一种沼泽红假单胞菌培养基及其应用的制作方法

本发明属于微生物培养
技术领域：
，具体涉及一种沼泽红假单胞菌培养基及其应用。
背景技术：
：沼泽红假单胞菌属于红螺菌科、红假单胞菌属，是目前研究和应用最广泛的一种光合细菌。光合细菌是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。沼泽红假单胞菌是我国农业部允许使用的饲料级微生物之一，其制剂已被广泛应用于水产养殖、饲料添加剂、污水处理等多个领域,并取得巨大的经济、生态和社会效益。在水产养殖中，往鱼虾类养殖池中投入沼泽红假单胞菌，尤其在池塘深层底泥缺氧条件下，既能分解有机废物,又能降低水中硫化氢、氨浓度，保持水质的清洁；另外，由于沼泽红假单胞菌含有鱼、虾体内生长发育所需的活性物质和微量元素，包括蛋白质、氨基酸、b族维生素和辅酶q等生物活性物质，它们是鱼虾体内酶、激素、生物活性物的激活剂或辅酶，可使酶及生物活性物的活性及含量发生变化从而促进鱼、虾生长发育，减少饲料用量；并且，沼泽红假单胞菌具有抗病和提高机体免疫力的作用，能有效防止水产生物生病。专利cn104388364a公开了一种海水光合细菌的发酵培养基，组分为氯化铵、酵母浸粉、蛋白胨、无水乙酸钠、磷酸铁及海水，其实施例中显示，培养6天后od660nm为1.635(对光合细菌发酵产量多少一般用660nm下的吸光度值表示，即od660nm。)；专利cn105199993公开了一种光合细菌培养基及其制备方法，组分为三水合乙酸钠、硫酸铵、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁及水，采用本发明培养基培养，光合细菌od660nm为2.2；专利cn107746821a公开了一种光合细菌培养基，组成为含碳有机物、氯化铵、酵母膏、蛋白胨、氯化镁、氯化钙、酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化锰、硫酸锌及蒸馏水，其实施例中显示，培养后od660nm为2.8。由于关于对光合细菌高密度发酵配方的深入研究的文献资料有限，导致现有市售产品普遍存在有效活菌数低，杂菌多，产品稳定性差，保质期短等众多问题，限制了光合细菌在水产养殖中的应用。技术实现要素：本发明针对现有技术不足，提供了一种沼泽红假单胞菌培养基及其应用，通过配方优化，大大提高了沼泽红假单胞菌菌剂的品质，使得该菌剂有效活菌数高，颜色正，无分层，杂菌率低，品质稳定，保存效果好，将使用该培养基培养的沼泽红假单胞菌菌剂运用在水产养殖中取得了良好的效果。首先，本发明所述的沼泽红假单胞菌培养基，其组成和配方包括：柠檬酸0.75-1.25g/l，牛肉膏1.50-3.00g/l，酵母膏0.42-0.62g/l，蛋白胨1.50-2.00g/l，乙酸钠0.40-0.60g/l，硫酸镁0.25-0.50g/l，硫酸亚铁5.00-8.00mg/l，vb60.1-0.3mg/l，氯化钙0.10-0.30g/l，磷酸二氢钾0.10-0.25g/l，复合无机盐溶液0.5-1.0ml/l，溶剂为水，调节ph至6.8-7.0。所述的复合无机盐溶液中包括：edta0.5g/l,硫酸锌0.01g/l，硼酸0.03g/l，氯化锰0.003g/l，氯化钙0.02g/l，氯化铜0.001g/l，钼酸钠0.003g/l，溶剂为水。所述柠檬酸为含一个结晶水的柠檬酸，乙酸钠为含三个结晶水的乙酸钠，硫酸镁为无水硫酸镁，硫酸亚铁为含七个结晶水的硫酸亚铁，氯化钙为无水氯化钙，磷酸二氢钾为无水硫酸二氢钾。优选的，沼泽红假单胞菌培养基采用质量浓度为20％的氢氧化钠或氢氧化钾调节ph。优选的，培养基组分中的磷酸二氢钾、复合物无机盐溶液需要进行单独灭菌。发明人进一步利用本发明的培养基研究得到一种沼泽红假单胞菌菌剂的培养方法，技术方案如下：将沼泽红假单胞菌菌种接种在水产养殖沼泽红假单胞菌培养基中进行厌氧培养，接种量10-50％，光照强度3000-5000lux，温度30-33℃，培养时间2-7天，颜色由浅红，红，逐渐变为红褐色即为培养成熟。本发明培养所选用的中安泽宏假单胞菌菌种均为常规市售菌种。该菌剂更为具体的制备步骤包括(1)菌种活化，(2)菌种培养，(3)扩大培养：(1)菌种活化：将菌种接种在透光试管培养基中活化，接种量30-50％，光照强度3000-5000lux，30-33℃恒温密封培养3-5天，颜色由浅红、红、逐渐变为红褐色即为培养成熟；优选的，培养期间每天应摇晃转动试管至少1次，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长。优选的，试管总装液量为90％。(2)种子培养：将步骤(1)活化好的菌种转接到透光培养容器进行培养，接种量30-50％，光照强度3000-5000lux，30-33℃恒温密封培养2-4天，颜色由浅红、红、逐渐变为红褐色即为培养成熟，得到种子液；(3)扩大培养：将种子液接种到更大的培养容器中，接种量10-30％，培养条件：光照强度3000-5000lux，控制温度30-33℃，密封培养5-7天。优选的，所有培养容器均采用化学灭菌法，具体为0.5‰次氯酸钠水溶液浸泡12-24小时或用75％酒精涮洗2遍；培养基中磷酸二氢钾、复合物无机盐溶液、其他剩余组分采用115℃，10min灭菌。采用上述方法及水产养殖专用沼泽红假单胞菌培养基生产的沼泽红假单胞菌菌体密度高，所获得菌液用纯水稀释20倍后od660nm为0.460，有效活菌数可高达8.96*109个/ml。将其应用于水厂养殖，可使水体中的氨氮、亚硝酸盐含量快速降低，有效增加水体溶解氧，极大提高水产养殖的产量。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明培养基配方中硫酸亚铁及vb6的复合添加对菌种生长起着至关重要的作用，光合细菌处于厌氧条件下可在光能驱动下通过电子传递进行一种循环光和磷酸化，电子从菌绿素分子上逐出，经过辅酶q、细胞色素bc1、铁硫蛋白和细胞色素bc1的循环式传递，重新被菌绿素接受，期间建立质子电动势和产生1个atp，在此供应atp的条件下，能使外源电子供体逆电子流产生还原力，促使光和磷酸化与calvin循环相联系，固定二氧化碳，从而促使菌体生长繁殖。而本发明中硫酸亚铁及vb6能在光合细菌进行循环光合磷酸化的过程中作为有效果的外源电子供体逆电子流产生还原力，促使光和磷酸化与calvin循环相联系，固定二氧化碳，从而使菌体大量生长繁殖，其次，硫酸亚铁的用量需适中，过量则亚铁离子可能形成硫化亚铁、铁氧化物等产物使菌剂颜色偏深；该配方生产的菌剂颜色正，无分层，发酵周期短，ph不升高，菌体对培养基利用彻底，有效抑制发酵期间藻类及杂菌的滋生。将配方生产的沼泽红假单胞菌菌剂应用于水厂养殖，可使水体中的氨氮、亚硝酸盐含量快速降低，有效增加水体溶解氧，极大提高水产养殖的产量。本发明培养基中减少含钠离子的有机物为碳源，并添加磷酸缓冲盐，使菌种在培养过程中ph变化平缓，且不会超过7.5影响菌体生长。本发明培养基中碳氮源比例合理，微量元素全面，沼泽红假单胞菌利用营养充分，从而可有效抑制生长过程中藻类及杂菌污染，有利于解决长期困扰光合细菌生产厂家的问题。运用本发明培养基配方生产的沼泽红假单胞菌细菌生长周期短，菌剂颜色鲜艳均一，无黏壁和分层现象，常温保存时间可达1年以上。将配方生产的水产养殖专用沼泽红假单胞菌菌剂应用于水厂养殖，可使水体中的氨氮、亚硝酸盐含量快速低，有效增加水体溶解氧，极大提高水产养殖的产量。附图说明图1为实施例1中od660nm方法测得的生长趋势图；图2为实施例1中mpn5法测得的生长趋势图。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。实施例1一种沼泽红假单胞菌培养基，配方：柠檬酸1.05g/l，牛肉膏2.75g/l，酵母膏0.52g/l，蛋白胨1.93g/l，乙酸钠0.50/l，硫酸镁0.35g/l，氯化钙0.25g/l，磷酸二氢钾0.14g/l，硫酸亚铁5mg/l，vb60.2mg/l，复合无机盐溶液0.5ml/l(edta0.5g/l,硫酸锌0.01g/l，硼酸0.03g/l，氯化锰0.003g/l，氯化钙0.02g/l，氯化铜0.001g/l，钼酸钠0.003g/l)，ph6.8-7.0；培养基中磷酸二氢钾、复合物无机盐溶液、其他剩余组分分别采用115℃，10min灭菌。将本上述培养基作为实验组，设置对照组，培养基选用传统rcvbn配方：dl-苹果酸4.0g/l，硫酸镁0.12g/l，硫酸铵1.0g/l，氯化钙0.075g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，edta-2na0.020g/l，vb10.001g/l，尼克酸0.001g/l，生物素0.015g/l，t.m储备液1ml(硼酸0.7g/l，硫酸锰0.389g/l，钼酸钠0.188g/l，硝酸铜0.02g/l)，常规方法灭菌。将实施例1的本发明培养基与对照组培养基，同样条件，接种同样的菌种及接种量进行培养，菌种选用沼泽红假单胞菌菌株cgmcc1.5007。具体的，对两组培养基均接种处于对数期的种子液，有效活菌数为6.20*109个/ml，20l塑料桶培养，接种量10％，33℃，白炽灯光照4000lux，周期7天。采用2种方法进行跟踪监测沼泽红假单胞菌的生长趋势。(1)跟踪检测660nm波长下菌剂稀释20倍的吸光度值(即od660nm)，绘制生长曲线(图1)；(2)根据标准ny527-2002中的mpn5法检测菌量，绘制生长曲线(图2)。由图1和图2结果可知，实验组与对照组培养基中od660nm与菌量生长趋势基本相同，但同时期相比，实验组的od660nm与菌量均远远优于对照组，即本发明培养基优于传统的rcvbn配方，更利于沼泽红假单胞菌的快速生长，同时不会加速菌株的衰老。实施例2一种沼泽红假单胞菌培养基，配制步骤如下(以20l培养基液为例)：(1)称取柠檬酸22.0g，牛肉膏57.0g，酵母膏12.0g，蛋白胨39.0g，乙酸钠11.0g，硫酸镁8.0g，硫酸亚铁160.0mg，vb64.0mg,氯化钙5.0g于烧杯中，用20％氢氧化钾调节ph至6.8，纯水定容至19.9l，搅拌使其混合均匀；(2)称取磷酸二氢钾4.0g于烧杯中，纯水定容至100ml，搅拌使其混合均匀；(3)称取edta0.5g，硫酸锌0.01g，硼酸0.03g，氯化锰0.003g，氯化钙0.02g，氯化铜0.001g，钼酸钠0.003g于烧杯中，纯水定容至1000ml，搅拌使其混合均匀；(5)将(1)、(2)、(3)步骤中三种溶液分装，115℃，10min灭菌。(6)灭菌后的溶液凉至60-80℃，在无菌环境下，将(1)、(2)种两种溶液混合，再加入16ml(3)混匀后进行分装已经灭菌的试管、塑料瓶、塑料桶等培养容器，即为配制好的培养基，凉至室温，待接种。利用上述培养基制备沼泽红假单胞菌菌剂，选用沼泽红假单胞菌菌株cgmcc1.5007，培养过程如下：(1)菌种活化：将液体菌种接种在透光性较好的试管(25mm*180mm)中活化，接种量40％，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，培养时间4天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，4天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.289，菌量为5.70*109个/ml。(2)一级种子培养：一级种子选用500ml透光塑料瓶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，3天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.321，菌量为6.30*109个/ml。(3)二级种子培养：二级种子选用10l的透光塑料桶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，有菌液固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为红褐色即为培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.350，菌量为6.80*109个/ml。(4)扩大生产：生产光合细菌选用20l透光塑料桶，培养条件：白炽灯光照强度4000lux，控制温度33℃，密封，装液量90％，接种量10％，培养7天，明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，菌剂培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.430，菌量为8.49*109个/ml。菌剂应用如下：山东省滨州博兴县某养殖户鱼塘养殖南草鱼，虾塘面积5.0亩，水深2米。采用上述扩大培养的水产养殖专用沼泽红假单胞菌剂对养殖池塘水体进行改良，上午8：00泼洒上述菌剂，总共10.0kg，使用两天后，氨氮由原来1.6mg/l降至0.4mg/l，亚硝酸盐由0.40mg/l降至0.01mg/l以下，水体也由浑浊变得澄清，大幅度改善了水质，提高了鱼的进食量，增加了鱼的产量。实施例3一种沼泽红假单胞菌培养基，配制步骤如下(以20l培养基液为例)：(1)称取柠檬酸18.0g，牛肉膏30.0g，酵母膏10.0g，蛋白胨36.0g，乙酸钠10.0g，硫酸镁6.0g，硫酸亚铁100.0mg，vb63.0mg，氯化钙4.0g于烧杯中，用20％氢氧化钾调节ph至6.8，纯水定容至19.9l，搅拌使其混合均匀；(2)称取磷酸二氢钾2.0g于烧杯中，纯水定容至100ml，搅拌使其混合均匀；(3)称取edta0.5g，硫酸锌0.01g，硼酸0.03g，氯化锰0.003g，氯化钙0.02g，氯化铜0.001g，钼酸钠0.003g于烧杯中，纯水定容至1000ml，搅拌使其混合均匀；(4)将(1)、(2)、(3)步骤中三种溶液分装，115℃，10min灭菌。(5)灭菌后的溶液凉至60-80℃，在无菌环境下，将(1)、(2)种两种溶液混合，再加入10ml(3)，混匀后进行分装已经灭菌的试管、塑料瓶、塑料桶等培养容器，即为配制好的培养基，凉至室温，待接种。利用上述培养基制备沼泽红假单胞菌菌剂，选用沼泽红假单胞菌菌株cicc23812，培养过程如下：(1)菌种活化：将液体菌种接种在透光性较好的试管(25mm*180mm)中活化，接种量40％，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，培养时间4天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，4天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.230，菌量为4.54*109个/ml。(2)一级种子培养：一级种子选用500ml透光塑料瓶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，3天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.260，菌量为5.13*109个/ml。(3)二级种子培养：二级种子选用10l的透光塑料桶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，有菌液固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为红褐色即为培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.289，菌量为5.70*109个/ml。(4)扩大生产：生产光合细菌选用20l透光塑料桶，培养条件：白炽灯光照强度4000lux，控制温度33℃，密封，装液量90％，接种量10％，培养7天，明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，菌剂培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.415，菌量为8.20*109个/ml。菌剂应用如下：山东省滨州市博兴县某养殖户育苗温室内的虾池，池面积7.0亩，水深1.5m，从虾z1幼体开始泼洒光合细菌，直到仔虾出池为止。每日投量为1.0kg，在每日早晨换水后，把原液稀释后投入。整个育苗期间，ph可稳定在8.0左右，氨氮和cod变化较平缓，明显低于未使用光合细菌的对照虾池，每立方水体的育苗量平均达到42.5万尾，比对照组提高了120％；对虾幼体的成活率达65％，比对照组提高150％。由此表明，在促进水生态系的物质循环和水质净化过程中，该菌剂发挥了重要作用。实施例4一种沼泽红假单胞菌培养基，配制步骤如下(以20l培养基液为例)：(1)称取柠檬酸21.0g，牛肉膏55.0g，酵母膏10.4g，蛋白胨38.6g，乙酸钠10.0g，硫酸镁7.0g，硫酸亚铁120.0mg，vb63.0mg，氯化钙2.0g于烧杯中，用20％氢氧化钾调节ph至6.8，纯水定容至19.9l，搅拌使其混合均匀；(2)称取磷酸二氢钾2.8g于烧杯中，纯水定容至100ml，搅拌使其混合均匀；(3)称取edta0.5g，硫酸锌0.01g，硼酸0.03g，氯化锰0.003g，氯化钙0.02g，氯化铜0.001g，钼酸钠0.003g于烧杯中，纯水定容至1000ml，搅拌使其混合均匀；(4)将(1)、(2)、(3)步骤中三种溶液分装，115℃，10min灭菌。(5)灭菌后的溶液凉至60-80℃，在无菌环境下，将(1)、(2)种两种溶液混合，再加入10ml(3)，混匀后进行分装已经灭菌的试管、塑料瓶、塑料桶等培养容器，即为配制好的培养基，凉至室温，待接种。利用上述培养基制备沼泽红假单胞菌菌剂，选用济南奥凯化工有限公司销售沼泽红假单胞菌，培养过程如下：(1)菌种活化：将液体菌种接种在透光性较好的试管(25mm*180mm)中活化，接种量40％，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，培养时间4天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，4天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.298，菌量为5.88*109个/ml。(2)一级种子培养：一级种子选用500ml透光塑料瓶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，培养期间每天应摇晃转动试管，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，3天后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，纯水稀释20倍od660nm为0.232，菌量为6.37*109个/ml。(3)二级种子培养：二级种子选用10l的透光塑料桶进行培养，密封，装液量90％，光照强度4000lux，33℃恒温培养，接种量在30％，培养时间3天，有菌液固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为红褐色即为培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.355，菌量为7.00*109个/ml。(4)扩大生产：生产光合细菌选用20l透光塑料桶，培养条件：白炽灯光照强度4000lux，控制温度33℃，密封，装液量90％，接种量10％，培养7天，明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，菌剂培养成熟，纯水稀释20倍od660nm为0.457，菌量为8.96*109个/ml。菌剂应用如下：山东省东营市利津县某养殖户虾塘养殖南美白对虾，两个虾塘进行实验，面积均为7.5亩，水深均为2米。采用上述扩大培养的水产养殖专用沼泽红假单胞菌剂对其中一个实验组虾塘水体进行改良，使用菌剂前后水质及水质指标、南美白对虾生长情况，如表1所示。2019.08.10上午8：00第一次泼洒菌剂，2019.08.25上午8：00第二次泼洒菌剂，每次菌剂施用量为15.0l。另外一个虾塘作为对照未用该菌剂处理，其它条件均一致。表1水产养殖专用沼泽红假单胞菌剂使用前后效果对照表时间ph溶解氧氨氮(mg/l)亚硫酸盐(mg/l)使用前7.65.50.900.60使用后2d8.38.20.300.10使用后30d8.38.5<0.10<0.10由表1可见，该养殖池塘使用本发明培养基培养的沼泽红假单胞菌菌剂后快速降低了池塘的氨氮、亚硝酸盐含量，氨氮由0.90mg/l降至0.30mg/l，亚硝酸盐由0.60mg/l将至0.10mg/l，并使水中溶解氧由5.5增加至8.5，有效改善水体环境。同时，通过一个月的时间，两次施用该菌剂，使得南美白对虾快速生长，平均体重由25.0g/尾增加至52.6g/尾，体重增加110.4％；相比于没有经过该菌剂处理的对照组(体重增加80.4％)多增加30个百分点。故本发明方法提供的产品可用于水产养殖池塘，可有效减低水体的氨氮、亚硫酸盐，减轻毒性，有效改善水体环境，提高水产养殖产量，是生态养殖的优良改良剂。当前第1页12