一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法与流程

文档序号:21453508发布日期:2020-07-10 17:47阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒,其中包括引物组、2×taqmix和ddh2o;

引物组如下:

用于检测白色念珠菌的erg11的引物:

f:5’-atggctattgttgaaactgtcatt-3’;

r:3’-ttcataaggttgttgaccattatg-5’;

引物所扩增的目的片段长度为140bp;

用于检测白色念珠菌的cdr1的引物:

f:5’-ttgttggaagacatgaagatgctg-3’;

r:3’-cttccaacaaaggtacgtcttcca-5’;

引物所扩增的目的片段长度为280bp;

用于检测白色念珠菌的cdr2的引物:

f:5’-ctgccaaagtgccacgttgggccc-3’;

r:3’-catctcaaactcctctaccaggtt-5’;

引物所扩增的目的片段长度为346bp;

用于检测白色念珠菌的mdr1的引物:

f:5’-atgtcattttttgattctttacgt-3’;

r:3’-gttcactctatcagaatgcccttt-5’;

引物所扩增的目的片段长度为204bp;

用于检测白色念珠菌的adh1的引物:

f:5’-agatcacgtgtgggatcagctgac-3’;

r:3’-gctcacccaggacaccttcagcact-5’;

引物所扩增的目的片段长度为271bp;

用于检测白色念珠菌的cap1的引物:

f:5’-ccagatcaaccgcgacatcgaatt-3’;

r:3’-ctcgagccgagtgagcccgttcgc-5’;

引物所扩增的目的片段长度为205bp;

用于检测白色念珠菌的flu1的引物:

f:5’-atgaataacaataccaacag-3’;

r:3’-agctttgtacattgagatta-5’;

引物所扩增的目的片段长度为205bp。

2.根据权利要求1所述的一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒,其特征在于:所述2×taqmix包括taqdna聚合酶、dntps、标准taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。

3.一种根据权利要求1所述的白色念珠菌耐药基因的检测方法,其特征在于:按照先后顺序包括以下步骤:

步骤一:待测样本的获取;

步骤二:pcr反应液的配置:待测组:总反应体系为50μl,其中包括2×taqmix25-35μl、各引物组的混合液f6μl、r6μl、样本2μl、ddh2o补至50μl;阴性对照组:总反应体系为50μl,其中包括2×taqmix25-35μl、各引物组的混合液f6μl、r6μl、ddh2o补至50μl;

步骤三:pcr扩增:将上述配置的pcr反应液放入pcr仪中,并设定反应参数;

步骤四:将上述pcr反应液进行1%的琼脂糖凝胶电泳,将样本中与预期条带大小相同的进行回收;

步骤五:将样本回收的dna进行纯化,然后连接载体送去测序;

步骤六:与将测序得到的序列与基因组序列进行比对,如果序列比对正确,则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因。

4.根据权利要求3所述的一种白色念珠菌耐药基因的检测方法,其特征在于:所述步骤三中反应参数为:94℃,3min;进入循环程序,94℃,30s;60℃,30s;72℃,10s,循环次数为40次;72℃,10min。

5.根据权利要求3所述的一种白色念珠菌耐药基因的检测方法,其特征在于:所述步骤六中所述序列比对的相似度在95%以上为同一个基因。


技术总结
本发明公开了一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法,其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O;其检测方法包括以下步骤:步骤一:待测样本的获取;步骤二:PCR反应液的配置:分为待测组和阴性对照组;步骤三:PCR扩增;步骤四:跑胶回收;步骤五:纯化和测序;步骤六:比对。该检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法除了适用于细菌培养物的常规多重耐药基因检测外,还可以无需培养直接检测感染患者血浆中的可培养菌或不可培养细菌的耐药基因;可对超微量核酸样本实现定量检测功能,检测灵敏度可低至10拷贝以下,灵敏度高,该反应可以在恒温条件下进行,操作简便,不需要昂贵的仪器设备,成本较低。

技术研发人员:张鹏;唐春花;邢宽;何志健;倪海钰;周权;何贵伦;安雪茹;李平;江晓琴
受保护的技术使用者:南京实践医学检验有限公司
技术研发日:2020.05.07
技术公布日:2020.07.10
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