1.一种用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架,由二维的三角形网状rna支架与可选择施加的适配体序列组成;其特征在于:所述二维的三角形网状rna支架是以单链rna为元件,并以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成回文序列在细胞内形成三角形支架单元,该三角形支架单元中的每条seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列又分别与相邻的三角形支架单元中与之完全相同的单链rna的核苷酸序列根据碱基配对形成rna双链,并以此方式不断配对形成rna双链,在细胞内构成了空间上呈二维的三角形网状rna支架;所述可选择施加的适配体序列是指能特异性识别病毒外壳蛋白的序列。
2.根据权利要求1所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架,其特征在于:所述适配体序列选择seqidno.4所示的pp7的适配体序列,seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列,seqidno.6所示的revn7d的适配体序列,或seqidno.7所示的revr11的适配体序列。
3.根据权利要求1所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架,其特征在于:所述用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架是由以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成的回文序列为基础构成的二维的三角形网状rna支架与seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列组成,该用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架的总核苷酸序列如seqidno.8所示。
4.权利要求1所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架的构建方法,其特征在于:
合成一段如seqidno.8所示的dna序列,利用引物1和2将质粒pet22b线性化,根据同源重组构建重组质粒pet22b-scaffold;将同源重组液转化到dh5α感受态细胞中,通过菌落pcr验证获得阳性转化子,再提取重组质粒pet22b-scaffold,通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建;其中,所述引物1和2如下:
引物1:5’>ccctatagtgagtcgtattaacctaatgcaggtcccggaaga<3’,下划线序列为与pet22b质粒重叠序列;
引物2:5’>ccaatggcgcgccgagcttggcgtaatgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’,下划线序列为与pet22b质粒重叠序列。
5.权利要求1所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架在细胞内重组蛋白固定中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架在细胞内固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶中的应用方法是:
(1)三角形网状rna支架中选择的适配体序列是seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列;
(2)构建三角形网状rna支架中所锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒;方法是:从genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段,利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,确定seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列,将biv-tat标记fdh,将pp7标记rdh,利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因,同时利用引物3和4将pacycduet1质粒进行线性化,并将线性化的pacycduet1质粒与合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组,通过菌落pcr验证获得将目标基因亚克隆到质粒pacycduet1中的重组菌株,对获得阳性转化子提取质粒,所获得的重组质粒命名为pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh;将此构建的重组质粒转化到大肠杆菌blstar细胞中,并通过iptg诱导两种酶融合体的表达,确认重组质粒的正确性;其中,所述涉及的引物序列如下:
引物3:5’>ttaacctaggctgctgccac<3’,下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
引物4:5’>tcctgatcctttttcgaactgc<3’,下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
引物5:5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattacacggcttttttgaattttg<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。
引物6:5’>agccacccgcagttcgaaaaaggatcaggaatgtccaaaaccatcgttctttcggt<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
(3)构建利用三角形网状rna支架固定重组酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌;方法是:将重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pet22b-scaffold共同转化到大肠杆菌blstar中构建工程菌株,并进行鉴定验证即获得利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌。