一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因teta的sgrna、含有该sgrna的crispr/cas9基因敲除载体及其构建方法和应用。

背景技术：

近年来，随着抗生素在畜禽养殖和临床治疗中的大量使用，环境中抗生素抗性细菌以及抗生素抗性基因的丰度正在不断增加。抗生素抗性基因会使细菌产生抗生素耐药性，目前已被当做一种新型的环境污染物。四环素类抗生素是由放线菌产生的或半合成的一类广谱抗生素，由于价格低廉，不仅被作为药物用于治疗人类或动物的细菌感染，同时也被作为常用的饲料添加剂，用于提高饲料利用率，促进养殖动物的生长。四环素的滥用导致了四环素抗性基因在细菌间广泛传播，这使得四环素的治疗效果不断被削弱，对人和动物有着潜在的健康风险。teta基因是四环素抗性基因中的重要一种，目前在土壤，地表水，大气，污水处理厂、沉积物等环境中都被广泛检出。

目前，抗生素抗性基因的削减主要是通过微生物群落结构的改变，例如，通过过滤的方式减少微生物的生物量。但这些方式都没有从根本上破坏抗性基因，系统中残余的抗性基因仍能通过整合、转座以及接合转移等途径进行迁移转化。crispr/cas9系统是近年来新兴的基因编辑技术，cas9蛋白能在特定guide-rna的引导下靶向切割特定序列。一些研究者利用crispr/cas9系统对大肠杆菌等多种微生物的功能基因进行了敲除，但目前利用该系统对四环素抗性基因敲除的研究还较为缺乏。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供特异性靶向四环素抗性基因teta的sgrna、含有该sgrna的crispr/cas9基因敲除载体及其构建方法。

第一方面，本发明所涉及的sgrna序列靶向teta基因的第251位至第270位序列，cas9蛋白在该sgrna的引导下对该位点有良好的切割效果，该sgrna的特异性核苷酸序列如sgrna-1(为seqidno.1)所示。

sgrna-1：5’-catgatggcgtagtcgacag-3’。

第二方面，本发明提供了包含上述特异性靶向teta基因第251至第270位核苷酸序列的sgrna的crispr/cas9基因敲除载体，优选的，crispr/cas9基因敲除载体图谱如附图3所示。

上述crispr/cas9基因敲除载体为单质粒系统，即运用同一个质粒载体表达基因敲除所需要的cas9蛋白和sgrna。

第三方面，本发明提供上述crispr/cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将cas9蛋白基因，上述sgrna基因，接合转移位点，复制子，筛选标记基因通过无缝克隆的方法得到上述的crispr/cas9基因敲除载体。

上述crispr/cas9基因敲除载体的构建包含以下步骤：

(1)合成含有上述sgrna序列的表达元件sgrna(teta)，该表达元件包含原核生物j23119(spei)启动子、上述sgrna序列、grnascaffold序列和终止子序列，其序列如seqidno.2所示(序列如下)：ctgcagcacgtacagcactgatgcatcgctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatgctggatccttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtcatgatggcgtagtcgacaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagagtcgacctgcagaagcttagatctattaccctgttatccctgcag

(2)将步骤(1)合成的sgrna(teta)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgrna(teta)，其图谱如图1所示。

(3)以pk18mobsacb质粒为模板，利用引物对1pcr扩增rp4-orit序列，其中rp4-orit序列中包含接合转移位点，将扩增产物凝胶纯化。

(4)以步骤(2)中puc57-sgrna(teta)为模板，利用引物对2pcr扩增oriv-sgrna(teta)序列，将扩增产物凝胶纯化。

(5)步骤(3)、(4)所涉及的引物对1、2含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(3)、(4)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-orit-sgrna(teta)质粒，其图谱如图2所示。

(6)以pcas质粒为模板，利用引物对3pcr扩增cas9-kan序列，将扩增产物凝胶纯化。

(7)以步骤(5)所得的puc57-orit-sgrna(teta)为模板，利用引物对4pcr扩增oriv-orit-sgrna(teta)序列，将扩增产物凝胶纯化。

(8)步骤(6)、(7)所涉及的引物对3、4含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(6)、(7)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-orit-cas9-sgrna(teta)质粒，其图谱如图3所示，该质粒即为靶向teta基因第251位至第270位序列的crispr/cas9基因敲除载体。

引物对1：

orit-s:ctggaggatcatccagccctg

orit-f:gccgagcttcctgctgaacatc

引物对2

puc19-f:gatgttcagcaggaagctcggccttccgcttcctcgctcactg

puc19-s:atcagggctggatgatcctccagtcattaatgcagctggcacgac

引物对3：

fragment-f:atctcagcgatccaggtcattcagactggctaatgc

fragment-s:gatgatcctccaggatgtagccgtcaagttgtcat

引物对4：

vector-f:gacggctacatcctggaggatcatccacgtacagcactgatgcatcg

vector-s:tctgaatgacctggatcgctgagataggtgcctc

同样地，本发明利用pcr扩增，无缝克隆的方法获得puc57-orit-cas9-△sgrna质粒，其图谱如图4所示，该质粒与puc57-orit-cas9-sgrna(teta)相比缺少含有上述sgrna的sgrna(teta)序列，无法行使基因敲除的功能，而puc57-orit-cas9-sgrna(teta)可以行使敲除功能。

上述所涉及的pcr反应采用50ul体系，反应体系如下：primestarmaxpremix25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddh2o22ul。

上述所涉及的pcr反应程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30。

上述所涉及的无缝克隆反应体系如下：novorecplus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段0.05pmol，短片段为0.025pmol，用ddh2o将反应体系补充至20ul，50℃反应15分钟。

第四方面，本发明提供一种微生物，该微生物含有上述的puc57-orit-cas9-sgrna(teta)质粒。其中，所述微生物为大肠杆菌，该微生物由感受态大肠杆菌转化入puc57-orit-cas9-sgrna(teta)质粒得到。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明通过对四环素类抗性基因teta的序列分析，筛选出靶向切割teta基因的上述sgrna序列。经实验验证，本发明提供的crispr/cas9敲除载体能够高效靶向切割teta基因第251位至第270位序列。

(2)本发明提供的crispr/cas9敲除载体能够通过转化或接合转移的方式进入受体细胞，对受体细胞中的目的序列进行靶向切割(高效靶向切割teta基因第251位至第270位序列)。

(3)本发明提供的crispr/cas9敲除载体及其构建方法具有很强的实用性，为teta基因及其他抗性基因的敲除及其研究提供了有效方法和基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中puc57-sgrna(teta)质粒的图谱。图中标出了复制子(ori)，氨苄抗性基因(amp)，sgrna-1的表达元件sgrna(teta)。

图2为本发明实施例2中puc57-orit-sgrna(teta)质粒的图谱。该质粒在puc57-sgrna(teta)质粒的基础上增加了接合转移位点(orit)。

图3为本发明实施例2中puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体的质粒图谱。图中标出了复制子(ori)，卡那抗性基因(kan)，sgrna-1的表达元件sgrna(teta),cas9蛋白基因(cas9)以及接合转移位点(orit)。

图4为本发明实施例2中puc57-orit-cas9-△sgrna对照载体的质粒图谱。该质粒与puc57-orit-cas9-sgrna(teta)质粒相比缺少了sgrna-1的表达元件sgrna(teta)。

图5为本发明实施例3中接合转移实验的结果。实验组和对照组的细菌菌落数有显著差异(p<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1特异性靶向teta基因的sgrna序列的获得

(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov网址中下载四环素抗性基因teta(genbank:ng_048148.1)的基因序列。

(2)将(1)得到的序列导入https://zlab.bio/guide-design-resources中获得符合条件的sgrna，从中筛选出效率和特异性得分都较高的sgrna-1，sgrna-1序列如下：

sgrna-1：5’-catgatggcgtagtcgacag-3’。

实施例2构建含有sgrna-1的crispr/cas9基因敲除载体

含有sgrna-1的crispr/cas9基因敲除载体构建的构建方法包括如下步骤：

(1)利用软件snapgene设计含有sgrna-1的表达元件序列sgrna(teta)，并在杭州擎科梓熙生物技术公司合成该序列，表达元件包含原核生物j23119(spei)启动子、上述sgrna-1、grnascaffold序列和终止子序列，其序列如序列1所示。

(2)将步骤(1)合成的sgrna(teta)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgrna(teta)，并将该载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，质粒载体图谱如图1所示。

(3)以pk18mobsacb质粒为模板，利用引物对1pcr扩增rp4-orit序列，其中rp4-orit序列中包含接合转移位点，将扩增产物用tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。

(4)将步骤(2)所得大肠杆菌阳性克隆扩增，用tiangen质粒小提试剂盒提取5ml菌液中步骤(2)涉及的puc57-sgrna(teta)质粒，以该质粒为模板，利用引物对2pcr扩增oriv-sgrna(teta)序列，将扩增用tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。

(5)步骤(3)、(4)所涉及的引物对1、2含有同源片段，利用novorecplus无缝克隆试剂盒将步骤(3)、(4)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-orit-sgrna(teta)质粒，并将该载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，质粒载体图谱如图2所示。

(6)以pcas质粒为模板，利用引物对3pcr扩增cas9-kan序列，将扩增产物用tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。

(7)将步骤(5)所得大肠杆菌阳性克隆扩增，用tiangen质粒小提试剂盒提取5ml菌液中步骤(5)涉及的puc57-orit-sgrna(teta)质粒，以该质粒为模板，利用引物对4pcr扩增oriv-orit-sgrna(teta)序列，将扩增产物用tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。

(8)步骤(6)、(7)所涉及的引物对3、4含有同源片段，利用novorecplus无缝克隆试剂盒将步骤(6)、(7)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-orit-cas9-sgrna(teta)质粒，其载体图谱如图3所示，该质粒即为靶向teta基因第251位至第270位序列的crispr/cas9基因敲除载体。

类似地，本发明利用pcr扩增，无缝克隆的方法获得puc57-orit-cas9-△sgrna对照质粒，质粒载体图谱如图4所示，该质粒与puc57-orit-cas9-sgrna(teta)相比缺少含有sgrna-1的sgrna(teta)序列，无法行使基因敲除的功能，而puc57-orit-cas9-sgrna(teta)可以行使敲除功能。

实施例2中涉及的pcr反应采用takara公司的primestarmax高保真聚合酶，反应体系如下：primestarmaxpremix25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddh2o22ul。pcr反应程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30。

实施例2中涉及的无缝克隆采用novorecplusonesteppcrcloning试剂盒，反应体系如下：novorecplus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段0.05pmol，短片段为0.025pmol，用ddh2o将反应体系补充至20ul，50℃反应15分钟

实施例2中涉及的转化步骤如下：取100ul感受态细胞置于冰上解冻，加入无缝克隆连接产物，在冰上放置30分钟；将感受态细胞42℃水浴60秒，快速转移到冰浴中，冷却3分钟；向感受态细胞中加入500ullb液体培养基，混匀后置于37℃200rpm摇床中复苏60分钟；吸取复苏后的感受态细胞100ul涂布于相应抗性的培养基，置于恒温培养箱中培养16小时。

实施例3实施例2构建的crispr/cas9敲除载体的敲除效果验证

对于大肠杆菌而言，在puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体的作用下，若发生质粒dna的断裂，质粒会逐渐丢失，失去四环素抗性，若发生染色体dna的断裂，细菌将难以存活。

1、利用接合转移验证该质粒载体对含有teta基因大肠杆菌的削减作用

(1)细菌培养

将含有rp4质粒的大肠杆菌划线活化后接种于四环素抗性的lb液体培养基中，置于恒温震荡培养箱中37℃震荡培养16小时，速度为200rmp。其中rp4质粒是incpα系列，能够在多种细菌间接合转移的泛宿主型质粒，其大小为60099bp，该质粒携带多种抗生素抗性基因，其中就包含四环素抗性基因teta。

将含有puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体和含有puc57-orit-cas9-△sgrna对照载体的大肠杆菌划线活化后分别接种于卡那抗性的lb液体培养基中，置于恒温震荡培养箱中37℃震荡培养16小时，速度为200rmp。

(2)洗菌

将步骤(1)扩大培养后的摇菌管以转速5000rmp离心5分钟。离心后倒弃上清液，向摇菌管中加入适量pbs缓冲液使沉积的菌液重悬并再次离心，再次弃去上清液，共重复3次。最后，再次用pbs缓冲液将菌液od600值均调节至0.7(±0.03)。

(3)细菌接合

实验组：在10ml离心管中加入2.5mlpbs重悬的含有rp4质粒的大肠杆菌与2.5mlpbs重悬的含有puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体的大肠杆菌。

对照组：在10ml离心管中加入2.5mlpbs重悬的含有rp4质粒的大肠杆菌与2.5mlpbs重悬的含有puc57-orit-cas9-△sgrna对照载体的大肠杆菌。

将实验组和对照组的离心管37℃震荡培养1h后放入37℃恒温培养箱静置培养12h。

(4)平板计数

取步骤(3)中实验组和对照组的菌液分别稀释到适宜浓度，各取100ul菌液涂布于四环素抗性的lb固体培养基上，平行重复3次。平板置于37℃恒温培养箱中培养15h，对菌落进行计数，并计算单位体积实验组和对照组菌液中四环素抗性菌的菌落数(cfu/ml)。

(5)作图结果

根据步骤(4)的平板计数结果，本实验利用r语言绘制了实验组和对照组中四环素抗性菌菌落数的箱线图，如图5所示，其中纵坐标代表单位体积取对数后的菌落数(lg(cfu)/ml)。结果显示与对照组相比，实验组当中携带四环素抗性的菌落数显著减少(p<0.01)，这说明puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体能够有效去除rp4质粒上的teta基因。

2、该质粒载体对大肠杆菌s17-1菌株中teta基因同源片段的敲除

大肠杆菌s17-1菌株的染色体上整合了rp4-2质粒，其中就包括teta基因的同源片段，因此，本实验将puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体转化入s17-1菌株中，若该敲除载体能靶向切割teta基因第251位至第270位序列，那么含有该质粒的转化子将无法生长，具体验证方法如下：

(1)转化

取100ul大肠杆菌s17-1感受态细胞置于冰上解冻至冰水混合物状态，将该100ul感受态平均分为2份，每份50ul，分别置于2个离心管中。

实验组：在50ul感受态细胞中加入100ngpuc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体，在冰上放置30分钟。

对照组：在50ul感受态细胞中加入100ngpuc57-orit-cas9-△sgrna对照载体，在冰上放置30分钟。

将对照组和实验组42℃水浴60秒，速转移到冰浴中，冷却3分钟。分别向对照组与实验组感受态细胞中加入500ullb液体培养基，混匀后置于37℃200rpm摇床中复苏60分钟，稀释到合适浓度后，吸取稀释后的感受态细胞100ul涂布于相应抗性的培养基上，平行重复3次，将培养基置于恒温培养箱中培养16小时。

(2)平板计数与结果

经过抗性平板的培养，对照组转化子的平均菌落数为62000cfu/ml，而实验组转化子的平均菌落数为0cfu/ml，转化实验表明puc57-orit-cas9-sgrna(teta)敲除载体能有效靶向切割teta基因的第251位至第270位序列。

综上所述，本发明提供的特异性靶向teta基因的sgrna序列以及含有该sgrna的crispr/cas9敲除载体能够高效靶向切割teta基因第251位至第270位序列，实现抗性基因teta基因的敲除。同时，用本发明提供的crispr/cas9敲除载体制备方法较易得到靶向相应抗生素抗性基因的crispr/cas9敲除载体，为teta及其他抗性基因的敲除及其研究提供了有效方法和基础。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种靶向四环素抗性基因teta的sgrna及其敲除载体、载体构建方法和应用

<130>20-212069-00016124

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catgatggcgtagtcgacag20

<210>2

<211>284

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctgcagcacgtacagcactgatgcatcgctgatgcggtattttctccttacgcatctgtg60

cggtatttcacaccgcatatgctggatccttgacagctagctcagtcctaggtataatac120

tagtcatgatggcgtagtcgacaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggct180

agtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagag240

tcgacctgcagaagcttagatctattaccctgttatccctgcag284

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctggaggatcatccagccctg21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gccgagcttcctgctgaacatc22

<210>5

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gatgttcagcaggaagctcggccttccgcttcctcgctcactg43

<210>6

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atcagggctggatgatcctccagtcattaatgcagctggcacgac45

<210>7

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atctcagcgatccaggtcattcagactggctaatgc36

<210>8

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gatgatcctccaggatgtagccgtcaagttgtcat35

<210>9

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gacggctacatcctggaggatcatccacgtacagcactgatgcatcg47

<210>10

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tctgaatgacctggatcgctgagataggtgcctc34