检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，属于2019新型冠状病毒的检测领域；更具体地，能够检测2019新型冠状病毒的两个碱基突变（8782c→t和28144t→c）。

背景技术：

2019新型冠状病毒（sars-cov-2）是引发新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎，covid-19）的病原体。该病毒在2019年下半年开始流行并迅速蔓延，世界卫生组织于2020年3月11日宣布全球大流行。截至2020年4月1日，全球累计确诊新冠肺炎病例已超过80万例，且有进一步恶化趋势。

新冠肺炎常见体征有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等呼吸道症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，进一步导致死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状可以对症进行辅助护理和支持性治疗。

xiaolutang等人通过病毒全基因分析，发现在第8782位碱基和第28144位碱基存在连锁现象（101/103，98%）。例如，根据这两个碱基的类型，新冠病毒存在两种单倍型：l型（c8782和t28144）和s型（t8782和c28144）。其中l型和s型的命名来自于28144位碱基变化后编码的不同氨基酸，其中l型的t28144所在密码子编码亮氨酸（leucine），s型的c28144所在密码子编码丝氨酸（serine）。

通过数据对比分析，l型和s型在重症率和传染能力上存在差异。这为细化新冠肺炎诊断提供了依据，意味着临床上可通过基因分型检测，确定患者体内病毒的型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此制定更具针对性的治疗方案。

因此，检测识别2019新型冠状病毒这两个位点的碱基，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。但目前尚未有相应检测试剂。

本领域需要一种能够将2019新型冠状病毒8782和28144两个位点的碱基进行检测并识别的相关产品。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：

第一核酸组合物：

8782c型正向引物：5’-gctgattttgacacatggttcatc-3’（seqidno:1）；

28144t型正向引物：5’-atcggtaattatacagtttccagatt-3’（seqidno:2）；和

第二核酸组合物：

8782t型正向引物：5’-gctgattttgacacatggtatcgt-3’（seqidno:3）；

28144c型正向引物：5’-atcggtaattatacagtttcctttgc-3’（seqidno:4）；

其中，所述每个核酸组合物中还包括：

8782反向引物：5’-ccattagttgtgcgtaatatcgt-3’（seqidno:5）；

8782探针：5’-cttgcccattgattgctgcagtcataa-3’（seqidno:6）；

28144反向引物：5’-caacacgaacgtcatgatactcta-3’（seqidno:7）；

28144探针：5’-attgccaggaacctaaattgggtagt-3’（seqidno:8）。

使用该组合物，可以分辨2019新型冠状病毒的8782位为c型或t型，并且可以分辨28144为t或c型）。通过检测两处碱基类型，可以例如区分新冠病毒的s型和l型，为细化新冠肺炎诊断提供了依据，确定患者病毒型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此更新并改进治疗方案，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。

使用本发明的组合物，引物检测扩增特异性靶标的ct值小，扩增效率高；引物检测特异性模板的ct值和非特异性模板的ct值差值大，特异性好。而使用本发明的组合物的对比例，引物检测扩增特异性靶标的ct值大于本发明组合物，其扩增效率较低，同时，特异性模板的ct值和非特异性模板的ct值差值也较本发明组合物小，其特异性也相对较差。

本发明的组合物可用于荧光定量pcr检测。

进一步地，所述组合物中，8782探针与28144探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。

在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光报告基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

在本发明中，荧光报告基团可以选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe，但不限于此。

在一个具体的实施方案中，如seqidno:6所示的8782探针的荧光报告基团为hex；如seqidno:8所示的28144探针的荧光报告基团为fam。

进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。

进一步地，所述组合物中引物的用量为25~800nm；所述组合物中探针的用量为10~500nm。

在一个具体的实施方案中，本发明组合的两种核酸组合物分别存在于单独包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg²⁺中的至少一种。

常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、tritonx-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20-200µl。

在一个具体的实施方案中，本发明第一核酸组合物的具体成分如下所示：

在一个具体的实施方案中，本发明第二核酸组合物的具体成分如下所示：

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、逆转录酶以及dna聚合酶中的至少一种。

进一步地，所述组合物中检测引物的25~800nm；所述组合物中探针的用量为10~500nm。

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5u/μl~15u/μl，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶（mmlv）或者tth酶；所述dna聚合酶的浓度为3u/μl~15u/μl，例如dna聚合酶可以是taq酶。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照。所述阳性对照含有2019新型冠状病毒基因组第8782位附近的序列以及第28144位附近的序列，并且其中，第8782位为c或t，且第28144位为c或t。例如，第8782位为c且第28144位为t，8782位为t且第28144位为c，第8782位为c且第28144位为c，第8782位为t且第28144位为t。

在本文中，术语“第8782位”和“第28144位”是指genebank登录号为：nc_045512.2的新型冠状病毒基因组序列的第8782位和28144位碱基。

在本发明中，术语“第8782位附近的序列”和“第28144位附近的序列”是指包含8782或28144位点，并包括其上下游各100~300bp碱基的序列。

进一步地，将这两个位点附近的序列进行组合，就能得到阳性对照的突变插入序列。例如，所述的2019新型冠状病毒c8782和t28144突变插入序列（seqidno:9）为：

ttaattaaagttacacttgtgttcctttttgttgctgctattttctatttaataacacctgttcatgtcatgtctaaacatactgacttttcaagtgaaatcataggatacaaggctattgatggtggtgtcactcgtgacatagcatctacagatacttgttttgctaacaaacatgctgattttgacacatggtttagccagcgtggtggtagttatactaatgacaaagcttgcccattgattgctgcagtcataacaagagaagtgggttttgtcgtgcctggtttgcctggcacgatattacgcacaactaatggtgactttttgcatttcttacctagagtttttagtgcagttggtaacatctgttacacaccatcaaaacttatagagtacaccaagaatgtagtttacagtcatgtactcaacatcaaccatatgtagttgatgacccgtgtcctattcacttctattctaaatggtatattagagtaggagctagaaaatcagcacctttaattgaattgtgcgtggatgaggctggttctaaatcacccattcagtacatcgatatcggtaattatacagtttcctgtttaccttttacaattaattgccaggaacctaaattgggtagtcttgtagtgcgttgttcgttctatgaagactttttagagtatcatgacgttcgtgttgttttagatttcatctaaacgaacaaactaaaatgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaa

所述2019新型冠状病毒t8782和c28144突变插入序列（seqidno:10）为：

ttaattaaagttacacttgtgttcctttttgttgctgctattttctatttaataacacctgttcatgtcatgtctaaacatactgacttttcaagtgaaatcataggatacaaggctattgatggtggtgtcactcgtgacatagcatctacagatacttgttttgctaacaaacatgctgattttgacacatggtttagtcagcgtggtggtagttatactaatgacaaagcttgcccattgattgctgcagtcataacaagagaagtgggttttgtcgtgcctggtttgcctggcacgatattacgcacaactaatggtgactttttgcatttcttacctagagtttttagtgcagttggtaacatctgttacacaccatcaaaacttatagagtacaccaagaatgtagtttacagtcatgtactcaacatcaaccatatgtagttgatgacccgtgtcctattcacttctattctaaatggtatattagagtaggagctagaaaatcagcacctttaattgaattgtgcgtggatgaggctggttctaaatcacccattcagtacatcgatatcggtaattatacagtttcctgttcaccttttacaattaattgccaggaacctaaattgggtagtcttgtagtgcgttgttcgttctatgaagactttttagagtatcatgacgttcgtgttgttttagatttcatctaaacgaacaaactaaaatgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaa。

所述阳性对照通过使用慢病毒数字pcr定量检测体系，对两种慢病毒样本进行拷贝数定量。分别将两种定量后的假病毒，使用生理盐水稀释至1.0e+06拷贝/ml而制备。所述假病毒以慢病毒为载体，插入两段新型冠状病毒基因组序列（8582-8982，27944-28344）。两段序列的中间位置分别设计为2019新型冠状病毒t8782和c28144突变和2019新型冠状病毒c8782和t28144突变的对应的碱基。

第四方面，提供了一种用于检测2019新型冠状病毒突变的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr；

3）获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间1~10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，40~50次循环。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测2019新型冠状病毒突变的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr；

3）获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间1~10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，40~50次循环。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染2019新型冠状病毒并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中检测培养物中是否有2019新型冠状病毒以及病毒的突变类型。

附图说明

图1：第一组合物检测临床核酸样本扩增结果；

图2：第二组合物检测临床核酸样本扩增结果；

图3：第一组合物检测2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（1.0e+08拷贝/ml）结果；

图4：第一组合物检测2019新型冠状病毒t8782和c28144突变2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（1.0e+08拷贝/ml）结果；

图5：第二组合物检测2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（1.0e+08拷贝/ml）结果；

图6：第二组合物检测2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（1.0e+08拷贝/ml）结果；

图7：第一组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒c8782和t28144突变，fam通道检测结果；

图8：第一组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒c8782和t28144突变，hex通道检测结果；

图9：第二组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板，fam通道检测结果；

图10：第二组合物检测梯度浓度2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板，hex通道检测结果；

图11：不同设计的8782c型引物扩增2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（虚线）的结果，图11a-f分别为本发明引物，和对比例引物8782c1~5的结果；

图12：不同设计的8782t型引物扩增2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（虚线）的结果，图12a-f分别为本发明引物，和对比例引物8782t1~5的结果；

图13：不同设计的28144t型引物扩增2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（虚线）的结果，图13a-f分别为本发明引物，和对比例引物28144t1~5的结果；

图14：不同设计的28144c型引物扩增2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板（实线）和2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板（虚线）的结果，图14a-f分别为本发明引物，和对比例引物28144c1~5的结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明所使用的引物及探针如下所示：

8782c型正向引物：5’-gctgattttgacacatggttcatc-3’（seqidno:1）；

28144t型正向引物：5’-atcggtaattatacagtttccagatt-3’（seqidno:2）；

8782t型正向引物：5’-gctgattttgacacatggtatcgt-3’（seqidno:3）；

28144c型正向引物：5’-atcggtaattatacagtttcctttgc-3’（seqidno:4）；

8782反向引物：5’-ccattagttgtgcgtaatatcgt-3’（seqidno:5）；

8782探针：5’-cttgcccattgattgctgcagtcataa-3’（seqidno:6）；

28144反向引物：5’-caacacgaacgtcatgatactcta-3’（seqidno:7）；

28144探针：5’-attgccaggaacctaaattgggtagt-3’（seqidno:8）。

其中，8782探针的荧光报告基团为hex，28144探针的荧光报告基团为fam，探针的3’末端还具有bhq1或bhq2淬灭基团。

实施例2、检测2019新型冠状病毒突变的方法

本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。进行如下操作：

（1）使用圣湘生物核酸释放剂s1014，与阳性对照1：1混合，常温裂解10分钟；

（2）按每种反应液26μl和混合酶4μl的比例，取相应量的反应液和混合酶混匀，以每反应30μl的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入待检测的裂解后样本20μl，然后盖上pcr管盖，瞬时离心后放置于实时荧光pcr仪器中；

（3）按以下循环条件进行反应和检测（荧光采集选取fam通道和hex通道）：

结果分析：

1）目的检测信号为fam，hex；

2）baseline的设置：baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（end）比最早出现指数扩增的样本ct减少1-2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；

3）如果两个组合物中，各通道均无扩增信号，则为样本浓度低于检测下限；

如果在两个组合物中，有且只有一个组合物存在扩增信号：

其中第一组合物fam和hex均有扩增曲线，且ct＜40，表示为2019新型冠状病毒c8782和t28144突变；

其中第二组合物fam和hex均有扩增曲线，且ct＜40，表示为2019新型冠状病毒t8782和c28144突变；

如果在两个组合物中，均存在扩增信号，则比较两个组合物中，对应通道的ct值差值：

两种组合物各通道ct值的差值大于10，如第一组合物的ct值较小则为2019新型冠状病毒c8782和t28144突变，第二组合组的ct值较小则为2019新型冠状病毒t8782和c28144突变。

两种组合物各通道ct值的差值小于10，则为两个型别同时存在。

针对第一组合物，当fam和hex均有扩增曲线，且ct＜35，表示为2019新型冠状病毒c8782和t28144突变；

针对第二组合组，当fam和hex均有扩增曲线，且ct＜35，表示为2019新型冠状病毒t8782和c28144突变；

针对第一组合物以及第二组合物，若fam和hex仅有一条或无扩增曲线，则不能判断该2019新型冠状病毒的类型。判断结果可以参见如下表1所示。

对两管组合物中扩增的结果进行分析，其中“+”指有扩增曲线或ct值小于45，“-”指无扩增曲线或ct值大于45。ct1和ct2分别为第一组合物和第二组合物中对应通道的ct值，δct为这两个ct值差值的绝对值。

表1

实施例3、本发明组合物用于检测2019新型冠状病毒突变

使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为临床阳性样本提取核酸。分别用第一组合物和第二组合物进行检测，其结果如图1-2所示。从图中可以判读出，该样本第8782和第28144碱基分别为c和t，其为2019新型冠状病毒c8782和t28144突变。

实施例4、本发明组合物特异性检测

使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为两种高浓度（浓度为1.0e+08拷贝/ml）的假病毒样本。使用第一组合物和第二组合物分别检测2019新型冠状病毒c8782和t28144突变，以及2019新型冠状病毒t8782和c28144突变的假病毒模板，结果如图3-图6所示，各检测结果的ct值见下表2。

可见，不同组合物对2019新型冠状病毒c8782和t28144突变假病毒和2019新型冠状病毒t8782和c28144突变假病毒的扩增效率存在显著差异，各δct的最小值（13.00）仍远大于实施案例2所述结果判定方法中对δct的要求（10）。

以各组δct中的最小值13.00计算，两个组合物对特异性模板和非特异性模板的扩增效率差异高达8192倍（2^13），特异性优异。

实施例5、本发明组合物灵敏度检测

使用本发明实施例1中所述的组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为假病毒样本（2019新型冠状病毒c8782和t28144突变假病毒和2019新型冠状病毒t8782和c28144突变假病毒）经生理盐水稀释梯度，各浓度梯度分别为1.0e+06拷贝/ml、1.0e+05拷贝/ml、1.0e+04拷贝/ml、1.0e+03拷贝/ml、1.0e+02拷贝/ml、1.0e+01拷贝/ml。分别使用第一组合物和第二组合物检测不同浓度的特异性模板，结果如图7-10所示。

第一组合物最低检测浓度为1.0e+03拷贝/ml（10拷贝/反应）。

第二组合物最低检测浓度为1.0e+03拷贝/ml（10拷贝/反应）。

对比例1、本发明另外的探针和引物组合物检测2019新型冠状病毒突变

在本发明创造过程中，针对每一个位点碱基，各设计数十条不同的特异性识别引物。这些引物均遵循arms引物设计原理，在3’端增加1-2个突变，使其能够有选择性地扩增特异靶标，部分对比引物的序列见下：

8782c型正向对比引物：

8782c-1：5’-gctgattttgacacatggtttagc-3’（seqidno:11）；

8782c-2：5’-gctgattttgacacatggtttatc-3’（seqidno:12）；

8782c-3：5’-gctgattttgacacatggtttcgc-3’（seqidno:13）；

8782c-4：5’-gctgattttgacacatggtttctc-3’（seqidno:14）；

8782c-5：5’-gctgattttgacacatggtctcgt-3’（seqidno:15）；

8782t型正向对比引物：

8782t-1：5’-gctgattttgacacatggtttagt-3’（seqidno:16）；

8782t-2：5’-gctgattttgacacatggtttcgt-3’（seqidno:17）；

8782t-3：5’-gctgattttgacacatggtttatt-3’（seqidno:18）；

8782t-4：5’-gctgattttgacacatggtttcat-3’（seqidno:19）；

8782t-5：5’-gctgattttgacacatggttgatt-3’（seqidno:20）；

28144t型正向对比引物：

28144t-1：5’-atcggtaattatacagtttcctgttt-3’（seqidno:21）；

28144t-2：5’-atcggtaattatacagtttcctcttt-3’（seqidno:22）；

28144t-3：5’-atcggtaattatacagtttcctggtt-3’（seqidno:23）；

28144t-4：5’-atcggtaattatacagtttcctgggt-3’（seqidno:24）；

28144t-5：5’-atcggtaattatacagtttcctctct-3’（seqidno:25）；

28144c型正向对比引物：

28144c-1：5’-atcggtaattatacagtttcctgttc-3’（seqidno:26）；

28144c-2：5’-atcggtaattatacagtttcctcttc-3’（seqidno:27）；

28144c-3：5’-atcggtaattatacagtttcctggtc-3’（seqidno:28）；

28144c-4：5’-atcggtaattatacagtttcctgagc-3’（seqidno:29）；

28144c-5：5’-atcggtaattatacagtttccaggtc-3’（seqidno:30）。

使用这些引物，与实施例1中的其余引物、探针组合成组合物，按照实施例2所述的方法进行检测。所述样本为两种浓度为1.0e+08拷贝/ml的假病毒样本。检测结果见图11-14所示。各结果图中，实线为各引物扩增其特异性模板的结果（如8782c引物检测2019新型冠状病毒c8782和t28144突变模板——该模板中8782位点为c），虚线为该引物扩增非特异性模板的结果（如8782c引物检测2019新型冠状病毒t8782和c28144突变模板——该模板中8782位点为t）。

评价引物优劣的主要指标为引物的扩增效率和特异性。其中引物检测扩增特异性靶标的ct值越小，其扩增效率越高；引物检测同浓度下特异性模板的ct值和非特异性模板，二者ct值的差值的绝对值约大越好，其特异性越好。

从各个结果中可以看出，各对比引物的扩增效率和特异性的综合性能均劣于本发明组合物。

序列表

<110>圣湘生物科技股份有限公司

<120>检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒

<160>30

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gctgattttgacacatggttcatc24

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atcggtaattatacagtttccagatt26

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctgattttgacacatggtatcgt24

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atcggtaattatacagtttcctttgc26

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ccattagttgtgcgtaatatcgt23

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cttgcccattgattgctgcagtcataa27

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

caacacgaacgtcatgatactcta24

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

attgccaggaacctaaattgggtagt26

<210>9

<211>800

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

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