一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的新型培养基和培养方法，其一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本发明通过采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖；啤酒酵母干渣和蚯蚓粉代替黄豆粉、蛋白胨、花生饼粉和玉米浆，优化其培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现红霉素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高红霉素A组分。
【专利说明】一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵【技术领域】，特别是涉及一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基和培养方法。
【背景技术】
[0002]红霉素是大环内酯类抗生素，抗菌谱与青霉素相似。
[0003]目前，国内生产厂家使用红色链霉素，采用三级发酵的模式生产红霉素。其种子培养基、发酵培养基主要采用淀粉和葡萄糖作为碳源；豆饼粉、花生饼粉、玉米浆或蛋白胨作为氮源，使用常规原辅料发酵生产红霉素存在的主要问题:
[0004]I发酵成本高。采用该配方，其原辅料的消耗占到生产成本的65%左右。
[0005]2增加企业的采购成本。红霉素种子培养基、发酵培养基氮源组成至少在3种以上，增加了企业的采购工作量和采购成本。
[0006]3 一级种子培养的接种量较大。国内部分厂家的红霉素生产规模可以达到万吨/年，其一级种子培养发酵罐的体积超过了 5m3，常规配方的一级种子培养接种量为1.5~2L/M3，增加了菌种研究人员的工作强度和工作量。
[0007]4种子培养的周期长。常规配方的红霉素种子培养周期为35~40h。
[0008]5红霉素发酵单 位较低。使用常规原辅料的培养基，红霉素的发酵单位一般在8000 ~9000u/ml。
[0009]6常规培养基在灭菌过程中，部分葡萄糖在高温状态容易碳化，使种子液和发酵液的颜色变深，降低培养基质量，影响种子培养和发酵培养的效果。
[0010]7红霉素A组分偏低。使用常规原辅料的培养基，红霉素A的组分一般控制在
62 ~68%ο
[0011 ] 8)发酵过程中，还需补入氨基酸。随着发酵时间的延长，发酵液中的氨基酸含量降低，需要补入氨基酸。
【发明内容】
[0012]本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种减少接种量，有效提高发酵单位，缩短发酵周期，同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现红霉素稳定、高效地生产的培养基。
[0013]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产红霉素的培养方法。
[0014]为实现上述目的所采取的技术方案为:
[0015]一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
[0016]所述一级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干渣20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙(λ 2~0.4g/L、硅油消泡剂0.01~0.03g/L。
[0017]所述二级种子培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干渣25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸铵0.06~0.08g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、硅油消泡剂0.02~0.04g/L。
[0018]所述发酵培养基的组成为:甘蔗糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干渣30~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、硫酸铵0.07~0.09g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化钴0.006~0.008g/L硫酸镁0.04~0.05g/L、硫酸锌0.03~0.05g/L、硫酸铜0.06~0.08g/L、硅油消泡剂0.02~0.03g/L。
[0019]所述啤酒酵母干渣的质量要求为:
[0020]蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≥5% ;灰分≥5% ;碳水化合物≥12% ；干渣颗粒通过60目筛的数量≥80%。
[0021]所述蚯蚓粉的质量要求:蛋白质含量≥60% ;水分≤10% ;粒度能通过80目筛。
[0022]所述甘蔗糖蜜在使用前进行预处理，预处理过程为:
[0023]I)甘蔗糖蜜中加入饮用水，使其粘度控制在IOOcp以下；
[0024]2 )加热升温至30~35 °C，
[0025]3)超滤，超滤膜材料为醋酸纤维素或聚氧乙烯，超滤过程中，物料的流量控制在4~5L/min，超滤压力控制在0.2MPa
[0026]4)加入蔗糖转化酶，蔗糖转化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg) X0.35。
[0027]—种红霉素链霉菌利用上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基发酵生产红霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为:首先将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液按照0.8~lL/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为20~25h时转移到二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为22~27h时转移至发酵培养基中培养，至发酵单位在11000u/ml以上且每6~8h检测的发酵单位相差300u/ml以内、菌体浓度35~40%、发酵周期为150~160h、pH值6~8、氨基氮5~10mg/100ml、总糖O~5g/100ml时终止发酵。
[0028]所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前首先进行灭菌，其中
[0029]灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖 30 ~40g/100ml、ρΗ6.5 ~7.5 ;
[0030]灭菌后的二级种子培养基的质量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷>50ug/ml、总糖 30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ;
[0031]灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>60ug/ml、总糖40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
[0032]所述一级种子培养条件为:
[0033]1)罐压:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0034]2)罐温:发酵前5h，罐温控制在31~32°C ；6h至一级种子培养结束，罐温控制在33 ~34°C，
[0035]3)空气流量:0~5h，100~150m3/h ；6h至一级种子培养结束:200~250m3/h，[0036]4) pH:控制在 7 ~8，
[0037]5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在110r/min。
[0038]所述二级种子培养条件为:
[0039]1)罐压:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0040]2)罐温:发酵前5h，罐温控制在31~32°C ；6h至二级种子培养结束，罐温控制在33 ~34°C，
[0041]3)空气流量:0~5h，300~350m3/h ；6h至二级种子培养结束:350~400m3/h，
[0042]4) pH:控制在 7 ~8，
[0043]5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在100r/min。
[0044]所述发酵培养条件为:
[0045]I) pH控制:控制在6~8 ;
[0046]2)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
[0047]3)空气流量:0 ~15h: 1000mVh ；16h ~发酵结束:800m3/h ；
[0048]4)溶氧控制:
[0049]O~30h:溶氧浓度不得低于60% ；
[0050]31~120h:溶氧浓度控制在30~50% ；
[0051]12 Ih~放罐:溶氧浓度控制在40%以上；
[0052]5)搅拌转速:
[0053]O ~30h:揽祥转速 80 ~90r/min ；
[0054]31 ~120h:搅拌转速 100 ~110r/min ；
[0055]12 Ih~放罐:搅拌转速70~80r/min ；
[0056]6)培养温度:
[0057]O ~30h:34 ~35.(TC ；
[0058]31 ~IOOh:32 ~33°C ；
[0059]IOlh ~放罐:30 ~31?。
[0060]7)罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
[0061]在发酵过程中进行补料，包括补糖、补水、补入正丙醇和补油，其中
[0062]I)补糖控制:当pH > 7.3时，采用流加法，补入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，当pH达到6.9时，停止补料；
[0063]2)补水:
[0064]120h之前，当菌体浓度超过40%，采用流加法补入饮用水，控制其菌体浓度在35~40%,
[0065]120h至发酵结束:当菌体浓度超过35%，补入饮用水，控制其菌体浓度在30~35% ；
[0066]3)补入正丙醇:发酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分别加入已灭菌的正丙醇，其加入量为发酵液体积的0.1~0.2%;
[0067]4)补油:采用流加法补油，发酵至15h开始补豆油，具体控制如下:[0068]10 ~80h:15 ~20L/h ；
[0069]81 ~120h:30 ~35L/h ；
[0070]121h~放罐:不补油。
[0071]上述油可以是豆油、玉米油或菜籽油。
[0072]本发明的技术优势为:
[0073]I)发酵成本低。首先啤酒酵母干渣、蚯蚓粉由于产量较大，市场价格较低，便于采购，其次使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了常规种子培养基、发酵培养基中的氮源，减少了氮源的用量，降低了采购和生产成本，减少因原料质量影响种子液和发酵液质量的不利因素。
[0074]2)蛋白质和氨基酸含量较高，本发明培养基中的的总生物素含量高于常规培养基。根据相关文献报道，红霉素发酵过程中，蛋白质和氨基酸对其产量和组分影响较大，本发明培养基中的蛋白质含量达到55%以上，氨基酸含量明显高于常规种子培养基配方，有利于改善红霉素链霉菌菌丝形态；提高种子培养的质量。
[0075]不同原辅料的氨基氮含量对比表
[0076]
【权利要求】
1.一种红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
2.按照权利要求1所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为:甘鹿糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干洛20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙0.2~0.4g/L、硅油消泡剂0.01~0.03g/L。
3.按照权利要求1所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述二级种子培养基的组成为:甘鹿糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干洛25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸铵0.06~0.08g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、硅油消泡剂0.02~0.04g/L。
4.按照权利要求1所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述发酵培养基的组成为:甘鹿糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干洛30~35g/L、虫丘蚓粉15~20g/L、硫酸铵0.07~0.09g/L、氯化钠0.9~lg/L、轻质碳酸钙0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化钴0.006~0.008g/L 硫酸镁0.04~0.05g/L、硫酸锌0.03 ~0.05g/L、硫酸铜 0.06 ~0.08g/L、硅油消泡剂 0.02 ~0.03g/L。
5.按照权利要求1、2、3或4所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述啤酒酵母干渣的质量要求为: 蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≤ 5% ;灰分≤5% ;碳水化合物≥12% ;干渣颗粒通过60目筛的数量> 80%ο
6.按照权利要求1、2、3或4所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述蚯蚓粉的质量要求:蛋白质含量> 60% ;水分< 10% ;粒度能通过80目筛。
7.按照权利要求1、2、3或4所述的红霉素链霉菌发酵生产红霉素的培养基，其特征在于所述甘蔗糖蜜在使用前进行预处理，预处理过程为: O甘蔗糖蜜中加入饮用水，使其粘度控制在IOOcp以下； 2)加热升温至30~35°C， 3)超滤，超滤膜材料为醋酸纤维素或聚氧乙烯，超滤过程中，物料的流量控制在4~5L/min，超滤压力控制在0.2MPa 4)加入蔗糖转化酶，蔗糖转化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg)X0.35。
8.—种红霉素链霉菌利用权利要求2-4任意一项培养基发酵生产红霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为:首先将已经培养好的红霉素链霉菌母瓶发酵液按照0.8~IL/m3接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为20~25h时转移到二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35~40%、pH值7~8、培养周期为22~27h时转移至发酵培养基中培养，至发酵单位在11000u/ml以上且每6~8h检测的发酵单位相差300u/ml以内、菌体浓度35~40%、发酵周期为150~160h时终止发酵。
9.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前首先进行灭菌，其中 灭菌后的一级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、总糖.30 ~40g/100ml、pH6.5 ~7.5 ; 灭菌后的二级种子培养基的质量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、总糖.30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ; 灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 60ug/ml、总糖.40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
10.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为: 1)罐压:控制在0.04~0.06MPa, 2)罐温:发酵前5h，罐温控制在31~32°C；6h至一级种子培养结束，罐温控制在33~.34℃， .3)空气流量:0~5h，100~150m3/h；6h至一级种子培养结束:200~250m3/h， .4)pH:控制在7~8， 5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在 110r/min。
11.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养条件为: . 1)罐压:控制在0.04~0.06MPa, .2)罐温:发酵前5h，罐温控制在31~32°C；6h至二级种子培养结束，罐温控制在33~34℃， .3)空气流量:0~5h，300~350m3/h；6 h至二级种子培养结束:350~400m3/h， . 4)pH:控制在7~8，. 5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在 100r/min。
12.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为: .1)pH控制:控制在6~8 ; . 2)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌； .3)空气流量:0~15h: 1000mVh ；16h~发酵结束:800m3/h ； .4)溶氧控制: . O~30h:溶氧浓度不得低于60% ； . 31~120h:溶氧浓度控制在30~50% ； . 12 Ih~放罐:溶氧浓度控制在40%以上； 搅拌转速: O~30h:搅拌转速80~90r/min ； 31 ~120h:搅拌转速 100 ~110r/min ； 121h~放罐:搅拌转速70~80r/min ； 6)培养温度:
O ~30h:34 ~35.0°C ；
31 ~IOOh:32 ~33°C ； IOlh~放罐:30~31°C ； 7)罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
13.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补糖、补水、补入正丙醇和补油，其中 1)补糖控制:当pH> 7.3时，采用流加法，补入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，当pH达到6.9时，停止补料； 2)补水: 120h之前，当菌体浓度超过40%，采用流加法补入饮用水，控制其菌体浓度在35~40% ； ，120h至发酵结束:当菌体浓度超过35%，补入饮用水，控制其菌体浓度在30~35% ； 3)补入正丙醇:发酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分别加入已灭菌的正丙醇，其加入量为发酵液体积的0.1~0.2%; 4)补油:采用流加法补油，发酵至15h开始补豆油，具体控制如下:
，15 ~80h:15 ~20L/h ；
，81 ~120h:30 ~35L/h ；
，121h~放罐:不补油。
【文档编号】C12R1/465GK103484515SQ201310441432
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】任勇, 奇乃, 王忠中 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司