一种红霉素降解菌RJJ-61及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种红霉素降解菌rjj-61及其应用。

背景技术：

随着抗生素的需求量日益增大，抗生素药厂在生产过程中产生了越来越多的具有严重污染的菌渣，其主要成分是发酵抗生素产生的菌丝体、废弃培养基、发酵过程中产生的代谢产物、以及少量的抗生素等。含有一定量抗生素的菌渣废弃物被国家部门认定为危险废弃物。不当的处理方法极易造成环境污染和生态危害，同时也是资源的浪费。

抗生素菌渣进入环境后，会诱导和传播大量耐药菌，特别是致病菌和条件致病菌中的抗药性在不断增加，这极大的阻碍对于疾病的治疗。由于抗生素的大规模使用使其在各种环境中均能进行迁移和转化，其所诱导生成的抗性基因也具有很高的活性和迁移转化特性。红霉素作为常用抗生素，在生产过程存在这样同样的问题。

红霉素菌渣处理方法大致有:焚烧处理、厌氧消化技术处理、饲料化处理、肥料化处理、菌渣提纯、能源化处理等。近几年来，由于红霉素产量的不断增加，红霉素菌渣的产生量也不断增加，处理成本较大、能量消耗大且国家重点整治土壤污染问题，因此迫切需要更多安全的方法来处理抗生素菌渣。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种红霉素降解菌，即湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株湖生戴尔福特菌，该湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61，已于2019年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.19233。

本发明的第二个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61在制备用于红霉素降解的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61在制备用于红霉素环境污染后修复的制剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61在制备用于红霉素残留污染后土壤修复的制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61在制备用于红霉素残留污染后水体修复的制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供了一种降解红霉素的方法，将上述的湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61接种于含有红霉素的体系中培养，即可实现降解红霉素。

进一步的，上述的一种降解红霉素的方法，所述培养温度为37℃，培养时间为72h。

本发明的第七个目的是提供了一种红霉素降解菌干粉剂，所述干粉剂中含有上述的湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61。

本发明的第八个目的是提供了上述一种红霉素降解菌干粉剂的制备方法，是将湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

本发明通过微生物技术法，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，得到无污染的代谢产物。微生物将红霉素作为其生长所需的碳源和能源，并在酶的作用下水解成简单化合物，最终降解为h2o和co2等代谢产物，且具有成本低，无二次污染优点。使用这种方法能够高效清洁的处理红霉素菌渣，极大减少了环境的负担，符合现在国家所倡导的可持续发展的新理念。

本发明的有益效果为：本发明提供的红霉素降解菌及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂，是通过微生物技术法，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，得到无污染的代谢产物。实验证明，本发明的红霉素降解菌rjj-61可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到40％-60％。本发明所提供的红霉素降解菌rjj-61可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。

附图说明

图1显示为红霉素降解菌(湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61)的单菌落形态图。

图2显示为实施例2的红霉素降解曲线。

图3显示为实施例3的红霉素降解曲线。

图4显示为实施例4的红霉素降解曲线。

具体实施方式

实施例1：

红霉素降解菌(湖生戴尔福特菌(delftialacustris)rjj-61)的筛选方法，步骤如下：

称取一定量菌渣，加入蒸馏水，稀释10倍。取1ml上清液，加入9ml无菌水梯度稀释，稀释至1000倍，取上清液加入含红霉素的msm无菌培养基，置于37℃、180rpm摇床中培养5天。将上述所得上清液均匀涂布在含红霉素的msm固体培养基上，然后放入37℃培养箱培养3-5天，在lb平板上划线分离，得到红霉素降解菌rjj-61，其单菌落形态如图1所示。

菌株鉴定

采用振荡破碎法获得红霉素降解菌rjj-61基因组dna，通过pcr方法对菌株16srrna基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16srrna基因的上游引物序列为：5’agagtttgatcctggctcag3’，下游引物序列为5’ggttaccttgttacgactt3’。

pcr反应条件是：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。使用ncbi的blast功能在genebank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：湖生戴尔福特菌(delftialacustris)。

红霉素降解菌rjj-61的16srrna基因序列见序列表中序列1。菌株的16srrna基因序列如genebank：mn759464所述。

(一)主要材料

1、培养基

lb培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，超纯水1000ml。

msm无机盐培养基：nh4cl0.630g，k2hpo4·3h2o1.965g，kh2po40.500g，nano31.00g，mgso40.100g，超纯水1000ml。

相对应的固体培养基则在1l液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。

2、仪器设备

flexcyclerpcr扩增仪，tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，uv1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。

(二)红霉素降解测定

(1)红霉素标准曲线的绘制

准确称取10.0mg工业纯红霉素于100ml容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有100.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0和80.0mg/l的红霉素标准溶液。

标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)-0.2785

液相条件：色谱柱：c18填料，260x4.6(mm)

流动相：v(0.025mol/l的k2hpo4溶液)∶v(乙睛)＝40∶60；

流速：0.75ml/min；进样量100μl。

柱温：50℃

紫外：210nm

(2)红霉素降解率测定方法

将降解菌接种到含有10mg的100ml液体msm培养基中，与添加50mg的100ml液体msm培养基中，接种量2％，置于37℃，ph＝7摇床中培养。每24h取一次发酵液，置于-20℃冰箱保存，一共取4天。

取1ml发酵液用4ml流动相稀释，后取2ml液体，10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜后利用液相进行检测分析，再以制备标准曲线得到的方程计算出红霉素含量，得出实验组红霉素的降解率。

实施例2：

将红霉素降解菌rjj-61在lb液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至od600＝1，将所选菌株接种1ml到100.0ml含100mg红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，37℃培养72h降解率为56.2％，红霉素降解效率果明显。

(图2)

实施例3

将红霉素降解菌rjj-61按1％的接种量接种于100克灭菌的土壤中，并加入100mg红霉素，于37℃条件下培养72h，经测定，测定降解率为：43.22％。(图3)

实施例4

将红霉素降解菌rjj-61按1％的接种量接种于100ml灭菌的含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素浓度为130mg/l，于37℃、180r/min条件下培养72h，测定红霉素降解率为：55.75％。(图4)

实施例5

红霉素降解菌rjj-61干粉剂的制备，红霉素降解菌rjj-61扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>常州大学

江苏碧奥环保科技有限公司

河北慈心环保科技有限公司

<120>一种红霉素降解菌rjj-61及其应用

<130>61

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1396

<212>dna

<213>delftialacustris

<400>2

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