检测副溶血弧菌K抗原基因分型的引物组和试剂盒的制作方法
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组和试剂盒。
背景技术：
副溶血弧菌又称肠炎弧菌，属于弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌，是一种常见的病原菌，主要的栖息地在海水中。如果食用了遭此菌污染的海鲜，会引发食物中毒，是人类主要疾病之一。而且，副溶血弧菌是具有多种血清型的食源性致病菌，主要根据副溶血弧菌的菌体脂多糖o抗原和荚膜多糖k抗原进行血清型分型，其中o抗原有13个型别，k抗原有70多种型别，其血清型以o：k的形式表示(如常见血清型o3：k6，o4：k8等)。
目前，针对副溶血弧菌的检测方法包括以下几个方面：1.血象观测：在发病初期，白细胞总数增高，多在(10～20)×109/l，分类中性粒细胞80％以上；无法直接判断是否感染。2、粪便镜检：可见白细胞或脓细胞，常伴有红细胞，易被误诊为菌痢。粪便培养可检出副溶血弧菌，绝大多数迅速转阴，仅少数持续阳性2～4天；无法直接检测副溶血弧菌的抗原基因分型。3、细菌培养：发病1～2天，粪便培养阳性率高，2天后阳性率减低；检测时间长，无法直接检测副溶血弧菌的抗原基因分型。4、血清凝集试验：患病初期血清凝集效价较高，此后大多很快转为阴性。如效价达到1∶80～1∶160，可诊断本病；无法直接检测副溶血弧菌的抗原基因分型。5.采用普通pcr检测，仅能快速确定感染，但无法直接检测副溶血弧菌的抗原基因分型。
由于副溶血弧菌的抗原基因分型数量较多，采用目前的检测方法进行检测，工作量较大，检测准确性差，无法快速、准确判断副溶血弧菌的抗原基因分型。因此，现有检测方法需要改进。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组和试剂盒，旨在解决现有技术中无法快速、准确判断副溶血弧菌的抗原基因分型的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组，所述引物组基于荧光探针熔解曲线法检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型，所述引物组包括：
用于检测k1抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.1和seqidno.2；
用于检测k3抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.3和seqidno.4；
用于检测k4抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.5和seqidno.6；
用于检测k5抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.7和seqidno.8；
用于检测k6抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.9和seqidno.10；
用于检测k7抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.11和seqidno.12；
用于检测k8抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.13和seqidno.14；
用于检测k9抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.15和seqidno.16；
用于检测k11抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.17和seqidno.18；
用于检测k12抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.19和seqidno.20；
用于检测k13抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.21和seqidno.22；
用于检测k15抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.23和seqidno.24；
用于检测k17抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.25和seqidno.26；
用于检测k18抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.27和seqidno.28；
用于检测k19抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.29和seqidno.30；
用于检测k20抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.31和seqidno.32；
用于检测k21抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.33和seqidno.34；
用于检测k22抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.35和seqidno.36；
用于检测k23抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.37和seqidno.38；
用于检测k24抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.39和seqidno.40；
用于检测k25抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.41和seqidno.42；
用于检测k28抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.43和seqidno.44；
用于检测k29抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.45和seqidno.46；
用于检测k30抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.47和seqidno.48；
用于检测k31抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.49和seqidno.50；
用于检测k32抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.51和seqidno.52；
用于检测k33抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.53和seqidno.54；
用于检测k34抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.55和seqidno.56；
用于检测k36抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.57和seqidno.58；
用于检测k37抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.59和seqidno.60；
用于检测k38抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.61和seqidno.62；
用于检测k39抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.63和seqidno.64；
用于检测k40抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.65和seqidno.66；
用于检测k41抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.67和seqidno.68；
用于检测k42抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.69和seqidno.70；
用于检测k43抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.71和seqidno.72；
用于检测k44抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.73和seqidno.74；
用于检测k45抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.75和seqidno.76；
用于检测k46抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.77和seqidno.78；
用于检测k48抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.79和seqidno.80；
用于检测k49抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.81和seqidno.82；
用于检测k51抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.83和seqidno.84；
用于检测k52抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.85和seqidno.86；
用于检测k53抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.87和seqidno.88；
用于检测k54抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.89和seqidno.90；
用于检测k55抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.91和seqidno.92；
用于检测k56抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.93和seqidno.94；
用于检测k59抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.95和seqidno.96；
用于检测k60抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.97和seqidno.98；
用于检测k63抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.99和seqidno.100；
用于检测k64抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.101和seqidno.102；
用于检测k65抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.103和seqidno.104；
用于检测k67抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.105和seqidno.106；
用于检测k68抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.107和seqidno.108；
用于检测k69抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.109和seqidno.110；
用于检测k70抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.111和seqidno.112；
用于检测k71抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.113和seqidno.114。
以及，一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
以及，一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的方法，提供所述检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对所述副溶血弧菌k抗原基因分型进行检测。
本发明提供的检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组，是基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术，根据418株副溶血弧菌的全基因组进行生物信息学方法分析以及公共数据库中18株副溶血弧菌特异基因序列分析，获取并筛选了副溶血弧菌57种k抗原的特异基因和具体的基因区域，针对所得到的副溶血弧菌57种k抗原的特异基因进行设计得到的，保证所述引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性。
本发明提供的试剂盒含有本发明所述的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对57种副溶血弧菌k抗原基因分型同时进行检测，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
本发明所述的检测副溶血弧菌k抗原基因分型的方法，利用所述检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对所述副溶血弧菌k抗原基因分型进行检测。由于试剂盒含有本发明所述的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对57种副溶血弧菌k抗原基因分型同时进行检测，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的第一管rox荧光通道的样品tm图。
图2是本发明实施例2提供的第一管cy5荧光通道的样品tm图。
图3是本发明实施例2提供的第一管fam荧光通道的样品tm图。
图4是本发明实施例2提供的第二管rox荧光通道的样品tm图。
图5是本发明实施例2提供的第二管cy5荧光通道的样品tm图。
图6是本发明实施例2提供的第二管fam荧光通道的样品tm图。
图7是本发明实施例2提供的第三管rox荧光通道的样品tm图。
图8是本发明实施例2提供的第三管cy5荧光通道的样品tm图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组，所述引物组基于荧光探针熔解曲线法检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型，所述引物组包括：
用于检测k1抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.1和seqidno.2；
用于检测k3抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.3和seqidno.4；
用于检测k4抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.5和seqidno.6；
用于检测k5抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.7和seqidno.8；
用于检测k6抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.9和seqidno.10；
用于检测k7抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.11和seqidno.12；
用于检测k8抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.13和seqidno.14；
用于检测k9抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.15和seqidno.16；
用于检测k11抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.17和seqidno.18；
用于检测k12抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.19和seqidno.20；
用于检测k13抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.21和seqidno.22；
用于检测k15抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.23和seqidno.24；
用于检测k17抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.25和seqidno.26；
用于检测k18抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.27和seqidno.28；
用于检测k19抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.29和seqidno.30；
用于检测k20抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.31和seqidno.32；
用于检测k21抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.33和seqidno.34；
用于检测k22抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.35和seqidno.36；
用于检测k23抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.37和seqidno.38；
用于检测k24抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.39和seqidno.40；
用于检测k25抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.41和seqidno.42；
用于检测k28抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.43和seqidno.44；
用于检测k29抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.45和seqidno.46；
用于检测k30抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.47和seqidno.48；
用于检测k31抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.49和seqidno.50；
用于检测k32抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.51和seqidno.52；
用于检测k33抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.53和seqidno.54；
用于检测k34抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.55和seqidno.56；
用于检测k36抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.57和seqidno.58；
用于检测k37抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.59和seqidno.60；
用于检测k38抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.61和seqidno.62；
用于检测k39抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.63和seqidno.64；
用于检测k40抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.65和seqidno.66；
用于检测k41抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.67和seqidno.68；
用于检测k42抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.69和seqidno.70；
用于检测k43抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.71和seqidno.72；
用于检测k44抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.73和seqidno.74；
用于检测k45抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.75和seqidno.76；
用于检测k46抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.77和seqidno.78；
用于检测k48抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.79和seqidno.80；
用于检测k49抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.81和seqidno.82；
用于检测k51抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.83和seqidno.84；
用于检测k52抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.85和seqidno.86；
用于检测k53抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.87和seqidno.88；
用于检测k54抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.89和seqidno.90；
用于检测k55抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.91和seqidno.92；
用于检测k56抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.93和seqidno.94；
用于检测k59抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.95和seqidno.96；
用于检测k60抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.97和seqidno.98；
用于检测k63抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.99和seqidno.100；
用于检测k64抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.101和seqidno.102；
用于检测k65抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.103和seqidno.104；
用于检测k67抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.105和seqidno.106；
用于检测k68抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.107和seqidno.108；
用于检测k69抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.109和seqidno.110；
用于检测k70抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.111和seqidno.112；
用于检测k71抗原基因分型的杂交连接引物seqidno.113和seqidno.114。
本发明提供的检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组，是基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术，根据418株副溶血弧菌的全基因组进行生物信息学方法分析以及公共数据库中18株副溶血弧菌特异基因序列分析，获取并筛选了副溶血弧菌57种k抗原的特异基因和具体的基因区域，针对所得到的副溶血弧菌57种k抗原的特异基因进行设计得到的，保证所述引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性。
具体的，根据418株副溶血弧菌的全基因组进行生物信息学方法分析以及公共数据库中18株副溶血弧菌特异基因序列分析，获取并筛选了副溶血弧菌57种k抗原的特异基因的具体名称如下表1所示，57种k抗原对应57种特异性基因。
进一步的，本发明实施例为了检测所述57种副溶血弧菌k抗原基因分型。在表1所公开的副溶血弧菌57种k抗原的特异基因的基础上，设计了包括seqidno.1～seqidno.114所述的杂交连接引物，一共为57对杂交连接引物对。所述57对杂交连接引物对的引物序列的设计，包括如下的步骤：根据418株副溶血弧菌的全基因组进行生物信息学方法分析以及从ncbi数据库中查找18株副溶血弧菌的特异基因组序列，最终分析得到57种特异性副溶血弧菌k抗原基因序列，并将所述57种特异性副溶血弧菌k抗原基因序列进行比对分析，确保不会和其他细菌的基因组产生交叉。针对所述57种特异性副溶血弧菌k抗原基因序列，分别设计多对杂交连接引物，并进行筛选，筛选得到tm峰值较高，且pcr扩增反应中不会产生非特异性峰的引物。在本发明中，由于需要将57对杂交连接引物合理分配至3管中，并混合进行试验，要保证混合至一管的杂交连接引物之间进行检测的过程中不会出现干扰，同时还需要保证能够特异性扩增对应抗原基因。本发明实施例不断优化，筛选得到所述57对杂交连接引物对，保证所述57种副溶血弧菌k抗原基因分型通过三管试验，就可以同时进行抗原基因分型的检测，检测速度快，准确性高。
具体的，所述57对杂交连接引物对，包括上游杂交连接引物和下游杂交连接引物。进一步的，所述上游杂交连接引物的引物序列结构包括四部分，从5’端开始依次包括通用引物上游序列(p1)、间隔序列(s)、熔点温度标签序列(tmtag)、上游杂交识别序列(h1)；其中，通用上游引物序列是用于扩增整个引物；间隔序列是用于连接通用上游引物序列与熔点温度标签序列；熔点温度标签序列是用于与对应的荧光探针杂交并产生对应的tm值；上游杂交识别序列是与待测的特异性抗原基因杂交的上游杂交识别序列。所述下游杂交连接引物的引物序列结果包括两部分，从5’端开始依次包括下游杂交识别序列(h2)、下游通用引物(p2)；其中，下游杂交识别序列是与待测的特异性抗原基因杂交的下游杂交识别序列，该序列与上游杂交识别序列最终与待测的特异性抗原基因形成完全互补的序列片段，下游通用引物是用于扩增整个引物。具体的，所述基于荧光探针熔解曲线法检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组的具体序列如表2所示。在本发明具体实施例中，为了保证同时对所述57种副溶血弧菌k抗原基因分型进行检测，确保试验过程中不会出现非特异性扩增，将所述57种副溶血弧菌k抗原基因分型分成三管。其中，第1管包括k70、k68、k17、k56、k29、k25、k8、k6、k18、k42、k44、k5、k60、k11、k41、k12、k28、k13、k9、k36、k3二十一种抗原基因分型的杂交连接引物；第2管包括k1、k4、k19、k20、k55、k63、k34、k65、k49、k48、k30、k21、k67、k69、k71、k38、k37、k33、k32、k31、k23二十一种抗原基因分型的杂交连接引物；第3管包括k39、k22、k15、k45、k40、k43、k24、k7、k54、k59、k46、k51、k52、k64、k53十五种抗原基因分型的杂交连接引物。
优选的，所述引物组还包括设置了熔点温度标签，熔点温度标签是上游引物设计中的序列组成部分，用于与对应的荧光探针杂交并产生对应的tm值。其中，所述熔点温度标签选自rox通道熔点温度标签、cy5通道熔点温度标签和fam通道熔点温度标签中的任意一种。不同的通道不同的熔点温度标签对应不同的tm温度值，因此，设置多个不同的熔点温度标签，能够特异性检测副溶血弧菌k抗原基因分型。
进一步优选的，如表3所示，所述rox通道熔点温度标签包括rox-1熔点温度标签、rox-2熔点温度标签、rox-3熔点温度标签、rox-4熔点温度标签、rox-5熔点温度标签、rox-6熔点温度标签、rox-7熔点温度标签、rox-8熔点温度标签，其中，所述rox-1熔点温度标签的序列如seqidno.115所示、所述rox-2熔点温度标签的序列如seqidno.116所示、所述rox-3熔点温度标签的序列如seqidno.117所示、所述rox-4熔点温度标签的序列如seqidno.118所示、所述rox-5熔点温度标签的序列如seqidno.119所示、所述rox-6熔点温度标签的序列如seqidno.120所示、所述rox-7熔点温度标签的序列如seqidno.121所示、所述rox-8熔点温度标签的序列如seqidno.122所示。
进一步优选的，如表3所示，所述cy5熔点温度标签包括cy5-1熔点温度标签、cy5-2熔点温度标签、cy5-3熔点温度标签、cy5-4熔点温度标签、cy5-5熔点温度标签、cy5-6熔点温度标签、cy5-7熔点温度标签，其中，所述cy5-1熔点温度标签的序列如seqidno.123所示、所述cy5-2熔点温度标签的序列如seqidno.124所示、所述cy5-3熔点温度标签的序列如seqidno.125所示、所述cy5-4熔点温度标签的序列如seqidno.126所示、所述cy5-5熔点温度标签的序列如seqidno.127所示、所述cy5-6熔点温度标签的序列如seqidno.128所示、所述cy5-7熔点温度标签的序列如seqidno.129所示。
进一步优选的，如表3所示，所述fam熔点温度标签包括fam-1熔点温度标签、fam-2熔点温度标签、fam-3熔点温度标签、fam-4熔点温度标签、fam-5熔点温度标签、fam-6熔点温度标签，其中，所述fam-1熔点温度标签的序列如seqidno.130所示、所述fam-2熔点温度标签的序列如seqidno.131所示、所述fam-3熔点温度标签的序列如seqidno.132所示、所述fam-4熔点温度标签的序列如seqidno.133所示、所述fam-5熔点温度标签的序列如seqidno.134所示、所述fam-6熔点温度标签的序列如seqidno.135所示。
在本发明中，采用所述引物组基于荧光探针熔解曲线法进行检测的技术原理如下：首先，进行杂交反应，使每对上游杂交连接引物和下游杂交连接引物分别成功识别同一靶标基因的两段连续的特异序列；其次，进行连接反应，使每对上游杂交连接引物和下游杂交连接引物在特异性连接酶的作用下连接成一整体，作为后续步骤的模板；再次，进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应，以所述杂交连接产物为模板进行扩增，其中，通用引物会对其进行扩增，而荧光探针最后会与连接产物的扩增产物进行杂交；最后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应，通过收集发生的荧光信号对应分析得到tm值，根据不同tm的信号峰即可检测得到特异性的副溶血弧菌k抗原基因分型。
表1
表2
表3
本发明还提供了一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。本发明提供的试剂盒含有本发明所述的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对57种副溶血弧菌k抗原基因分型同时进行检测，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
优选的，所述试剂盒还包括连接酶、连接酶缓冲液；其中，所述引物组、所述连接酶以及所述连接酶缓冲液用于杂交连接反应。
优选的，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、mgcl2、dntp、rtaq酶、上下游通用引物和荧光探针；其中，所述pcr缓冲液、所述mgcl2、所述dntp、所述rtaq酶、所述上下游通用引物和所述荧光探针用于荧光探针熔解曲线法检测反应。
优选的，如表4所示，上游通用引物(f)为seqidno.136，其引物序列为5’-gtggcagggcgctacgaacaat-3’；下游通用引物(r)为seqidno.137，其引物序列为5’-gcccagcaagatccaatctca-3’。
优选的，所述荧光探针选自rox荧光探针、cy5荧光探针和fam荧光探针的任意一种。所述荧光探针是在探针熔解曲线反应过程中用于与上游引物中的熔点温度标签序列进行结合的序列。进一步优选的，如表4所示，所述rox荧光探针为seqidno.138，其序列(5’-3’)为rox-acgactctggctgctcgttcgtgacg-bhq2；所述fam荧光探针为seqidno.139，其序列(5’-3’)为fam-tcggtccttcatcgctcagccttcaccgg-bhq1；所述cy5荧光探针为seqidno.140，其序列(5’-3’)为cy5-cggtgaggcccttggcaggttgctatcaccc-bhq2。
表4
相应的，本发明还提供一种检测副溶血弧菌k抗原基因分型的方法，提供所述检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对所述副溶血弧菌k抗原基因分型进行检测。
本发明所述的检测副溶血弧菌k抗原基因分型的方法，利用所述检测副溶血弧菌k抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对所述副溶血弧菌k抗原基因分型进行检测。由于试剂盒含有本发明所述的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对57种副溶血弧菌k抗原基因分型同时进行检测，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
优选的，检测副溶血弧菌k抗原基因分型的方法依次包括杂交连接反应以及荧光探针熔解曲线法检测反应，进一步优选的，所述荧光探针熔解曲线法检测反应依次包括进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。
优选的，所述杂交连接反应包括如下步骤：
s01.将引物组溶液与副溶血弧菌dna模板混合，进行第一变性处理得到引物组混合液；
s02.将所述引物组混合液与所述连接酶、所述连接酶缓冲液混合，进行杂交连接反应得到杂交连接产物。
在上述步骤s01中，将引物组溶液与副溶血弧菌dna模板混合，进行第一变性处理得到引物组混合液。优选的，将合成得到的引物组进行溶解，得到浓度为5μmol/l的母液，进一步再进行稀释，得到初始浓度为10nmol/l的引物组溶液进行试验。
在本发明优选实施例中，将引物组溶液与副溶血弧菌dna模板混合的步骤中，所述引物组溶液的添加量为1.5ul；所述副溶血弧菌dna模板的添加量为5ul；以上述添加量进行混合后，进行第一变性处理。进一步优选的，进行第一变性处理得到引物组混合液的步骤中，所述第一变性处理的条件如下：95℃变性5分钟，75℃暂停(取出，加3.5ul杂交连接反应液)。
在上述步骤s02中，将所述引物组混合液与所述连接酶、所述连接酶缓冲液混合，进行杂交连接反应得到杂交连接产物。优选的，所述反应体系如下：3.5ul杂交连接反应液，包括1μl单位为1u/μl的连接酶，1μl连接酶缓冲液，1.5μl超纯水。进一步优选的，进行杂交连接反应得到杂交连接产物的步骤中，所述杂交连接反应的条件如下：60℃连接60分钟，95℃变性5分钟，4℃保存。
进一步，采用所述制备得到的杂交连接产物作为模板进行所述荧光探针熔解曲线法检测反应。
优选的，所述荧光探针熔解曲线法检测反应，包括进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。
进一步优选的，所述荧光探针熔解曲线法检测反应的反应体系如下表5：
表5
进一步地，所述荧光探针熔解曲线法检测反应，包括进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。在本发明优选实施例中，所述进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应的条件如下：95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，57℃退火20秒，72℃延伸20秒，设置38个循环反应，同时在57℃采集rox、cy5、fam的荧光信号。进一步地，进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应，其中，所述进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应的条件如下：95℃变性1分钟，40℃杂交2分钟，从40℃逐步升温至85℃，并采集rox、cy5、fam的荧光信号，其中，从40℃逐步升温至85℃，每上升0.5℃采集一次荧光信号。
下面以具体实施例进一步进行说明。
实施例1
引物组设计
根据上述表1提供的副溶血弧菌57种k抗原的特异基因，设计得到上述表2中seqidno.1～seqidno.114的引物序列，其中，所述引物序列包括上述表3中所述的seqidno.115～seqidno.135的荧光探针；得到用于检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组。
实施例2
57种副溶血弧菌k抗原基因分型的检测
将57种副溶血弧菌k抗原基因分型分成3管，同时进行以下步骤的检测；其中，第1管包括k70、k68、k17、k56、k29、k25、k8、k6、k18、k42、k44、k5、k60、k11、k41、k12、k28、k13、k9、k36、k3二十一种抗原基因分型的杂交连接引物；第2管包括k1、k4、k19、k20、k55、k63、k34、k65、k49、k48、k30、k21、k67、k69、k71、k38、k37、k33、k32、k31、k23二十一种抗原基因分型的杂交连接引物；第3管包括k39、k22、k15、k45、k40、k43、k24、k7、k54、k59、k46、k51、k52、k64、k53十五种抗原基因分型的杂交连接引物。
(1)进行杂交连接反应
将引物组溶液与副溶血弧菌dna模板混合，进行第一变性处理得到引物组混合液。其中，所述反应体系如下：所述引物组溶液的添加量为1.5ul，所述副溶血弧菌dna模板的添加量为5ul；所述反应条件如下：95℃变性5分钟，75℃暂停(取出，加3.5ul杂交连接反应液)。将所述引物组混合液与所述连接酶、所述连接酶缓冲液混合，进行杂交连接反应得到杂交连接产物。其中，所述反应体系如下：3.5ul杂交连接反应液，包括1μl单位为1u/μl的连接酶，1μl连接酶缓冲液，1.5μl超纯水；所述反应条件如下：60℃连接60分钟，95℃变性5分钟，4℃保存。
(2)进行荧光探针熔解曲线法pcr扩增反应
所述荧光探针熔解曲线法检测反应的反应体系如上述表5，依次混合所述试剂进行反应，所述反应条件如下：95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，57℃退火20秒，72℃延伸20秒，设置38个循环反应，同时在57℃采集rox、cy5、fam的荧光信号。
表5
(3)进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。其中，所述进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应的条件如下：95℃变性1分钟，40℃杂交2分钟，从40℃逐步升温至85℃，并采集rox、cy5、fam的荧光信号，其中，从40℃逐步升温至85℃，每上升0.5℃采集一次荧光信号。
实施例3
方法学评价
选取488株临床菌株，使用上述实施例2的57种副溶血弧菌k抗原基因分型的检测方法进行检测，同时采用传统血清法一同进行分析，考察实施例2所述的57种副溶血弧菌k抗原基因分型的检测方法的灵敏度和特异性。
结果分析
实施例2结果分析
对第一管数据进行分析，如下表6所示，由图1可得，第一管rox荧光通道中(ntc为阴性对照)，k70抗原的tm温度峰值为50.5℃，k68抗原的tm温度峰值为54.0℃，k17抗原的tm温度峰值为57.5℃，k56抗原的tm温度峰值为60.0℃，k29抗原的tm温度峰值为63.5℃，k25抗原的tm温度峰值为66.5℃，k8抗原的tm温度峰值为70.0℃，k6抗原的tm温度峰值为74.5℃；由图2可得，第一管cy5荧光通道中(ntc为阴性对照)，k18抗原的tm温度峰值为53.5℃，k42抗原的tm温度峰值为56.0℃，k44抗原的tm温度峰值为58.5℃，k5抗原的tm温度峰值为61.0℃，k60抗原的tm温度峰值为66.0℃，k11抗原的tm温度峰值为70.5℃，k41抗原的tm温度峰值为74.0℃；由图3可得，第一管fam荧光通道中(ntc为阴性对照)，k12抗原的tm温度峰值为51.0℃，k28抗原的tm温度峰值为57.0℃，k13抗原的tm温度峰值为61.5℃，k9抗原的tm温度峰值为66.0℃，k36抗原的tm温度峰值为70.0℃，k3抗原的tm温度峰值为74.5℃。
表6
对第二管数据进行分析，如下表7所示，由图4可得，第二管rox荧光通道中(ntc为阴性对照)，k1抗原的tm温度峰值为51.0℃，k4抗原的tm温度峰值为54.0℃，k19抗原的tm温度峰值为57.0℃，k20抗原的tm温度峰值为59.0℃，k55抗原的tm温度峰值为62.5℃，k63抗原的tm温度峰值为66.5℃，k34抗原的tm温度峰值为70.0℃，k65抗原的tm温度峰值为73.5℃；由图5可得，第二管cy5荧光通道中(ntc为阴性对照)，k49抗原的tm温度峰值为50.5℃，k48抗原的tm温度峰值为55.5℃，k30抗原的tm温度峰值为58.5℃，k21抗原的tm温度峰值为61.5℃，k67抗原的tm温度峰值为66.0℃，k69抗原的tm温度峰值为70.5℃，k71抗原的tm温度峰值为74.5℃；由图6可得，第二管fam荧光通道中(ntc为阴性对照)，k38抗原的tm温度峰值为52.0℃，k37抗原的tm温度峰值为57.0℃，k33抗原的tm温度峰值为61.0℃，k32抗原的tm温度峰值为65.5℃，k31抗原的tm温度峰值为69.5℃，k23抗原的tm温度峰值为74.0℃。
表7
对第三管数据进行分析，如下表8所示，由图7可得，第三管rox荧光通道中(ntc为阴性对照)，k39抗原的tm温度峰值为50.5℃，k22抗原的tm温度峰值为54.0℃，k15抗原的tm温度峰值为57.0℃，k45抗原的tm温度峰值为59.0℃，k40抗原的tm温度峰值为62.5℃，k43抗原的tm温度峰值为66.5℃，k24抗原的tm温度峰值为70.0℃，k7抗原的tm温度峰值为74.0℃；由图8可得，第三管cy5荧光通道中(ntc为阴性对照)，k54抗原的tm温度峰值为53.0℃，k59抗原的tm温度峰值为56.0℃，k46抗原的tm温度峰值为58.5℃，k51抗原的tm温度峰值为61.5℃，k52抗原的tm温度峰值为66.0℃，k64抗原的tm温度峰值为70.5℃，k53抗原的tm温度峰值为74.0℃。
表8
进一步的，分别对第一管、第二管、第三管的最低检出限进行分析，具体的，如表9所示，第一管的最低检出限为0.1～1.0ng/μl；如表10所示，第二管的最低检出限为0.1～1.0ng/μl；如表11所示，第三管的最低检出限为0.1ng/μl；即采用实施例2所示的方法的检测能力级别为0.1～1.0ng/μl。
表9
表10
表11
实施例3结果分析
通过比较实施例2的57种副溶血弧菌k抗原基因分型的检测方法与传统血清法，以血清学法为参考，如下表12实施例2所述的荧光探针熔解曲线法的灵敏度为100％，特异度为100％，kappa值大于0.75为1.0。这说明荧光探针熔解曲线法与传统血清法的一致性极好，即实施例2所述的“荧光探针熔解曲线法”可作为副溶血弧菌k抗原的快速分型分子鉴定方法。
表12
注：荧光探针熔解曲线法的灵敏度：a/(a+c)×100％＝100％
荧光探针熔解曲线法的特异度：d/(b+d)×100％＝100％
荧光探针熔解曲线法的符合率：(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝100％
荧光探针熔解曲线法的kappa＝(po-pe)/(1-pe)＝1
因此，采用本发明提供的检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组，是基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术，根据418株副溶血弧菌的全基因组进行生物信息学方法分析以及公共数据库中18株副溶血弧菌特异基因序列分析，获取并筛选了副溶血弧菌57种k抗原的特异基因和具体的基因区域，针对所得到的副溶血弧菌57种k抗原的特异基因进行设计得到的，保证所述引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测57种副溶血弧菌k抗原基因分型，提高了副溶血弧菌的抗原基因分型的检测时间和检测准确性，同时也能保证较高的灵敏度和特异度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>深圳市疾病预防控制中心
<120>检测副溶血弧菌k抗原基因分型的引物组和试剂盒
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