d，使细胞形成紧密连接。

(2)将处理好的牛支原体按感染比为1000加入transwell小室中，于37℃，5％co2条件下感染24h。

(3)将感染后的transwell小室膜用5％的脱脂牛奶室温封闭3h，封闭完成之后用pbs洗涤3次；

(4)加入4％的多聚甲醛室温固定30min，洗涤之后，用tx-100进行透化处理，pbs洗涤3次；

(5)用anti-zo-1的标记紧密连接蛋白zo-1，室温作用1h，加入羊抗鼠酶标二抗488作用1h后，pbs洗涤3次；

(6)用dapi染细胞核室温5min，pbs洗涤3次；

(7)将transwell小室膜撕下，倒放于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，加上盖玻片，用滤纸除去多余的抗荧光淬灭剂后，荧光共聚焦显微镜下观察。

(8)结果判定：nc空白组紧密连接完整，很少有破坏；t4.4突变株感染组显示仅有少部分的胞间连接断裂；hb0801感染组显示大量的紧密连接遭到破坏，相比于t4.4突变株破坏程度严重(图8)。

mdbk细胞间能够形成紧密连接，这种紧密连接一定程度上能对宿主细胞进行保护，一旦细胞间的紧密连接遭受破坏，则将加剧病原体在宿主细胞之间的传播，对宿主造成疾病危害。t4.4突变株对mdbk细胞间紧密连接的破化能力及跨膜传播能力较野生株降低，提示其可能在宿主细胞间的扩散能力减弱，进而导致对宿主的致病力减弱。

综上所述，mbov_0503基因编码的蛋白mbov0503为牛支原体主要的黏附蛋白；与野生株比较，该mbov0503基因突变株表现出对宿主细胞黏附缺陷；对细胞间紧密连接的破化能力和跨膜传播能力减弱，这些特征导致该突变株将在致病和防控中具有潜在应用前景。

名词术语说明：

在本说明书中：

牛支原体mbov0503重组蛋白以mbov0503表示。

牛支原体mbov0503蛋白基因以mbov_0503表示。

牛支原体mbov0503基因突变株以牛支原体t4.4表示。

牛支原体本地分离株(或称野生株)以牛支原体hb0801表示。

序列表

<110>华中农业大学

<120>黏附能力降低的牛支原体基因缺失的突变株

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