用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状RNA支架及其构建方法与应用与流程

本发明涉及一种用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架及其构建方法与应用。属于生物化工领域。

背景技术：

传统化工和制药行业存在高能耗、高物耗、高污染和高排放等缺陷，对资源和环境带来严重挑战。生物催化具有节能、降耗、低污染、低排放等环境友好特点，可替代传统化工、制药工艺，实现产业转型升级，促进绿色发展。生物催化中，与酶催化相比细胞催化具有无需进行细胞破碎、酶的分离纯化、酶在细胞内具有更加稳定、回收方便、成本低、工艺简单等诸多优势。细胞催化是将催化酶基因(或多酶基因)在细胞重组细胞内表达，利用重组细胞进行生物催化合成高附加值产品的技术。

对于细胞催化，重组细胞性能对催化结果有重要影响。首先，重组细胞内构建的人工合成途径与细胞天然途径之间存在相互干扰；其次，对于涉及多个酶的人工合成途径，重组酶分子在细胞内随机分布，则各种代谢中间物需要在不同酶分子之间不断互相扩散才能完成整个催化过程，不仅导致代谢物的串扰还导致时间延迟和酶分子周围底物浓度降低和酶反应速率降低。

在天然状态下，酶分子在细胞空间内是有序分布的，从而使细胞内各种复杂的生化反应顺利进行，互不干扰。

合成生物学技术为工程菌株的改造和完善提供了有利的工具。利用合成生物学技术在细胞内构建人工支架，将重组酶定位于人工支架上形成人工代谢硫通路，则可以解决重组细胞存在的上述问题：减少或克服串扰问题；缩短细胞内扩散距离减少扩散时间延迟；提高酶分子周围局部底物浓度，加快反应速度。

目前细胞内分子支架分蛋白支架和核酸支架，后者又分dna支架和rna支架。从细胞合成经济性上考虑，蛋白合成首先需要dna和rna的合成，因此蛋白支架经济性较低；核酸支架在能量和材料消耗上更具有优势。虽然dna支架相对于rna支架不易被降解，但由于非编码rna具有单链结构，经过精心设计后可以部分相互配对，互相连接，组成结构复杂的线性、平面甚至立体结构，因而具有更大的灵活性。但是目前rna支架主要是线性结构，rna支架的稳定性不高，rna支架锚定的重组蛋白分子的数量较少，为了增加rna支架结构密度和锚定蛋白分子的密度以提高反应速率，构建三角形平面网状rna支架，以提高重组细胞的催化性能成为必然。经检索，目前有关构建三角形平面网状rna支架的专利还未见报道

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架及其构建方法与应用。

本发明所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架，由二维的三角形网状rna支架与可选择施加的适配体序列组成；其特征在于：所述二维的三角形网状rna支架是以单链rna为元件，并以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成回文序列在细胞内形成三角形支架单元(见图1)，该三角形支架单元中的每条seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列又分别与相邻的三角形支架单元中与之完全相同的单链rna的核苷酸序列根据碱基配对形成rna双链，并以此方式不断配对形成rna双链，在细胞内构成了空间上呈二维的三角形网状rna支架(见图2)；所述可选择施加的适配体序列是指能特异性识别病毒外壳蛋白的序列。

其中：所述适配体序列选择seqidno.4所示的pp7的适配体序列，seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列，seqidno.6所示的revn7d的适配体序列，或seqidno.7所示的revr11的适配体序列。

上述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架优选的实施方式是：所述用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架是由以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成的回文序列为基础构成的二维的三角形网状rna支架与seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列组成，该用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架的总核苷酸序列如seqidno.8所示。

本发明所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架的构建方法是：

合成一段如seqidno.8所示的dna序列，利用引物1和2将质粒pet22b线性化，根据同源重组构建重组质粒pet22b-scaffold；将同源重组液转化到dh5α感受态细胞中，通过菌落pcr验证获得阳性转化子，再提取重组质粒pet22b-scaffold，通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建；其中，所述引物1和2如下：

引物1：5’>ccctatagtgagtcgtattaacctaatgcaggtcccggaaga<3’，下划线序列为与pet22b质粒重叠序列；

引物2：5’>ccaatggcgcgccgagcttggcgtaatgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’，下划线序列为与pet22b质粒重叠序列。

本发明所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架在细胞内重组蛋白固定中的应用。

上述的应用中，优选的实施方式是：所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架在细胞内固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶中的应用，方法是：

(1)三角形网状rna支架中选择的适配体序列是seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列；

(2)构建三角形网状rna支架所锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒；方法是：从genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段，利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化确定seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列，将biv-tat标记fdh，将pp7标记rdh，利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因，同时利用引物3和4将pacycduet1质粒进行线性化，并将线性化的pacycduet1质粒与合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组，通过菌落pcr验证获得将目标基因亚克隆到质粒pacycduet1中的重组菌株，对获得阳性转化子提取质粒，所获得的重组质粒命名为pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；将此构建的重组质粒转化到大肠杆菌blstar细胞中，并通过iptg诱导两种酶融合体的表达，确认重组质粒的正确性；其中，所述涉及的引物序列如下：

引物3：5’>ttaacctaggctgctgccac<3’，下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列；

引物4：5’>tcctgatcctttttcgaactgc<3’，下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列；

引物5：5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattacacggcttttttgaattttg<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。

引物6：5’>agccacccgcagttcgaaaaaggatcaggaatgtccaaaaccatcgttctttcggt<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列；

(3)构建利用三角形网状rna支架固定重组酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌；方法是：将重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pet22b-scaffold共同转化到大肠杆菌blstar中构建工程菌株，并进行鉴定验证即获得利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌。

利用获得利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌进行阿洛醇的生产，实验显示本发明的工程菌已将核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶锚定在rna支架上(图3)，与游离形式过表达两种靶酶相比,本发明的工程菌阿洛醇的产量从3.036g/l提高到4.433g/l。

本发明针对细胞内人工多酶催化途径中重组酶分子随机分布导致人工途径中间代谢物与天然途径中间代谢物之间串扰、人工途径各中间代谢物需要在各重组酶分子之间扩散以便顺序发生反应而导致的时间延迟和重组酶分子周围底物浓度降低等缺陷，为提高所涉及重组酶的催化效率，提出了一种用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架及其构建方法与应用。其中所述二维的网状三角形rna支架使人工途径重组蛋白被锚定在相邻位置，极大限制了代谢物之间的串扰和相互扩散；二维的网状三角形rna支架结构大幅增加了支架的稳定性和被锚定蛋白的密度，使用所述rna支架锚定重组酶蛋白的重组菌进行生物催化反应时可以增加重组菌的稳定性、最大化地增加反应产物的产量。

本发明公开的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架中，所述二维的三角形网状rna支架是以单链rna为元件，并以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成回文序列在细胞内形成三角形支架单元(见图1)，该三角形支架单元中的每条seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列又分别与相邻的三角形支架单元中与之完全相同的单链rna的核苷酸序列根据碱基配对形成rna双链，并以此方式不断配对形成rna双链，在细胞内构成了空间上呈二维的三角形网状rna支架(见图2)；相比现有公开的rna支架，三角形网状支架的设计将游离的rna支架组装成更加稳定的三角形，且在空间上形成二维的网状结构，为更多的重组酶提供锚定位置。且本发明能通过更换不同的适配体类型和数量，可以实现与各种不同的酶蛋白进行锚定，实现酶促反应更加高效地进行。

本发明公开的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架与其它游离形式过表达两种靶酶相比,本发明方法构建的工程菌阿洛醇的产量能从3.036g/l提高到4.433g/l，若运用到工业生产中，将以节约成本，提高酶促反应效率的优势，最大化地提高产物的产量，经济价值和应用前景广阔。

附图说明

图1rna构建模块的最小结构。

图2rna支架的作用结构。

图3rna支架作用原理示意图。

图4重组质粒pet22b-scaffold图谱。

图5重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh菌落pcr验证图

其中：m:250bp-ⅱmaker,1:菌落pcr验证成功条带，2-3：菌落pcr验证失败条带。

图6菌株ⅰ和菌株ⅱ发酵生产阿洛醇的产量比较图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂、质粒、专用试剂盒、大肠杆菌菌株等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1rna支架重组质粒的构建

1)委托公司合成一段dna序列如seqidno.8所示；

2)利用引物1，引物2将pet22b质粒进行线性化；

引物1：5’>ccctatagtgagtcgtattaacctaatgcaggtcccggaaga<3’，下划线序列为与pet22b质粒重叠序列。

引物2：5’>ccaatggcgcgccgagcttggcgtaatgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’，下划线序列为与pet22b质粒重叠序列。

反应体系：

反应条件：

pcr扩增反应条件

30cycle。

3)为纯化线性化的pet22b质粒进行切胶回收：

a)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带,注意刀片需消毒,胶块应尽量小,使之易融化完全；

b)事先将一个eppendorf管称重,然后将胶块放入后再次称重,获得胶块的重量；

c)以每100mg胶块加入300μl的量加入bindingbuffer,查看胶块是否浸在液体中；56℃水浴10min以融化胶块释放dna,期间每2-3min需取出震荡；

d)将highpurefiltertub安装到collectiontube上；

e)将所有eppendorf管中的液体转移到highpurefiltertube中去；

f)12000rpm离心1min倒掉收集管中的液体；

g)加入500μlwashbuffer后再次离心1min；

h)倒掉收集管中的液体后再次加500μl的washbuffer,12000rpm离心1min；

i)小心将filtertube取下后装入一个新的effendorf管上；

j)在滤芯的正中加上30ul的elutionbuffer,室温放置1min,12000rpm离心1min.

最后，通过切胶回收，获得纯化的线性化pet22b质粒。

4)重组质粒pet22b-scaffold的制备

测定浓度，根据浓度比与合成的rna支架序列进行混合，利用组装形成环状质粒，进行大肠杆菌dh5α的转化。

重组体系：

反应条件：

37℃30min。

将10μl同源重组液加入到dh5α感受态细胞中，冰浴30min，热激(42℃，60s)，再冰浴2min，加入500μl新鲜无抗lb液体培养基，37℃，180rpm，培养1h。取出200μl涂布于氨苄青霉素平板，37℃，过夜培养。

通过菌落pcr验证分别获得阳性转化子，提取重组质粒pet22b-scaffold(图4)。

菌落pcr反应体系：

5)利用omga质粒试剂盒提取重组质粒pet22b-scaffold

提取步骤如下：

a)用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。

b)加入250μlsolutionⅰ/rnasea混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。

c)加入250μlsolutionⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

d)加入350μlsolutionⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

e)12,000rpm室温离心10min，收集上清。

f)将上清置于dna纯化柱中，静置1-2min。

g)12,000rpm离心1min，弃滤液。

h)加入500μl溶液washbuffer，12,000rpm离心1min，弃滤液。

i)将dna纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液ddh2o，室温放置2min。

按照上述的方法，质粒可以得到浓度为200ng/ul的重组质粒pet22b-scaffold。

实施例2rna支架所锚定蛋白的重组质粒的构建

从genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段，利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，确定seqidno.4所示的pp7的适配体序列(适配体1)和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列(适配体2)，将biv-tat标记fdh，将pp7标记rdh，公司合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因，将目标基因亚克隆到pacycduet1中，命名为pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh。将此构建体转化到大肠杆菌blstar细胞中，并通过iptg诱导两种酶融合体的表达。

1)利用引物3，引物4将pacycduet1质粒进行线性化；

引物3：5’>ttaacctaggctgctgccac<3’，下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。

引物4：5’>tcctgatcctttttcgaactgc<3’，下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。

引物3和4用于pacycduet1质粒进行线性化。

反应体系：

反应条件：

pcr扩增反应条件

30cycle。

2)为纯化线性化的pacycduet1质粒进行切胶回收

a)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小,使之易融化完全；

b)事先将一个eppendorf管称重,然后将胶块放入后再次称重,获得胶块的重量；

c)以每100mg胶块加入300μl的量加入bindingbuffer,查看胶块是否浸在液体中；

d)56℃水浴10min以融化胶块释放dna,期间每2-3min需取出震荡；

e)将highpurefiltertub安装到collectiontube上；

f)将所有eppendorf管中的液体转移到highpurefiltertube中；

g)12000rpm离心1min倒掉收集管中的液体；

h)加入500ulwashbuffer后再次离心1min；

i)倒掉收集管中的液体后再次加500μl的washbuffer，12000rpm离心1min；

j)小心将filtertube取下后装入一个新的effendorf管上；

k)在滤芯的正中加上30μl的elutionbuffer,室温放置1min,12000rpm离心1min。

最后，通过切胶回收，获得纯化的线性化pet22b质粒。

3)pp7-rdh/biv-tat-fdh基因的获得

引物5：5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattacacggcttttttgaattttg<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。

引物6：

5’>agccacccgcagttcgaaaaaggatcaggaatgtccaaaaccatcgttctttcggt<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列，引物5和6为了获得pp7-rdh/biv-tat-fdh基因。

步骤同2)，最后，通过切胶回收，获得纯化的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因。

4)重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh的制备

将线性化的pacycduet1质粒，与扩增到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组，获得重组菌株。通过菌落pcr验证及提取质粒酶切验证分别获得阳性转化子(图5)，提取重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh。

重组体系：

反应条件：

37℃，30min。

转化步骤：

将10μl同源重组液加入到dh5α感受态细胞中，冰浴30min，热激(42℃，60s)，再冰浴2min，加入500μl新鲜无抗lb液体培养基，37℃，180rpm，培养1h。取出200μl涂布于氯霉素平板，37℃，过夜培养。

将平板上长出来的菌落进行菌落pcr。

菌落pcr反应体系：

通过菌落pcr验证获得阳性转化子,提取重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh。

5)利用omga质粒试剂盒提取重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh提取重组质粒：

a)用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。

b)加入250μlsolutionⅰ/rnasea混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。

c)加入250μlsolutionⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

d)加入350μlsolutionⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

e)12,000rpm室温离心10min，收集上清。

f)将上清置于dna纯化柱中，静置1-2min。

g)12,000rpm离心1min，弃滤液。

h)加入500μl溶液washbuffer，12,000rpm离心1min，弃滤液。

i)将dna纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液ddh2o，室温放置2min。

按照上述的方法，可以得到浓度为200ng/ul的重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh。

实施例3大肠菌株工程菌株的构建

将重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pet22b-scaffold共同转化到大肠杆菌blstar中，构建工程菌株ⅰ，并进行鉴定验证。

将2μl质粒pet22b-scaffold和2μl重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh加入到100μldh5α感受态细胞中，冰浴30min，热激(42℃，60s)，再冰浴2min，加入500μl新鲜无抗lb液体培养基，37℃，180rpm，培养1h。取出200μl涂布于氯霉素和氨苄青霉素平板，37℃，过夜培养。

将共转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素双抗性的平板上，转化成功的工程菌株可以在双抗性的平板上生长，继而筛选获得阳性菌株。

实施例4rna支架可以锚定重组蛋白的验证

将重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh转化到大肠杆菌blstar中，完成菌株ⅱ的构建，与实施例3的工程菌株ⅰ形成对照，比较菌株ⅰ和菌株ⅱ的阿洛醇产量以验证rna支架可以锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶并促进阿洛醇的生产。

将菌株ⅰ和菌株ⅱ于37℃摇瓶培养过夜后作为种子液，使用500ml的烧瓶进行培养，，该烧瓶中装有加入氯霉素和氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml的100ml培养基，接种量为1ml。最初以37℃和200rpm开始培养。培养3h后，加入iptg至终浓度为1mm，将条件改变为28℃，140rpm，并继续培养12h。

通过以12000×g离心5min收集重组大肠杆菌细胞，并使用双蒸馏水洗涤两次。将洗涤后的细胞重悬于含有缓冲液，d-阿洛酮糖和甲酸钠的反应溶液中，重悬细菌溶液的od600为40。将重悬细菌溶液在水浴中保持在50℃。

将生物转化液样品以12000×g离心10min以去除细胞。然后，将上清液煮沸10min并离心以除去沉淀物。将所得的上清液通过0.22μm的膜滤器过滤，并注入hplc的carbomixpb-np柱(7.8×300mm，10μm，sepaxtechnologies)中，在78℃的柱温下，使用双蒸馏水以0.5ml/min的流速洗脱d-阿洛酮糖和阿洛醇进行分析。

实验结果显示菌株ⅰ的全细胞转化中相比于菌株ⅱ的阿洛醇的产量高，说明核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶锚定在rna支架上,且与游离形式过表达两种靶酶相比,阿洛醇的产量从3.036g/l提高到4.433g/l(图6)。

序列表

<110>山东大学，青岛龙鼎生物技术有限公司

<120>用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架及其构建方法与应用

<141>2020-03-07

<160>8

<210>1

<211>12

<212>rna

<213>人工序列

<221>单链rna的核苷酸序列

<222>（1）…（12）

<400>1

uaaugcgcauua12

<210>2

<211>12

<212>rna

<213>人工序列

<221>单链rna的核苷酸序列

<222>（1）…（12）

<400>2

uagcucgagcua12

<210>3

<211>12

<212>rna

<213>人工序列

<221>单链rna的核苷酸序列

<222>（1）…（12）

<400>3

uccacuagugga12

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<221>pp7的核苷酸序列

<222>（1）…（28）

<400>4

ggcucguguagcucauuagcuccgagcc28

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<221>biv-tat的核苷酸序列

<222>（1）…（25）

<400>5

ggcacagaagauauggcuucgugcc25

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<221>revn7d的核苷酸序列

<222>（1）…（30）

<400>6

gacaaguugguccgcacaguugcgaggugu30

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<221>revr11的核苷酸序列

<222>（1）…（30）

<400>7

cgcuuauggucauugaguaucuccugccga30

<210>8

<211>221

<212>dna

<213>人工序列

<221>rna支架的总核苷酸序列

<222>（1）…（221）

<400>8

ttaatacgactcactatagggtaatgcgcattatagctcgagctatccactagtggaagg60

actcggctcgtgtagctcattagctccgagccgagtcctcgaatacgagctgggcacaga120

agatatggcttcgtgcccaggaagtgttcgcacttctctcgtattcgattgcgctagcat180

aaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg221