黎药红葱中两个新颖萘醌二聚体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及黎药红葱中两个新颖萘醌二聚体及其制备方法和应用，属于医药生物技术领域。

背景技术：

红葱(eleutherineamericana)为鸢尾科(iridacea)红葱属(eleutherine)植物的全草或鳞茎，又名小红蒜、红葱头、百步还阳。据《中国植物志》记载，鸢尾科红葱属植物全世界约4种，包括e.blulbosa、e.angusta、e.citriodora、e.latifolia,主要分布于东南亚和美洲地区。红葱味苦，性凉，具有清热解毒、利尿除湿、散瘀消肿、止血等功效，其鳞茎或全草均可入药，临床上应用广泛，为我国黎药所收载，主要在我国海南、广西等地区种植栽培。由于来源问题，目前国外对红葱的研究报道几乎空白，而国内对红葱的研究较为肤浅，仅从中得到少量的酚酸、甾体和少量的单倍醌类。在药理活性研究方面，国内对红葱提取物进行筛选发现其具有多方面的药理活性包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、心脑血管作用等。

技术实现要素：

本领域对于红葱新药效成分的研究相对较少，基于此，发明人通过深入研究，从黎药红葱中分离鉴定得到两个新颖的萘醌类二聚体，经鉴定确认其拥有全新的碳结构骨架，具有抗菌，抗肿瘤等药理活性。

本发明采取的技术方案如下：

本发明得到了黎药红葱中两个新颖萘醌二聚体，结构式分别如式1和式2所示：

本发明还具体提供了所述萘醌二聚体的制备方法，包括以下步骤：

s1：取干燥的红葱鳞茎粉末，使用甲醇浸提，甲醇提取液减压浓缩后得到红葱提取物；

s2：将红葱提取物分散于水中，依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得不同极性部位；

s3：取乙酸乙酯部位，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯至乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱，得不同洗脱部位；

s4：取乙酸乙酯-甲醇部位，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，依据薄层层析色谱的rf值合并，得到8个部位fr1.a～h；fr1.a展开剂为体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯，rf值为0.25-0.5；fr1.b展开剂为体积比1:8的石油醚-乙酸乙酯，rf值为0.2-0.4；fr1.c展开剂为体积比0:1的石油醚-乙酸乙酯，rf值为0.2-0.5；fr1.d展开剂为体积比99:1的乙酸乙酯-甲醇，rf值为0.3-0.6；fr1.e展开剂为体积比95:5的乙酸乙酯-甲醇，rf值为0.2-0.5；fr1.f展开剂为体积比9:1的乙酸乙酯-甲醇，rf值为0.2-0.5；fr1.g展开剂为体积比6:1的乙酸乙酯-甲醇，rf值为0.3-0.6；fr1.h展开剂为体积比4:1的乙酸乙酯-甲醇，rf值为0.4-0.6。

s5：取fr1.b，使用液相色谱，以甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物1；

s6：取fr1.d，使用液相色谱，以甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物2。

优选的，步骤s1中，红葱鳞茎粉末与甲醇的料液比为1kg:(8～10)l。

优选的，步骤s3中，洗脱梯度为：石油醚-乙酸乙酯体积比10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，乙酸乙酯-甲醇体积比100:1、80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、0:100。

优选的，步骤s4中，所述乙酸乙酯-甲醇部位为以体积比80:1的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂洗脱所得部位。

优选的，步骤s4中，洗脱梯度为：80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、0:100。

优选的，步骤s5中，甲醇水的体积分数为55～60％。

优选的，步骤s6中，甲醇水的体积分数为50～55％。

本发明通过抗菌活性筛选和抗肿瘤活性筛选发现，所得化合物1和化合物2具有明显的抗菌和抗肿瘤活性，提示本发明化合物在抗菌、抗肿瘤药物或保健品中具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

a.本发明从红葱中获得两个新颖的萘醌二聚体，实验证明，化合物1和化合物2均能抑制多种细菌的生长，其中对大肠杆菌的抑制效果最为显著，mic值最低，分别为0.06、0.24μg/ml，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)具有显著的抑制活性，mic值分别为0.78、0.32μg/ml。化合物1和化合物2在0.05～0.6μm浓度下对多种肿瘤细胞均有不同程度的杀伤作用，表现出较强的增殖抑制活性，其中，化合物1在0.3μm浓度下，对huh-7、bel-7402、h22、s180的抑制率达到50％以上，在0.6μm浓度下，对bel-7402和s180的抑制率达到90％以上。化合物2在0.3μm浓度下对huh-7、s180和a549的抑制率达到50％以上，在0.6μm浓度下，对huh-7、s180、a549和ags的抑制率达到100％以上。以上结果表明，本发明化合物就有明细的抗菌和抗肿瘤活性，在预防或治疗肿瘤疾病药物或保健品中具有良好的应用前景。

b.本发明化合物的制备方法相对简单，且提取过程中未使用高毒试剂，该方法安全、高效。

附图说明

图1化合物1-2的主要cosy和hmbc相关

图2化合物1-2的ecd光谱图

图3化合物1的¹h-nmr谱(dmso-d6)

图4化合物1的¹³c-nmr谱(dmso-d6)

图5化合物1的cosy谱(dmso-d6)

图6化合物1的hsqc谱(dmso-d6)

图7化合物1的hmbc谱(dmso-d6)

图8化合物1的noesy谱(dmso-d6)

图9化合物2的¹h-nmr谱(cdcl3)

图10化合物2的¹³c-nmr谱(cdcl3)

图11化合物2的cosy谱(cdcl3)

图12化合物2的hsqc谱(cdcl3)

图13化合物2的hmbc谱(cdcl3)

图14化合物2的noesy谱(cdcl3)

图15化合物1的hr-esi-ms谱

图16化合物2的hr-esi-ms谱

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

萘醌二聚体的制备方法，包括以下步骤：

s1：取干燥的红葱鳞茎粉末，使用甲醇室温浸提3次，料液比1kg：10l，每次提取24h，甲醇提取液减压浓缩后得到红葱提取物；

s2：将红葱提取物分散于水中，依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得不同极性部位；

s3：取乙酸乙酯部位，干法上样，湿法装柱，进行硅胶柱层析(14×100cm,100-200目)，以石油醚-乙酸乙酯至乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱，得不同洗脱部位；洗脱梯度为：石油醚-乙酸乙酯体积比10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，乙酸乙酯-甲醇体积比100:1、80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、0:100；

s4：取乙酸乙酯-甲醇部位(80:1)，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、0:100)为洗脱剂，梯度洗脱，依据薄层层析色谱的rf值合并，得到8个部位fr1.a～h；fr1.a展开剂为石油醚-乙酸乙酯(1:1)，rf值为0.25-0.5；fr1.b展开剂为石油醚-乙酸乙酯(1:8)，rf值为0.2-0.4；fr1.c展开剂为石油醚-乙酸乙酯(0:1)，rf值为0.2-0.5；fr1.d展开剂为乙酸乙酯-甲醇(99:1)，rf值为0.3-0.6；fr1.e展开剂为乙酸乙酯-甲醇(95:5)，rf值为0.2-0.5；fr1.f展开剂为乙酸乙酯-甲醇(9:1)，rf值为0.2-0.5；fr1.g展开剂为乙酸乙酯-甲醇(6:1)，rf值为0.3-0.6；fr1.h展开剂为乙酸乙酯-甲醇(4:1)，rf值为0.4-0.6；

s5：取fr1.b，使用hplc半制备液相色谱，以sb-phenyl色谱柱，以55％甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物1；

s6：取fr1.d，使用hplc半制备液相色谱，以sb-phenyl色谱柱，以50％甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物2。

实施例2：

萘醌二聚体的制备方法，包括以下步骤：

s1：取干燥的红葱鳞茎粉末，使用甲醇室温浸提3次，料液比1kg：8l，每次提取24h，甲醇提取液减压浓缩后得到红葱提取物；

s2：将红葱提取物分散于水中，依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得不同极性部位；

s3：取乙酸乙酯部位，干法上样，湿法装柱，进行硅胶柱层析(14×100cm,100-200目)，以石油醚-乙酸乙酯至乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱，得不同洗脱部位；洗脱梯度为：石油醚-乙酸乙酯体积比10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，乙酸乙酯-甲醇体积比100:1、80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、0:100；

s4：取乙酸乙酯-甲醇部位(80:1)，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、0:100)为洗脱剂，梯度洗脱，依据薄层层析色谱的rf值合并，得到8个部位fr1.a～h；fr1.a展开剂为石油醚-乙酸乙酯(1:1)，rf值为0.25-0.5；fr1.b展开剂为石油醚-乙酸乙酯(1:8)，rf值为0.2-0.4；fr1.c展开剂为石油醚-乙酸乙酯(0:1)，rf值为0.2-0.5；fr1.d展开剂为乙酸乙酯-甲醇(99:1)，rf值为0.3-0.6；fr1.e展开剂为乙酸乙酯-甲醇(95:5)，rf值为0.2-0.5；fr1.f展开剂为乙酸乙酯-甲醇(9:1)，rf值为0.2-0.5；fr1.g展开剂为乙酸乙酯-甲醇(6:1)，rf值为0.3-0.6；fr1.h展开剂为乙酸乙酯-甲醇(4:1)，rf值为0.4-0.6；

s5：取fr1.b，使用hplc半制备液相色谱，以sb-phenyl色谱柱，以60％甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物1；

s6：取fr1.d，使用hplc半制备液相色谱，以sb-phenyl色谱柱，以55％甲醇水为洗脱剂，等度洗脱，得到化合物2。

试验例1：化合物结构鉴定

运用现代结构鉴定技术，确定所得到的活性成分化学结构，发现新颖结构活性成分。结果见图1-图16。

化合物1：

eleucanainonea(1)，浅黄色粉末，分子式为c32h28o9(m/z579.1648[m+na]⁺)(计算值c32h28nao9579.1631)。紫外光谱显示在213,269,308nm处有最大吸收峰。红外光谱显示在νmax3450cm^-1，νmax1575,1510,1445cm^-1，νmax1215,1175,1065cm^-1，νmax1705,1655,1610cm^-1有红外吸收。

¹hnmr显示有7个芳香质子氢，3个亚甲基氢，1个次甲基氢，2个甲氧基氢及2个甲基氢信号。3个芳香质子氢[h-7(δh7.63,1h,t,j＝8.4hz),h-8(δh7.80,1h,t,j＝8.4hz),h-9(δh7.55,1h,t,j＝8.4hz)]的¹h-¹h耦合常数表明化合物1存在一个amx结构。同时，4个相邻的质子氢[δh6.68(d,j＝2.4hz,h-3′),6.28(d,j＝2.4hz,h-5′),7.11(d,j＝2.4hz,h-8′)，6.31(d,j＝2.4hz,h-10′)]表明有2个ab系统结构。¹³cnmr显示总共32个碳信号，包括2个羰基碳(δc184.0,180.9)，15个季碳(δc160.0-71.4)，8个次甲基碳(δc118.2,135.2,119.4,111.6,103.8,105.9,99.2)，3个亚甲基碳(δc40.3,28.9,63.4)，2个甲氧基(δc56.3,55.2)，2个甲基碳(δc24.2,20.4)。所有的氢碳信号归属通过hsqc波谱分析得到。综合分析2dnmr波谱数据，说明化合物中含有1a和1b两个结构片段。1a结构与化合物eleutherinf相似，不同之处在于eleutherinf中c-2的甲基在c-2(δc96.2)和c-12(δc71.4)被环醚取代，同时1个甲基(δc24.2)连接在c-12上。这些结构归属被hmbc谱证实。在hmbc光谱图中，h-1(δh3.15,d,j＝13.2hz；δh2.29,d,j＝13.2hz)和c-2,c-12，c-13相关，ch3-13(δh1.49,s)和c-12相关。

1b结构片段鉴定为4′,13′-dihydroxy-9′-methoxy-6′,7′-benzofuran。在hmbc谱图中，h-3′(δh6.68,d,j＝2.4hz)和c-4′(δc158.2)相关，h-5′(δh6.28,d,j＝2.4hz)和c-4′,c-6′(δc154.0)相关，h-8′(δh7.11,d,j＝2.4hz)和c-7′(δc149.9),c-9′(δc160.0)相关，h-10′(δh6.31,d,j＝2.4hz)和c-9′,c-12相关，h-13′(δh4.60,dd,j＝12.0,3.0hz；δh4.73,dd,j＝12.0,6.6hz)和c-1’(δc114.5),c-2′(δc140.3),c-3′(δc111.6)相关，oh-4′(δh9.74,s)和c-4′相关，oh-13′(δh5.47,dd,j＝6.6,3.0hz)和c-13′,och3-9′(δc55.2)和c-9′相关。关键性相关ch3-13和c-12,c-12′相关，h-10′和c-12相关，表明1b结构片段通过一个单键连接在1a结构片段的c-12位。

手性中心的相对构型通过noesy光谱和耦合常数判断。h-4和h-1a，h-1a和ch3-13相关，表明这些氢处于同一平面。c-2和c-12间的醚键处于一个方向。oh-4′和oh-13′,h-3′,h-5′相关，h-10′和och3-9′，h-8′相关，表明它们共平面。由于c-12/c-11′单键，造成了化学扭力，阻碍了该化合物的单晶的形成，因此该化合物的绝对构型不能通过x-ray判断。因此，采用电子圆二色谱法(ecd)测定其绝对构型，判断其绝对构型为2s,4s,12r.

经以上分析，确定化合物1的结构如下所示：

化合物2：

eleucanainoneb(2)，红棕色粉末，[m+h]⁺m/z527.1717(计算值为c31h27o8527.1706)。化合物2在213,250,269处显示最大紫外吸收。红外吸收峰在νmax3425,1710,1665,1615cm^-1。¹hnmr光谱显示化合物2有一个amx系统[δh7.45(h-6,1h,d,j＝8.4hz),δh7.53(h-7,1h,t,j＝8.4hz)，δh7.22(h-8,1h,d,j＝8.4hz)]，6个次甲基氢[δh5.14(h-1,q,j＝6.6hz),δh4.49(h-3,m),δh4.51(h-4,d,j＝5.4hz),δh6.48(h-1′,s),δh7.83(h-5′,s),δh6.26(h-10′,s)]，4个甲基氢[δh1.73(1-ch3,d,j＝6.6hz),δh1.29(3-ch3,d,j＝6.6hz),δh2.96(6′-ch3,s),δh2.48(11′-ch3,s)]，1个甲氧基氢[δh3.99(9-och3,s)]及1个羟基氢[δh8.55(s)].¹³cnmr光谱显示化合物2有31个碳原子，包括4个甲基，1个甲氧基，9个次甲基，14个季碳以及3个羰基信号(δc183.2,183.6,178.9)。碳氢信号归属通过hsqc光谱确定。

详细的1dnmr和2dnmr分析表明，化合物由2a和2b两个部分组成。2a为一个萘醌骨架的化合物，与已知化合物eleutherin结构相似，不同之处在于2a中ch3-1的相对构型为α-位。2b结构片段鉴定为萘酮类骨架，与化合物dihydroeleutherinol结构相似，除了羟基和甲基的位置不同。在hmbc谱图中，oh-2′(δh8.55,s)和c-1′(δc107.5),c-2′，c-3′相关，ch3-6′(δh2.96,s)和c-5′(δc122.7)，c-6′(δc136.1)相关.根据c-7′的低场迁移和分子重量，oh-7′连接在c-7′(δc157.3)。h-4和c-7′,c-8′(δc111.5)相关，h-3和c-8′相关，表明2b通过c-8′/c-4单键与2a连接。

化合物2的相对构型通过noesy光谱确定。ch3-3和h-1,h-4相关，表明它们在同一平面。由于c-4/c-8′的单键存在化学扭力，单晶培养不成功。故采用ecd光谱测定化合物2的绝对构型，显示其绝对构型为(1s,3s,4r)-2，与ecd实验光谱一致。

经以上分析，确定化合物2的结构如下所示：

表1.化合物1的nmr数据(dmso-d6)

表2.化合物2的nmr数据(cdcl3)

试验例2：抗菌活性筛选

对实施例1所得的2个化合物进行抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌和结核杆菌活性筛选。

菌种分别接种于培养基上，37℃培养24h后，从平板中刮取菌落，以无菌生理盐水稀释，用麦氏比浊管测细菌浓度，配制成9×10⁶cfu/ml细菌稀释液，从各种细菌稀释管中分别取0.05ml菌液，点种于各浓度药物平板及不含药物的对照平板上，37℃培养24h后观察并记录化合物的mic值，实验重复3次，结果见表3。

表3

结果显示：化合物1和化合物2均能抑制多种细菌的生长，其中对大肠杆菌的抑制效果最为显著，mic值最低，分别为0.06、0.24μg/ml。

试验例3：抗肿瘤活性筛选

采用mtt法研究了2种化合物对hepg2、sk-hep-1、huh-7、bel-7402、h22、s180、a549、mcf-7、ags和hccc-9810的增殖抑制作用，用抑制率评价生长抑制效果。结果见表4和表5。

表4化合物1的肿瘤抑制率

表5化合物2的肿瘤抑制率

结果显示：化合物1和化合物2在0.05～0.6μm浓度下对hepg2、sk-hep-1、huh-7、bel-7402、h22、s180、a549、mcf-7、ags和hccc-9810细胞株均有不同程度的杀伤作用，表现出较强的增殖抑制活性。

化合物1在0.3μm浓度下，对huh-7、bel-7402、h22、s180的抑制率达到50％以上，在0.6μm浓度下，对bel-7402和s180的抑制率达到90％以上。

化合物2在0.3μm浓度下对huh-7、s180和a549的抑制率达到50％以上，在0.6μm浓度下，对huh-7、s180、a549和ags的抑制率达到100％以上。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。