一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及功能性乳酸菌开发及其制品生产开发领域。具体涉及一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2及其应用。

背景技术：

菊粉为一类天然果聚糖混合物，由呋喃果糖通过β-2,1-糖苷键相连，且在还原末端链接一个葡萄糖组成，聚合度一般为2～60。菊粉广泛分布于双子叶植物的菊科、桔梗科等及单子叶植物的百合科、禾本科植物中，尤其是菊芋和菊苣中菊粉占碳水化合物干重90％以上，是丰富而优良的果糖基可再生资源，可被用于生产生物乙醇、高果糖浆、低聚果糖、丙酮-丁醇、琥珀酸及甘露醇等(熊伍平，王成华，陆雁，王青艳，申乃坤，黄日波.一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质.生物加工过程.2013,11(3):40-45.)。菊粉酶是一类可以特异性切割菊粉等果聚糖内β-2,1-糖苷键的酶类，按照切割方式的不同，可以分为外切菊粉酶和内切菊粉酶两大类。内切菊粉酶是随机作用于菊粉内部的果糖苷键，产物主要为低聚果糖，外切菊粉酶(ec3.2.1.80)从菊粉链的非还原性末端的糖苷键开始逐一切下果糖基，形成可发酵性碳源，d-果糖。目前工业生产果糖浆的方法，主要是通过以淀粉为原料利用α-淀粉酶和葡萄糖异构酶等多酶联用的酶解法生产，但是该反应步骤多、工艺复杂、副产物多、果糖含量有限、生产成本较高。而利用外切菊粉酶水解菊粉，水解产物主要为果糖和少量的葡萄糖，此法转化率高、工艺简单，可以一步法生产高果糖浆。同时，大量文献报道，在酸性条件下对菊粉进行降解，可以有效防止副产物的产生，提高菊粉等果聚糖基原料降解产物的得率。因此，大力开发新型高效酸性菊粉酶，开发菊粉等果聚糖基原料的酸性酶解工艺，具有重要的应用前景和经济价值。

自然界中可以产生外切菊粉酶的微生物有很多，如细菌、真菌和酵母菌，目前研究较多的是曲霉属(aspegilliussp.)、青霉属(penicilliumsp.)和克鲁维酵母属(kluyveromycessp.)，但鲜见食源食品级微生物来源酸性菊粉酶的研究报道。2002年，paludan-muller等人首次报道了一株产弱酸性菊粉酶的lactobacilluspentosus，这也是目前唯一的一个乳酸菌来源的食源酸性菊粉酶(christinepaludan-muller,lonegram,fergalp.rattray.purificationandcharacterisationofanextracellularfructanb-fructosidasefromalactobacilluspentosusstrainisolatedfromfermentedfish.systematicandappliedmicrobiology,2002,25(1):13-20.)。

生榨米粉是广西壮族特色的一种传统发酵食物，其中蕴含着丰富的乳酸菌资源。本发明对本实验室前期构建的广西特色生榨米粉来源乳酸菌库进行高通量筛选，筛选出新型产酸性菊粉酶乳酸菌，将其应用于食品领域，特别是用于生产制备酸性菊粉酶，以及用于降解果聚糖类物质，例如菊粉，生产高果糖浆等。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一株新的产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2及其应用。该菌株具有发酵生产酸性菊粉酶以及用于降解果聚糖类物质制备果糖等产品的能力。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2，其序列如下：

于2019年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2019972，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，邮编：430072。

所述植物乳杆菌cctccno：m2019972，是来自本实验室前期从广西南宁壮族传统食物生榨米粉中分离获得。

所述植物乳杆菌cctccno：m2019972，在mrs固体培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘齐整，不透明。

所述植物乳杆菌cctccno：m2019972，采用细菌通用引物16srdna的27f/1492r对其基因组dna为进行pcr扩增并测序，获得1476bp的基因序列，如seqidno.1所示。blast分析表明，其与植物乳杆菌lactobacillusplantarumjl-1相似率达99.59％。

上述菌株在生产菊粉酶中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在生产菊粉酶中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在生产菊粉酶中的应用，包括如下步骤：

(1)种子培养

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2划线至mrs固体培养基，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落。

所述的mrs固体培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃高压灭菌15min；

20％葡萄糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/l，121℃高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的葡萄糖储备液。

(2)发酵培养

挑取在固体培养基中正常生长的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落。

所述固体发酵培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃条件下高压灭菌15min；

20％葡萄糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/l，在121℃条件下高压灭菌20min。

挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，于30℃，静置发酵1～2天，得到发酵液。

(3)制备酸性菊粉酶

吸取发酵液10ml，在4℃、10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入0.2mol/l、ph5.0的醋酸缓冲溶液400μl重悬沉淀，后加入100mg/ml的溶菌酶200μl，于30℃条件下静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃条件下于高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。

为实现上述目的，本发明采用的另一个技术方法是，

2.一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在生产菊粉酶中的应用，包括如下步骤：

(1)种子培养

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2划线至mrs固体培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；所述的mrs固体培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃条件下高压灭菌15min；

20％菊糖储备液：用超纯水配制菊糖溶液200g/l，于121℃条件下高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的菊糖储备液；

(2)发酵培养

将mrs固体培养基中的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，在温度为30℃的条件下，静置发酵1～2天，得到发酵液；所述固体发酵培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，蒸馏水1000ml，ph6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；

20％菊糖储备液：用超纯水配制菊糖溶液200g/l，于121℃条件下高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的菊粉溶液；

(3)制备酸性菊粉酶

吸取发酵液10ml，在4℃、10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀，向沉淀中加入0.2mol/l、ph5.0的醋酸缓冲溶液400μl重悬沉淀后，加入100mg/ml的溶菌酶200μl，于30℃条件下静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃条件下于高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。

本发明方法制备得到的酸性菊粉酶，其最适反应温度为35℃，且在20～40℃之间保温30min可保持50％以上的活力，最适ph为4.5，在ph3.5～ph8之间酶可保持65％以上的活力，ph耐受范围较广泛。

其中，菊粉酶的酶活定义如下：在最适温度、最适ph条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(u)。

本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2的发酵液在降解果聚糖类物质中的应用，优选的是菊粉类物质，所述应用包括在菊粉果糖和菊粉高果糖浆中的应用。

本发明所述植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2发酵生产的酸性菊粉酶在降解果聚糖类物质中的应用，优选的是菊粉类物质，所述应用包括在菊粉果糖和菊粉高果糖浆中的应用，均在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果是：

(1)提供一株新的产酸性菊粉酶的植物乳杆菌，该菌株以菊粉为碳源、牛肉膏为氮源等组成的发酵培养基，在ph6.6-6.8，于30℃条件下静置发酵生产酸菊粉酶，发酵液及酶同时具有菊粉酶活性和转化酶活性。

(2)提供的植物乳杆菌酸性菊粉酶最适ph为4.5，在ph3.5-ph8.0广泛范围内具有较高的稳定性，特别适合于酸性条件下水解果聚糖类物质，例如菊粉等工业用途。

附图说明

图1为实施例1中植物乳杆菌cctccno：m2019972的菌落形态图

图2为实施例3中酸性菊粉酶酶活随温度变化图

图3为实施例3中酸性菊粉酶残余酶活随处理温度变化图

图4为实施例4中酸性菊粉酶酶活随ph变化图

图5为实施例4中酸性菊粉酶残余酶活随ph变化图

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。

实施例1产酸性菊粉酶植物乳杆菌3-2菌株的培养和鉴定

(1)产酸性菊粉酶植物乳杆菌3-2菌株的培养

从-80℃超低温冰箱中取出本实验室前期从广西壮族传统生榨米粉中筛选出的植物乳杆菌3-2，以接种环划线接种于mrs固体培养基(牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；使用时加入2％葡萄糖)，于30℃培养直至出现单菌落；以接种环挑取单菌落划线接种至以菊粉为唯一碳源的固体发酵培养基中(牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；使用时加入2％菊粉)，于30℃培养直至出现单菌落。

(2)产酸性菊粉酶植物乳杆菌3-2菌株的鉴定

如图1所示，植物乳杆菌3-2菌株在以菊粉为唯一碳源的mrs培养基中菌落特征属于典型的植物乳杆菌，菌落为乳白色，表面光滑细密，微凸起，边缘齐整，不透明。

以植物乳杆菌3-2基因组dna为模版，以通用引物27f和1492r扩增16srrna基因序列进行菌株的分子鉴定。引物27f和1492r具体序列分别为序列表seqidno.2和seqidno.3。按照表1构建pcr反应体系，借助于pcr热循环仪进行扩增，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃终延伸2min。将pcr产物按照dna产物纯化试剂盒操作方法进行纯化后，委托六合华大基因科技有限公司(广州测序部)进行正反向测序。测序结果表明，植物乳杆菌3-2的16srrna基因由1476bp组成，具体序列如seqidno.1所示。

表1pcr反应体系

植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2，于2019年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏号为cctccno：m2019972，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，邮编：430072。

实施例2

一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在生产菊粉酶中的应用，包括如下步骤：

(1)种子培养

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2划线至mrs固体培养基，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落。

所述的mrs固体培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃高压灭菌15min；

20％葡萄糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/l，121℃高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的葡萄糖储备液。

(2)发酵培养

挑取在固体培养基中正常生长的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落。

所述固体发酵培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃条件下高压灭菌15min；

20％葡萄糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/l，在121℃条件下高压灭菌20min。

挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，于30℃，静置发酵1～2天，得到发酵液。

(3)制备酸性菊粉酶

吸取发酵液10ml，在4℃、10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入0.2mol/l、ph5.0的醋酸缓冲溶液400μl重悬沉淀，后加入100mg/ml的溶菌酶200μl，于30℃条件下静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃条件下于高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。

(4)菊粉酶酶活测定

酶活测定方法：取100μl酸性菊粉酶分别加入200μl用ph5.0、0.2m醋酸缓冲液配制的0.5％菊粉溶液和200μl用ph5.0、0.2m醋酸缓冲液配制的0.5％蔗糖溶液，于30℃水浴中反应30min后，立即沸水浴5min终止反应，在反应液中加入300μldns，于沸水浴中7min，待迅速冷却后于540nm处测定生成的还原糖量，以在沸水浴中加热灭活的酶液作为空白对照。酶活定义：在最适温度、最适ph条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(u)。其中一个菊粉酶活力(i)单位定义为每分钟催化菊粉转化为1μmol果糖所需的酶量，一个转化酶活力(s)单位定义为每分钟催化蔗糖转化为1μmol果糖所需的酶量。蛋白质含量的测定采用bca蛋白定量试剂盒(北京康为世纪公司)方法进行，以bsa(牛血清白蛋白)为标准蛋白。

如表2所示，植物乳杆菌3-2发酵生产酸性菊粉酶比活力为0.07u/mg，i/s值为0.23，这表明为外切菊粉酶。

表2酸性菊粉酶酶活、转化酶活、蛋白总含量及比酶活力结果

实施例3

一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在生产菊粉酶中的应用，包括如下步骤：

(1)种子培养

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2划线至mrs固体培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；所述的mrs固体培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，在ph6.6～6.8、121℃条件下高压灭菌15min；

20％菊糖储备液：用超纯水配制菊糖溶液200g/l，于121℃条件下高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的菊糖储备液。

(2)发酵培养

将mrs固体培养基中的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，在温度为30℃的条件下，静置发酵1～2天，得到发酵液；所述固体发酵培养基配方如下：

牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801ml，蒸馏水1000ml，ph6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；

20％菊糖储备液：用超纯水配制菊糖溶液200g/l，于121℃条件下高压灭菌20min；

使用时加入终浓度为2％的菊粉溶液。

(3)制备酸性菊粉酶

吸取发酵液10ml，在4℃、10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀，向沉淀中加入0.2mol/l、ph5.0的醋酸缓冲溶液400μl重悬沉淀后，加入100mg/ml的溶菌酶200μl，于30℃条件下静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃条件下于高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。

实施例4

植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2酸性菊粉酶的最适反应温度和温度稳定性

酸性菊粉酶的制备同实施例2，其最适反应温度的测定方法如下，取100μl酸性菊粉酶，加入200μl用ph5.0、0.2m醋酸缓冲液配制的0.5％菊粉溶液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃下反应30min后立即沸水浴5min以终止反应，然后dns法测定酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个温度设置3个平行样品。

酸性菊粉酶的温度耐受性测定方法，是将100μl酸性菊粉酶在20℃至80℃温度范围内，保温30min，然后加入200μl用ph5.0、0.2m醋酸缓冲液配制的0.5％菊粉溶液在30℃下反应30min，最后dns法测定生成还原糖的量，以测定结果最高酶活为100％，计算不同温度处理条件下残余酶活力的大小。每个温度设置3个平行样品。

结果如图2所示，植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2菊粉酶最适反应温度为35℃，30-40℃范围内基本不变，温度超过40℃酶活急剧下降。如图3表明，酸性菊粉酶在40℃以下可以保持60％以上活力，但45℃条件下酶活快速下降，酶活不足原酶活的30％。

实施例5

植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2酸性菊粉酶的最适反应ph和ph稳定性

酸性菊粉酶的制备同实施例2，其最适反应ph的测定方法如下，配制不同ph的缓冲液，ph3.5、4.0、4.5、5.0为醋酸缓冲液，5.5、6.0、6.5、7.5为磷酸缓冲液，8.0、8.5、9为tris-hcl缓冲液，9.5、10.0、10.5、11为碳酸缓冲液。将100μl酸性菊粉酶与200μl以上述不同ph缓冲也配制的菊粉溶液在30℃下反应30min后立即放入沸水终止反应，再用dns法测酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个ph设置3个平行样品。ph稳定性测定，分别将50μl酸性菊粉酶与50μl不同ph的缓冲液混合，于4℃放置1h后，加入200μl菊粉溶液在30℃下反应30min后立即放入沸水终止反应，再用dns法测酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个ph设置3个平行样品。

结果如图4所示，植物乳杆菌3-2菊粉酶的最适反应ph为4.5，在ph4.5-6.5的酸性范围内，可以保持90％以上的相对酶活力，在ph3.5-8.0之间都有65％以上的酶活力。如图5所示，植物乳杆菌3-2菊粉酶具有较宽的ph耐受范围，在ph3.5-6.0范围内，酶活不受ph值的影响，可以保持95％以上活力，在ph6.5-8.5范围内，可以保持65％以上活力，但ph值高于8.5时酶活力急剧下降。

实施例6

利用植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2发酵液降解果聚糖类物质

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在30℃条件下静置发酵1-2天，制备发酵液，利用发酵液降解果聚糖类物质。以2％菊糖型果聚糖为底物，将100μl发酵液与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的发酵液作为空白对照，用dns法检测到产物中还原糖浓度为310μmol/l，证明植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2发酵液具备降解果聚糖类物质的能力。

实施例7

利用植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2发酵液降解菊粉

将植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2在30℃条件下静置发酵1-2天，制备发酵液，利用发酵液降解菊粉。以2％菊粉为底物，将100μl发酵液与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的发酵液作为空白对照，用dns法检测到产物中还原糖浓度为307μmol/l，证明植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2发酵液具备降解菊粉的能力。

实施例8

利用植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶降解果聚糖类物质。

酸性菊粉酶的制备方法同实例一，利用酸性菊粉酶降解果聚糖类物质。以2％菊糖型果聚糖为底物，将100μl酸性菊粉酶与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的酶作为空白对照，用dns法检测到产物中还原糖浓度为658μmol/l，证明植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶具备降解果聚糖类物质的能力。

实施例9

利用植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶降解菊粉。

酸性菊粉酶的制备方法同实例一，利用酸性菊粉酶降解菊粉。以2％菊粉为底物，将100μl酸性菊粉酶与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的酶作为空白对照，用dns法检测到产物中还原糖浓度为698μmol/l，证明植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶具备降解菊粉的能力。

实施例10

利用植物乳杆菌lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶制备高果糖浆

酸性菊粉酶的制备方法同实例1。将酸性菊粉酶于4℃冰浴中，以饱和度为40％硫酸铵盐析后4℃离心以除去杂蛋白，有少量的沉淀，且只有少许菊粉酶活力，说明大部分菊粉酶还保留在发酵液中，以饱和度为80％硫酸铵继续盐析时，上清液中几乎没有酶活，说明大部分目的蛋白已被沉淀出来，用缓冲液溶解目的蛋白，得到初纯酶液。利用初纯酶液水解菊粉制备高果糖浆。以2％菊粉为底物，将100μl初纯酶液与200μl底物混合，在35℃下反应10h，然后用薄层色谱法(tlc)检测水解产物，其中展开剂为正丁醇、异丙醇、醋酸、水按7:5:1:2(体积比)混合，显色剂为2％二苯胺丙酮溶液、2％苯胺丙酮溶液、85％磷酸按5:5:1的比例混合。

薄层色谱结果表明，标准品菊粉和果糖被染成红色，葡萄糖被染成蓝色，菊粉迁移距离低于果糖和葡萄糖，而果糖与葡萄糖位置相当，菊粉几乎100％被lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶水解成为果糖，这与阳性对照leuconostoccitreum1-1菊粉酶的水解结果相同，这表明lactobacillusplantarum3-2所产酸性菊粉酶可用于制备高果糖浆。

本发明不限于上述技术方案，对本发明的任何改进，包括对该技术方案进行多种简单变形，均落在本发明的保护范围内。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中描述的各个具体技术特征，在不矛盾情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可任意进行组合，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110>南宁中诺生物工程有限责任公司

<120>一株产酸性菊粉酶的植物乳杆菌及其应用

<160>1

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<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum3-2)

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