一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]-L-瓜氨酸的方法与流程

文档序号:21452648发布日期:2020-07-10 17:46阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌中,在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶,所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌sumhs-2020.01,分类命名为corynebacteriumglutamicum,该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏中心的保藏编号为cgmccno.19404。

2.根据权利要求1所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌由以下方法构建:

(1)将cipa基因序列在dna5’端引入hindiii位点,3’端引入sali位点,得到基因序列为seqidno.1的片段,合成的片段经过测序后,用hindiii/sali双酶切目标基因和表达载体pxmj19,酶切产物经过凝胶回收后,将目标片段和载体进行连接,连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞,获得阳性转化子表达载体pxmj19-cipa;

(2)将精氨酸脱亚胺酶arc基因序列在dna5’端引入xhoi位点,3’端引入saci位点,得到基因序列为seqidno.2的片段,合成的片段经过测序后,用xhoi/saci双酶切目标基因和表达载体pxmj19-cipa,酶切产物经过凝胶回收后,将目标片段和载体进行连接,连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞,获得阳性转化子pxmj19-cipa-arc,即为含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。

3.一种cipa-arc融合蛋白,其特征在于,精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipa上,产生具有催化活性的包涵体蛋白cipa-arc即cipa-arc融合蛋白,所述cipa-arc融合蛋白的制备包括以下步骤:

(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞;

(2)采用权利要求1所述的重组质粒阳性转化子pxmj19-cipa-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞,得到重组菌;

(3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞,经超声破碎、离心后,所得的沉淀即为cipa-arc融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的cipa-arc融合蛋白,其特征在于,所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞采用如下制备方法:

将谷氨酸棒杆菌atcc13032在含lbg固体培养基中培养后,挑取新鲜菌株接种于lbg液体培养基中,经培养后按0.8-1.5%的接种量将活化菌液转接至lbg培养基中,继续培养至od600为0.8-1.0;将菌液经冰水混合物预冷、离心,吸出上清液后加入甘油,吹吸至菌体悬浮,再次经离心、吸出上清液后加入甘油,吹吸至菌体悬浮,即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。

5.根据权利要求4所述的cipa-arc融合蛋白,其特征在于,所述重组质粒pxmj19-cipa-arc电击转化感受态细胞采用如下制备方法:

取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pxmj19-cipa-arc混匀,冰上冷却后,在相同温度条件下,以电击条件为电压1-5kv,电击1-10ms;再在室温下加入lbg液体培养基,转移到离心管中,经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板,挑选单菌落提取质粒,再通过双酶切、pcr确认目的片段的插入,得到的重组菌接种。

6.根据权利要求5所述的cipa-arc融合蛋白,其特征在于,所述电击的电压为2.5kv;所述电击的时间为5ms。

7.根据权利要求5或6所述的cipa-arc融合蛋白,其特征在于,所述基因工程菌的诱导表达方法如下:

将重组菌接种于含氯霉素的lbg培养基中,经摇床培养至菌体od600值达到0.8-1.0时加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷,经诱导过夜后离心收集得到重组菌体全细胞,用tris-hcl缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液,超声破碎细胞后再次离心,沉淀即为获得的cipa-arc融合蛋白。

8.一种权利要求1或2所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌,或权利要求3-7任一项所述的cipa-arc融合蛋白用于转化[14/15n]-l-精氨酸生产[14/15n]-l-瓜氨酸上的新用途。

9.一种酶催化[14/15n]-l-瓜氨酸的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

取权利要求3-7任一项所述的cipa-arc融合蛋白投入转化液中进行反应;

所述反应的条件:所述的转化液中包含[14/15n]-l-精氨酸和缓冲溶液,转化温度为25-50℃,ph为5.0-8.0,转化时间2-8h。

10.根据权利要求9所述的酶催化[14/15n]-l-瓜氨酸的制备方法,其特征在于,所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液,所述转化温度为37℃;所述ph为6.5;所述转化时间为5h。


技术总结
本申请公开了一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]‑L‑瓜氨酸的方法,所述基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。本申请还公开了一种由cipA‑arc表达的融合蛋白及其制备方法。本申请公开的含cipA‑精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌和由cipA‑arc表达的cipA‑arc融合蛋白均可用于转化[14/15N]‑L‑精氨酸生产[14/15N]‑L‑瓜氨酸。本申请还提供了一种[14/15N]‑L‑瓜氨酸的酶催化制备新方法。该方法产物后处理简单,操作方便,易于放大生产,酶蛋白可重复利用,生产成本低。

技术研发人员:黄钢;李斌;李玥
受保护的技术使用者:上海健康医学院
技术研发日:2020.04.23
技术公布日:2020.07.10
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