一种对神户肠杆菌种水平的快速检测方法与流程

本发明涉及对阴沟肠杆菌复合群样品中神户肠杆菌的检测方法。

背景技术：

阴沟肠杆菌复合群（enterobactercloacaecomplex，ecc）是一类重要的医院致病性肠杆菌，能够引起65%-75%的感染，主要可引起伤口、尿道、下呼吸道、皮肤及软组织等的感染。其分布范围广，即使在陆地和水环境中，ecc也普遍存在。ecc主要包括阿氏肠杆菌(enterobacterasburiae,ea)、霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei,eh)、神户肠杆菌(enterobacterkobei,ek)、路德维希肠杆菌(enterobacterludwigi,er)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae,ec)五大类，多位点序列分型在全球18个类群（cluster（a-r））中已经鉴定出超过1069个序列（sequencetype,st）型。到目前为止ecc的分类地位还处在不断更新变化中，导致对阴沟肠杆菌的研究只能停留在复合群的水平，这妨碍了我们对其在物种层次上的临床意义、流行病学和耐药性特征的理解。

飞行质谱（maldi-tof）是一类使裂解的菌株在高离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，通过与大肠杆菌质控质谱图比对，参照数据库中样本质谱图，得到鉴定菌株菌种的鉴定方法。由于其鉴定速度快，鉴定效率高，通常被用在医院检验科鉴定菌种。但由于ecc各菌种之间亲缘关系相近，利用质谱仪鉴定ecc菌种，通常只能将ecc鉴定到复合群水平，无法确切区分ecc各菌种，这就导致医护人员对病人临床诊断、用药造成干扰。

由于质谱仪对ecc鉴定方法的不完善，科研人员目前通常采用ecc中的一个管家基因hsp60（引物序列对应seqidno:3-seqidno:4）对菌株进行pcr扩增、测序，鉴定ecc菌种。目前，hsp60基因分型是最广泛用于鉴别ecc种的方法。hsp60分型将ecc分为12个基因簇（i–xii）和一个不稳定序列簇（xiii），其中一些已经命名的遗传基因簇已重新分类到阴沟肠杆菌的其他种或者亚种。根据这种分型方法，神户肠杆菌被认为是临床和环境中的主要物种。但由于hsp60分型鉴定神户肠杆菌的方法耗时长、费用高、效率低，因此，在临床工作和科研实验中，急需一种快速准确直接鉴定到神户肠杆菌种水平的分类方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于鉴定神户肠杆菌种水平的多重聚合酶链式反应（pcr）方案。该方案包括：特异性引物、pcr反应体系，其主要特征在于根据神户肠杆菌特有基因设计一对特异性引物：

神户肠杆菌特有基因序列中所选取核酸序列

本发明所述的神户肠杆菌特有基因，搜索比对自ncbi数据库。

本发明所述的特异性引物序列对应seqidno:1-seqidno:2。

本发明所述的pcr扩增特异性片段方法，包括核酸提取、pcr扩增及电泳检测。

本发明进一步公开了对临床ecc菌株中神户肠杆菌鉴定方面的应用。所应用的特异性引物为seqidno:1-seqidno:2所示的引物序列，先对实验室已经进行全基因组测序的六个阴沟肠杆菌种样本（样本信息见表1）进行pcr扩增，验证特异性引物的正确性，在特异性引物正确的基础上，再对185株ecc临床菌株分别进行hsp60引物pcr扩增测序与特异性引物pcr扩增。hsp60引物测序与特异性引物扩增结果进行比对，实验结果显示本发明可以在ecc样品中准确特异地鉴定神户肠杆菌。本发明提供的一种检测临床ecc菌株中神户肠杆菌的pcr体系，该体系包括：premixextaq^tm（takara），10μm正向和反向引物，1μldna和ddh2o。

由上述的技术方案可见，本发明首次将阴沟肠杆菌复合群全基因组序列收集整合比对，筛选神户肠杆菌特有基因，根据特有基因设计特异性引物的技术引入ecc中的神户肠杆菌鉴定领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高的鉴定分类方法，由于操作简便，准确性高，耗时短、费用低，在医学检验及科研研究领域具有重要的应用价值。

本发明主要解决了质谱仪对阴沟肠杆菌复合群分类地位不明确、管家基因对阴沟肠杆菌复合群测序复杂耗时，且两种方法花费高的问题，重点考察了特异性引物对神户肠杆菌的测序准确度与特异度，主要的难点在于特异性引物的设计与后续引物的检测。

附图说明

图1特异性引物与hsp60基因引物pcr扩增六个不同阴沟肠杆菌种凝胶电泳图；

图2hsp60扩增49株阴沟肠杆菌复合群菌株系统发育进化树；

本发明所用到的阴沟肠杆菌菌株来源：我国一家三甲医院2000至2005年保种的部分阴沟肠杆菌（已重新梅里埃质谱仪鉴定），具体菌株分类地位见图2；

图3hsp60扩增27株阴沟肠杆菌复合群菌株系统发育进化树；

本发明所用到的阴沟肠杆菌菌株来源：我国一家三甲医院2006至2011年保种的部分阴沟肠杆菌（已重新梅里埃质谱仪鉴定），具体菌株分类地位见图3；

图4hsp60扩增46株阴沟肠杆菌复合群菌株系统发育进化树；

本发明所用到的阴沟肠杆菌菌株来源：我国一家三甲医院2012至2017年保种的部分阴沟肠杆菌（已重新梅里埃质谱仪鉴定），具体菌株分类地位见图4。

图5hsp60扩增63株阴沟肠杆菌复合群菌株系统发育进化树；

本发明所用到的阴沟肠杆菌菌株来源：我国一家三甲医院2018年度保种的部分阴沟肠杆菌（已重新梅里埃质谱仪鉴定），具体菌株分类地位见图5。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

表1已测全基因组六个种

实施例1

特异性引物设计

1、神户肠杆菌特有基因的获取

利用ncbi数据库下载阴沟肠杆菌复合群菌株全基因组序列，寻找神户肠杆菌特有基因。

2、特异性引物的设计

特异性引物是整个发明技术的核心部分，通过ncbi数据库比对筛选出神户肠杆菌特有基因，以特有基因为模板设计引物。使用primerpremier5.0设计引物，原则上引物的gc％含量在40-60％之间，避免发夹结构、自身二聚体和交叉二聚体的形成。设定好引物的长度、引物类型、碱基数目等参数后运行软件，从输出结果中找出tm值=55.6℃/52.5℃、碱基数在20bp左右、引物间无二聚体、内部无二级结构的序列，并且最终保证所有引物pcr扩增出来的目的片段在1403bp。通过使用blast搜索将它们的序列与genbank中的所有ecc序列进行比较来验证引物的特异性。最终得到的引物由上海生工合成，引物序列如表2所示：

表2鉴定所用到的引物

实施例2

阴沟肠杆菌基因组dna提取

1、准备过夜培养的菌体；

2、吸取500ul过夜培养菌体于1.5mlep管，置于冰上；

3、13000-16000×g离心5秒，倒掉上清液；

4、ep管中加300ul细胞裂解液，混匀，80℃孵育5分钟；

5、加1.5ulrna酶，上下翻转25次混匀，37℃孵育15-60分钟；

6、迅速转移至冰上冷却1分钟；

7、加100ul蛋白沉淀液，大力涡旋20秒；

8、13000-16000×g离心3分钟；

9、取300ul异丙醇加入干净的1.5mlep管，并加入上一步的上清液；

10、轻轻上下颠倒混匀50次；

11、13000-16000×g离心1分钟；

12、小心倒掉上清液，倒在一张干净的吸水纸上沥干，注意勿将dna沉淀倒出；

13、加300ul70%乙醇清洗dna，13000-16000×g离心1分钟；

14、小心倒掉上清液，用一张干净的吸水纸吸干ep管的液体，注意不要吸到dna沉淀，室温晾干5分钟；

15、加100uldna溶解液中速涡旋5秒溶解dna；

16、65℃孵育1小时；

17、室温下轻轻摇匀过夜，样品可以简单地离心并转移到存储管中。

实施例3

特异性引物对已测全基因组六个阴沟肠杆菌种样本pcr扩增

以qiagen试剂盒提取的六个阴沟肠杆菌种样本作为pcr反应的模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况

实施例4

特异性引物对49株阴沟肠杆菌pcr扩增

以2000-2005年的49株阴沟肠杆菌种样本作为pcr反应模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况

实施例5

特异性引物对27株阴沟肠杆菌pcr扩增

以2006-2011年的27株阴沟肠杆菌种样本作为pcr反应模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况

实施例6

特异性引物对46株阴沟肠杆菌pcr扩增

以2012-2017年的46株阴沟肠杆菌种样本作为pcr反应模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况

实施例7

特异性引物对63株阴沟肠杆菌pcr扩增

以2018年的63株阴沟肠杆菌种样本作为pcr反应模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况

实施例8

hsp60引物对阴沟肠杆菌复合群样本扩增测序

以回收的185株阴沟肠杆菌复合群上清液作为pcr反应模板，pcr反应体系及反应条件：

pcr反应体系（50ul）：

pcr反应条件：

反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况，扩增结果送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

实施例9

hsp60基因测序结果建立菌株系统发育进化树

ncbi下载ecc复合群每个聚类的标准菌株序列与hsp60引物扩增的185株阴沟肠杆菌pcr产物序列，利用mega建立系统发育进化树，根据进化树信息，确定菌株分类地位。系统发育进化树结果见图2、图3、图4、图5（特异性引物扩增结果已标红）。

实施例10

特异性引物特异性灵敏度计算

将185株阴沟肠杆菌复合群菌株特异性引物测序结果与hsp60引物测序结果进行比对。（+：结果为阳性；-，结果为阴性）

根据hsp60管家基因pcr扩增结果构建系统发育进化树，共鉴定到神户肠杆菌（clusterⅱ）26株。特异性引物seqidno:1-seqidno:2扩增pcr测序结果与hsp60引物测序结果比对，按照诊断试验灵敏度与特异度指标，计算特异性引物seqidno:1-seqidno:2的引物灵敏度与特异度。诊断指标如下：

灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%

特异度=真阴性/（假阳性+真阴性）×100%

本实验测序结果如下：

根据系统发育进化树结果，计算特异性引物的灵敏度和特异度均在90%以上，其中灵敏度为92.31%，特异度为96.23%。

本发明与已有鉴定方法比较：

相比于hsp60基因鉴定和飞行质谱仪器鉴定菌株分类地位，本发明具有检测时间适中、鉴定菌株明确、鉴定效率高、经济消耗少等诸多优点，且本发明测试灵敏度、特异度都很高，测序结果高度可信，使用此引物鉴定神户肠杆菌可大大增加阴沟肠杆菌复合群的鉴定效率，为科研医务人员提供一项高效准确的鉴定选择。

sequencelisting

<110>深圳市人民医院

<120>一种对神户肠杆菌种水平的快速检测方法

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