白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物及其制备方法及应用与流程

本发明涉及化学技术和药学技术领域，尤其是一种白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物及其制备方法及应用。

背景技术：

根据药物设计的活性骨架拼接和迁越原理，把两个或多个具有生物活性骨架拼接成一个潜在生物活性的多骨架分子在有机化学和医药化学中是极其重要的研究领域。(1)白杨素属于黄酮骨架,也普遍存在天然产物和药物分子中。(2)2-氨基3-氰基吡喃骨架也普遍存在天然产物和药物分子中,如化合物mx58151(如图6所示)。这些化合物在解除病痛、经济发展中起着重大作用。鉴于吡喃、螺环氧化吲哚和白杨素骨架具有潜在的生物活性。因此，把2-氨基3-氰基吡喃骨架拼接到白杨素骨架上，合成一系列新的潜在多活性官能团的白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物。特别说明的是:本专利所合成的白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物,区域选择性不同于已知文献报道的化合物(medchemres.2015,24,3696)，是区域选择性产生的新化合物(如图7所示)，可以为生物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物及其制备方法与应用，它是一类重要的医药中间体类似物和药物分子类似物，对药物筛选和制药行业具有重要的应用价值，且其合成方法非常经济简便。

本发明还发现该类化合物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。

本发明是这样实现的：一种白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物，该化合物具有如下通式(ⅰ)的结构：

式中，r¹为h或甲氧基；r²为硝基、甲氧基、叔丁基、甲基、氟、氯、溴或氢；r³为甲氧基或氢。

白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物的制备方法，在有机溶剂中，在无机碱性催化剂的作用下，将各种取代的苯甲醛和丙二腈缩合的knoevennagel产物2，与各种取代的白杨素1发生区域选择性michael环加成反应，获得白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物3。

合成路线举例如下：

其中合成路线中的化合物，其取代基满足式中，r¹为h或甲氧基；r²为硝基、甲氧基、叔丁基、甲基、氟、氯、溴或氢；r³为甲氧基或氢。

反应机理如下：

所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃。

所述的无机碱性催化剂为：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钾或碳酸钠。

各种取代的苯甲醛和丙二腈缩合的knoevennagel产物，与各种取代的白杨素发生区域选择性michael环加成反应，温度为室温至70℃，反应时间为1至10小时。

白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。

通过采用上述技术方案，在有机溶剂中，在无机碱性催化剂的作用下，将各种取代的苯甲醛和丙二腈缩合的knoevennagel产物2，与各种取代的白杨素1发生区域选择性michael环加成反应，获得白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物3。特别强调的是，本专利所合成的白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物,区域选择性不同于已知文献报道的化合物(medchemres.2015,24,3696)，是区域选择性产生的新化合物(如图7所示)，可以为生物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值。且该骨架化合物对人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(nci-h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)具有抑制活性的作用。本发明操作简单易行，原料合成便宜易得，可以在各种有机溶剂中进行，也具有较好的空气稳定性，适用性广，对于各种取代基都有很好的兼容性。

附图说明

图1及图2为本发明的实施例的化合物3a谱图数据；

图3及图4为本发明的实施例的化合物3b谱图数据；

图5为本发明的实施例的化合物3b单晶图；

图6为本发明所合成的化合物的设计思路；

图7为本发明所合成化合物的区域选择性和已知文献的对比图；

图8为本发明化合物化合物3h诱导细胞凋亡作用图；

图8中，用不同浓度(0、5、10、20μm)的化合物3h处理k562细胞24小时。(a)ao-eb双染色法；(b)流式细胞术和annexinv-fitc/pi双染色定量分析凋亡细胞。数据表示为至少三个独立实验中获得的平均值±标准差。与对照组比较，**p<0.01。

图9化合物3h诱导k562细胞g1期周期阻滞图；

图9中，采用流式细胞术分析不同浓度(0、5、10、20μm)化合物3h对k562细胞周期分布的影响。数据表示为至少三个独立实验中获得的平均值±标准差。与对照组比较，**p<0.01。

图10化合物3h处理后k562细胞凋亡相关蛋白的表达作用图；

图10中，westernblot检测不同浓度(0,5,10,20μm)化合物3h对凋亡相关蛋白bax和bcl-2表达的影响。β-肌动蛋白作为对照。

具体实施方式

本发明的实施例：在反应管中依次加入苯甲醛和丙二腈缩合的knoevennagel产物2a(0.8mmol)，白杨素1a(0.5mmol)，ca(oh)2(0.8mmol,59.2mg)和5.0ml甲醇，回流搅拌反应8小时,tlc检测基本反应完全，旋干溶剂上样经柱层析[洗脱剂：v(石油醚)：v(乙酸乙酯)＝3:1]纯化得化合物3a，黄色固体,熔点：>300.0℃；产率90％。

核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.65(s,1h),6.96(s,1h),7.05(s,1h),7.16-7.21(m,5h),7.27-7.30(m,2h),7.55-7.63(m,3h),8.09(d,j＝6.0hz,2h),13.24(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:35.8,57.2,94.9,105.2,106.9,107.4,120.0,126.6,126.8,127.1,128.5,129.1,130.3,144.6,153.7,155.2,157.7,159.5,164.1,182.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h16n2nao4[m+na]⁺:431.1002；found:431.1005.

表1为一种白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物的化学结构

表2为一种白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物的化学结构

化合物3b至3r的制备方法同化合物3a，投料比与化合物3a相同，可得到化合物3b至3r，反应产率见表1和表2，但需强调的是本发明的化合物不限于表1和表2所表示的内容。

本实施例制备化合物3b:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield91％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.68(s,1h),6.94(s,1h),7.03(s,1h),7.10-7.23(m,6h),7.54-7.63(m,3h),8.07-8.09(m,2h),13.25(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:35.6,57.5,95.4,105.7,107.5(d,jcf＝24.2hz),115.7(d,jcf＝21.3hz),120.3,127.1,129.5,129.6,130.8,132.9,141.2,154.0,155.7,158.2,159.9,161.4(d,jcf＝241.4hz),164.6,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15fn2nao4[m+na]⁺:449.0908；found:449.0909.

本实施例制备化合物3c:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield87％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.72(s,1h),6.96-6.99(m,2h),7.02-7.07(m,3h),7.20(brs,2h),7.33-7.39(m,1h),7.55-7.64(m,3h),8.08-8.10(m,2h),13.28(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:36.0,57.2,95.5,105.7,107.1,107.4,114.1(d,jcf＝21.0hz),114.3(d,jcf＝21.2hz),120.2,123.7,127.1,129.6,130.8,130.9,132.9,147.9,154.1,155.8,158.3,160.0,162.6(d,jcf＝242.0hz),164.6,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15fn2nao4[m+na]⁺:449.0908；found:449.0911.

本实施例制备化合物3d:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield82％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.93(s,1h),6.99(s,1h),7.07(s,1h),7.11-7.18(m,5h),7.26-7.28(m,1h),7.58-7.66(m,3h),8.12(d,j＝7.2hz,2h),13.21(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:31.1,56.1,95.2,105.7,106.3,107.3,116.0(d,jcf＝21.0hz),120.2,125.0,127.1,129.5(d,jcf＝23.3hz),130.5,130.8,131.4,132.8,154.4,155.8,158.3,160.0,160.5(d,jcf＝244.2hz),164.6,182.7；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15fn2nao4[m+na]⁺:449.0908；found:449.0911.

本实施例制备化合物3e:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield88％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.52(s,1h),6.19(s,1h),6.67(s,1h),6.89(s,2h),7.06(brs,2h),7.14(s,2h),7.54-7.56(m,3h),8.01-8.03(m,2h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:36.6,57.9,86.3,106.9,109.4,111.6,121.2,126.5,128.0,129.5,129.7,130.7,131.5,131.9,145.5,154.1,158.5,160.9,161.6,168.7,180.0；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15cln2nao4[m+na]⁺:465.0613；found:465.0617.

本实施例制备化合物3f:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield80％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:5.16(s,1h),6.99(s,1h),7.07(s,1h),7.12-7.16(m,3h),7.21-7.27(m,2h),7.38-7.40(m,1h),7.56-7.64(m,3h),8.11(d,j＝6.0hz,2h),13.18(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:30.7,55.6,94.8,105.3,106.1,106.8,119.5,126.7,129.2,129.6,130.4,132.0,141.4,154.0,155.4,157.9,159.4,164.2,182.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15cln2nao4[m+na]⁺:465.0613；found:465.0617.

本实施例制备化合物3g:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield90％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.66(s,1h),6.94(s,1h),7.04(s,1h),7.13-7.20(m,4h),7.49-7.61(m,5h),8.08(d,j＝6.8hz,1h),13.26(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:35.9,57.2,95.4,105.7,107.2,107.4,120.3,127.1,129.6,130.0,130.8,131.8,132.8,144.5,154.1,155.8,158.3,159.9,164.6,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15brn2nao4[m+na]⁺:509.0107；found:509.0113.

本实施例制备化合物3h:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield86％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.53(s,1h),6.19(s,1h),6.66(s,1h),6.93-6.94(m,3h),7.19-7.25(m,3h),7.54-7.56(m,3h),8.01(d,j＝5.6hz,2h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:36.8,57.8,86.2,107.0,109.3,111.8,121.2,121.7,126.5,127.2,129.2,129.5,130.2,131.5,131.9,149.5,154.2,158.6,161.0,161.3,168.9,180.0；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15brn2nao4[m+na]⁺:509.0107；found:509.0103.

本实施例制备化合物3i:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield85％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:5.10(s,1h),6.87(s,1h),6.95(s,1h),6.99-7.15(m,3h),7.22-7.26(m,1h),7.46-7.62(m,4h),8.01-8.07(m,2h),13.09(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,125mhz)δ:36.0,56.5,95.2,105.7,106.8,107.3,119.9,123.1,127.1,128.8,129.2,129.6,130.8,132.9,133.2,143.8,154.4,155.9,158.6,159.8,164.6,182.7；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15brn2nao4[m+na]⁺:509.0107；found:509.0106.

本实施例制备化合物3j:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield78％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.92(s,1h),7.00(s,1h),7.05(s,1h),7.29(s,2h),7.55-7.68(m,5h),8.01(s,1h),8.08(d,j＝6.0hz,3h),13.30(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:36.1,56.7,95.6,105.8,113.6,122.1,122.5,126.4,127.1,128.8,129.6,130.6,132.9,134.6,147.2,148.3,154.0,156.0,158.3,160.1,164.7,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc25h15n3nao6[m+na]⁺:476.0853；found:476.0854.

本实施例制备化合物3k:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield87％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.23(s,3h),4.60(s,1h),6.95(s,1h),7.03-7.12(m,7h),7.55-7.63(m,3h),8.09(d,j＝6.0hz,2h),13.23(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:20.6,35.5,57.3,94.9,105.2,106.9,107.6,120.0,126.6,127.0,129.0,129.1,130.4,135.9,141.7,153.7,155.2,157.7,159.4,164.1,182.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc26h18n2nao4[m+na]⁺:445.1159；found:445.1162.

本实施例制备化合物3l:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield85％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.63(s,1h),6.95(s,1h),7.04(s,1h),7.09-7.11(m,4h),7.31(d,j＝7.2hz,2h),7.54-7.61(m,3h),8.08(d,j＝7.2hz,2h),13.23(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:31.6,34.6,35.8,57.8,95.4,105.7,107.4,108.2,120.5,125.7,127.1,127.2,129.6,130.8,132.8,142.1,149.5,154.3,155.6,158.1,160.1,164.6,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc29h24n2nao4[m+na]⁺:487.1628；found:487.1627.

本实施例制备化合物3m:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield84％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.59(s,3h),4.54(s,1h),6.17(s,1h),6.58-6.68(m,3h),6.81(s,2h),7.12(s,2h),7.52-7.59(m,3h),8.01-8.03(m,2h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:36.1,55.3,58.7,86.2,106.9,110.5,111.6,113.6,121.4,126.4,128.8,129.5,131.5,131.9,138.8,154.3,157.9,158.3,161.0,161.3,168.9,180.1；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc26h18n2nao5[m+na]⁺:461.1108；found:461.1107.

本实施例制备化合物3n:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield81％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.71(s,3h),4.91(s,1h),6.82-7.02(m,7h),7.17-7.21(m,1h),7.52-7.62(m,3h),8.03-8.11(m,2h),13.09(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:31.9,56.1,56.6,94.9,105.7,107.2,107.5,112.3,120.6,120.9,127.1,128.5,129.4,129.6,130.9,132.6,132.8,155.1,155.6,157.4,158.0,160.4,164.5,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc26h18n2nao5[m+na]⁺:461.1108；found:461.1108.

本实施例制备化合物3o:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield79％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.64(s,3h),3.78(s,3h),4.89(s,1h),6.64(d,j＝7.2hz,1h),6.89-7.04(m,5h),7.57-7.64(m,3h),8.11(d,j＝7.2hz,2h),13.14(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:31.2,32.0,56.0,60.4,95.1,105.7,107.1,107.9,111.9,121.6,124.0,127.1,129.6,130.9,132.9,137.7,146.8,152.8,154.7,155.8,158.2,159.7,164.6,182.7；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc27h20n2nao6[m+na]⁺:491.1214；found:491.1211.

本实施例制备化合物3p:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield80％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.19(s,3h),2.43(s,3h),4.86(s,1h),6.73(d,j＝7.6hz,1h),6.87-6.99(m,6h),7.55-7.64(m,3h),8.07(d,j＝7.2hz,2h),13.12(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:19.4,21.0,31.1,58.0,95.2,105.7,107.3,108.5,120.4,127.1,127.6,128.4,129.6,130.9,131.1,132.8,135.0,135.8,141.0,154.3,155.6,158.2,159.5,164.6,182.8；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc27h20n2nao4[m+na]⁺:459.1315；found:459.1321.

本实施例制备化合物3q:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield77％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.25(s,3h),4.02(s,3h),4.65(s,1h),7.05-7.11(m,5h),7.22(s,2h),7.59-7.65(m,3h),8.07-8.09(m,2h),12.85(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:21.1,36.1,57.8,62.7,105.7,107.0,108.3,120.4,126.9,127.5,128.2,129.5,129.8,131.0,136.4,142.1,147.9,148.3,152.6,159.9,164.4,183.0；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc27h20n2nao5[m+na]⁺:475.1264；found:475.1267.

本实施例制备化合物3r:黄色固体,熔点：>300.0℃；yield79％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.86(s,3h),3.91(s,3h),4.64(s,1h),6.69-6.71(m,2h),6.82(s,1h),6.88(s,1h),7.09-7.22(m,6h),7.91(d,j＝9.6hz,1h),13.37(brs,1h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:35.6,56.1,56.6,57.5,95.1,99.3,106.8,106.9,107.2,108.2,111.6,115.6(d,jcf＝21.2hz),129.5,129.6,130.9,141.4,153.8,155.6,158.1,159.9,160.4,161.8(d,jcf＝241.4hz),164.2,182.6；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc27h19fn2nao6[m+na]⁺:509.1119；found:509.1121.

本发明的式(1)化合物具有重要的生物活性，体外对人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)的细胞毒性试验表明：此类式(1)所示结构的白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物对肿瘤细胞生长具有抑制作用，有可能发展成为新的防治肿瘤药物。但需强调的是本发明的化合物不限于人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)表示的细胞毒性。

药理实施例1：化合物3a-3p和3r对人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)的细胞毒性

人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)分别用rpmi-1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100u/ml的青霉素和100u/ml链霉素。细胞以每孔5000个细胞的浓度加入到96孔中，在37℃含5％co2潮湿空气的培养箱中培养24小时。

细胞存活率的测定用改良mtt法。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的化合物3a-3p和3r的二甲基亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最终浓度分别为5μmol/l,10μmol/l,20μmol/l,40μmol/l和80μmol/l。48小时后，每孔加入10μlmtt(5mg/ml)的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的mtt，每孔中加入150μl二甲基亚砜。以溶解还原的mtt晶体甲臜(formazan)，用酶标仪在490nm波长测定od值。结果如下表3所示。

表3

^aic50:theconcentrationwhichresultsin50％oftumourcellproliferationinhibitionafter48hofcompoundstreatment.datawererepresentedobtainedinatleastthreeindependentexperiments

^bparentcompoundchrysinusedasapositivecontrol.

^cddp(cisplatin)usedasthereferencedrug.

药理实施例2：ao-eb染色法

将指数生长的k562细胞(5×105细胞/孔)接种于6孔板(巢穴生物技术，中国)中孵育12h，每孔加入不同浓度的化合物3h，与细胞共培养24h，取细胞，冰冷pbs洗涤，50μl新鲜制备的ao-eb染色液(pbs中含有100μg/mlao和100μg/mleb)室温黑暗中染色10min。最后，在荧光显微镜下观察染色细胞(莱卡公司，德国)。

用ao-eb双染法研究化合物3h诱导k562细胞凋亡。用ao-eb染色的细胞在荧光显微镜下观察，结果如图8a所示，正常组呈均匀的绿色荧光，而随着化合物3h浓度的增加，处理组的绿色细胞逐渐减少，相应的橙色荧光逐渐增强。提示化合物3h可诱导k562细胞凋亡。

药理实施例3：细胞凋亡的流式细胞术分析

将指数生长的k562细胞(5×105细胞/孔)接种于6孔培养板中，孵育12h，每孔加入不同浓度的化合物3h，与细胞共培养24h，取细胞，冰冷pbs洗涤。最后，根据细胞凋亡检测试剂盒(cowinbiosciences，china)的说明书，加入annexinv-fitc和pi。培养15min后，用流式细胞仪(bdbioscience，usa)对样品进行分析。

探讨了k562细胞凋亡的程度。将不同浓度的化合物3h与k562细胞孵育24小时，采用annexin-v-fitc/pi双染流式细胞术检测细胞凋亡。如图8b所示，随着化合物3h浓度的增加，k562细胞的凋亡率逐渐增加，尤其是在高浓度时。因此，这些数据提示化合物3h以浓度依赖的方式诱导k562细胞凋亡。

药理实施例4：细胞周期的流式细胞术分析

将5×105对数期细胞接种于6孔培养板中，培养12h，每孔加入不同浓度的化合物3h，与细胞共培养24h，采集细胞，冰冷pbs洗涤。随后，加入70％冰冷乙醇，将细胞固定在4℃过夜。用冷冻pbs洗涤后，用500μlpi/rnase染色缓冲液(keygenbiotech，usa)在黑暗中室温染色30min，流式细胞仪分析。

评价化合物3h对k562细胞周期的影响。用不同浓度的化合物3h处理24小时后，取细胞进行流式细胞仪分析。如图9所示，化合物3h对k562细胞周期的重分布有显著影响。与对照组相比，当浓度为5μm时，g1期细胞的分布明显增加，s期细胞的分布明显减少。结果表明，g1期阻滞发生在细胞内，化合物3h通过促进癌细胞凋亡dna的形成而诱导k562细胞凋亡。

药理实施例5：western印迹分析

将不同浓度的化合物3h与k562细胞共培养24小时后，收集细胞，冰冷pbs洗涤。此后，将收集的细胞在100μl含pmsf的溶出缓冲液中在冰上溶解15分钟。将细胞溶出物在12000×g下离心15分钟，并使用bca蛋白质测定试剂盒(均来自中国贝约亭)测定总蛋白浓度。样品在100℃下用5×加载缓冲液煮沸5分钟，然后用于后续实验或在-80℃下长期保存。接下来，在8-12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(sds-page)上分离等量蛋白质(20微克)，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(微孔，美国)。将膜在含5％脱脂乳的tbst(tris缓冲盐水tween20)中室温封闭1h，然后在4℃下与适当的一级抗体孵育过夜。用tbst洗涤三次后，在室温下与抗兔二级抗体孵育1h。洗涤后，用claritytm-western-ecl底物观察免疫印迹，并用chemidoctm-touch成像系统(均来自美国bio-rad)成像。所用抗体为抗bcl-2(#3498，细胞信号，美国)、bax(#2772，细胞信号，美国)、β-肌动蛋白(#4970，细胞信号，美国)、hrp-连接的抗兔igg(#7074，细胞信号，美国)。

通过westernblot分析检测了bcl-2家族成员中抗凋亡关键蛋白bcl-2和促凋亡效应蛋白bax的表达水平。如图10所示，化合物3h处理显著下调bcl-2，并以剂量依赖性方式上调bax蛋白的表达，从而能够促进细胞色素c和其他促凋亡因子从线粒体a36的释放。结果表明，化合物3h可能通过内源性凋亡途径诱导k562细胞凋亡。

注:实验数据表示为至少三个独立实验中获得的平均值±标准偏差。采用spss19.0统计软件进行单因素方差分析，用lsd进行组间比较，进行显著性检验。p<0.05和p<0.01分别被认为是显著和极显著的。

实验结论：本专利对新合成的化合物进行了体外抗癌活性评价，部分化合物对k562、pc-3、a549和nci-h1299的抗增殖活性均强于母体化合物chrysin，且与顺铂的对照药物相比具有等电位作用。尤其是化合物3h对k562细胞的细胞毒性最高(ic50＝6.41μm)。此外，化合物3h以浓度依赖的方式诱导k562细胞凋亡。机制研究表明，化合物3h可诱导细胞凋亡，其机制可能与线粒体介导的caspase激活有关。结果表明，复合3h处理可增加bax，降低bcl-2蛋白水平，从而增加bax/bcl-2比值，释放细胞色素c，激活caspase，引起细胞凋亡。因此，我们的结果提供了体外证据，化合物3h可能是一个潜在的候选开发新的抗肿瘤药物。

因此,本实验表明此类式(1)所示的白杨素拼接2-氨基3-氰基吡喃类化合物对人白血病细胞(k562)、人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)细胞具有较强的细胞毒性，和肿瘤治疗一线用药顺铂同一数量级或活性比顺铂更好，有可能发展成新的具有抗肿瘤作用的药物。