一种用于鉴定待测植物样品是否来源于SbSNAC1-382事件或其后代的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的方法。

背景技术：

水资源短缺严重地影响了世界粮食生产，每年因水资源短缺造成的粮食减产占作物减产的50％以上，所带来的直接经济损失难以估计。我国干旱、半干旱地区面积约占全国国土面积二分之一以上。据统计，我国常年旱灾面积达到耕地总面积的20％左右，近40年来每年仅因干旱造成的粮食减产达就达1000亿公斤以上。玉米是世界上最重要的粮食、饲料和相关工业原料兼用作物之一。在我国，自2009年玉米已经成为第一大粮食作物。传统的玉米遗传育种对玉米抗旱性的改良起到了一定的作用，但很难突破种间的遗传限制而显著提高玉米的抗旱性。转基因技术可打破物种界限，对基因进行定向改造和重组转移，对现有品种的抗旱性进行改良，可以极大地提高玉米的抗旱性。发达国家，特别是美国培育、推广转基因玉米的实践也已经证明，转基因技术培育新品种可显著提高玉米抗旱能力，是大幅度提高产量和改善品质的最现实有效的途径，已经成为国际玉米育种发展的主要方向。2011年12月，美国农业部动植物卫生检疫局(aphis)正式批准了孟山都转基因抗旱玉米mon87460，这意味着世界第一个转基因抗旱玉米可以在生产中大规模推广和利用。该抗旱玉米所转基因为cspb基因(cspb基因来自枯草芽孢杆菌，编码一种rna伴侣蛋白)，在逆境条件下，该基因可以增强植物细胞的功能，在水分缺乏的条件下减少产量的损失。在干旱的情况下，转该基因的玉米自交系和杂交种可以显著地提高玉米的生物量和产量，在美国西部干旱地区的抗旱玉米田间试验已经达到甚至超过了6％至10％的增产目标。

sbsnac1基因是中国农业科学院作物科学研究所从新疆一个耐旱的地方高粱品种xgl-1中克隆出的nac家族基因。该基因在拟南芥中过量表达可以显著提高转基因拟南芥植株的耐旱性(luetal.，2013)。

技术实现要素：

本发明的目的是鉴定植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代，sbsnac1-382事件为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。植物样品可为植物叶片、种子等等。

本发明首先保护用于鉴定植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的方法，可包括如下步骤：检测待测植物样品的基因组dna中是否含有dna片段a和/或dna片段b；然后进行如下判断：如果待测植物样品的基因组dna含有dna片段a和/或dna片段b，则待测植物样品来源于sbsnac1-382事件或其后代；如果待测植物样品的基因组dna不含有dna片段a和/或dna片段b，则待测植物样品不来源于sbsnac1-382事件或其后代；

dna片段a的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

dna片段b的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

sbsnac1-382事件为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。

上述方法中，所述“检测待测植物样品的基因组dna中是否含有dna片段a和/或dna片段b”的方法可为s1)或s2)或s3)。

s1)直接测序。

s2)用引物对x和/或引物对y对待测植物样品的基因组dna进行pcr扩增，然后进行如下判断：如果得到目的扩增产物，则待测植物样品来源于sbsnac1-382事件或其后代；如果没有得到目的扩增产物，则待测植物样品不来源于sbsnac1-382事件或其后代；

引物对x由上游引物fx和下游引物rx组成；上游引物fx为序列表中序列3自5’末端起第1-451位所示的dna分子的一部分；下游引物rx为序列表中序列3自5’末端起第452-933位所示的dna分子的一部分的反向互补序列；引物对x的目的扩增产物为dna分子x；

引物对y由上游引物fy和下游引物ry组成；上游引物fy为序列表中序列4自5’末端起第1-352位所示的dna分子的一部分；下游引物ry为序列表中序列4自5’末端起第353-547位所示的dna分子的一部分的反向互补序列；引物对y的目的扩增产物为dna分子y。

s3)用能特异结合所述dna分子x的探针甲和/或用能特异结合所述dna分子y的探针乙对待测植物样品的基因组dna进行southern杂交，然后进行如下判断：如果得到杂交片段，则待测植物样品来源于sbsnac1-382事件或其后代；若不能得到杂交片段，则待测植物样品不来源于sbsnac1-382事件或其后代。

所述引物对x可为引物对x1、引物对x2和引物对x3中的至少一个。

引物对x1可由引物p1和引物p2组成。

引物对x2可由引物p3和引物p4组成。

引物对x3可由引物p1和引物p4组成。

引物p1的核苷酸序列可如序列表中序列5所示。

引物p2的核苷酸序列可如序列表中序列6所示。

引物p3的核苷酸序列可如序列表中序列7所示。

引物p4的核苷酸序列可如序列表中序列8所示。

所述引物对y可为引物对y1、引物对y2、引物对y3和引物对y4中的至少一个。

引物对y1可由引物s1和引物s3组成。

引物对y2可由引物s2和引物s3组成。

引物对y3可由引物s1和引物s4组成。

引物对y4可由引物s2和引物s4组成。

引物s1的核苷酸序列可如序列表中序列9所示。

引物s2的核苷酸序列可如序列表中序列10所示。

引物s3的核苷酸序列可如序列表中序列11所示。

引物s4的核苷酸序列可如序列表中序列12所示。

引物对x1的目的扩增产物(即dna分子x)的核苷酸序列可如序列表中序列3自5’末端起第215-525位所示。

引物对x2的目的扩增产物(即dna分子x)的核苷酸序列可如序列表中序列3自5’末端起第323-564位所示。

引物对x3的目的扩增产物(即dna分子x)的核苷酸序列可如序列表中序列3自5’末端起第215-564位所示。

引物对y1的目的扩增产物(即dna分子y)的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第45-547位所示。

引物对y2的目的扩增产物(即dna分子y)的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第1-547位所示。

引物对y3的目的扩增产物(即dna分子y)的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第215-436位所示。

引物对y4的目的扩增产物(即dna分子y)的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第1-436位所示。

本发明还保护用于鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的试剂盒。

本发明所保护的用于鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的试剂盒具体可为试剂盒甲；所述试剂盒甲可包括上述任一所述引物对x和/或引物对y；sbsnac1-382事件可为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。

所述试剂盒甲具体可由上述任一所述引物对x和/或引物对y组成。

本发明所保护的用于鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的试剂盒具体可为试剂盒乙；所述试剂盒乙可包括上述任一所述能特异结合dna分子x的探针甲和/或上述任一所述能特异结合dna分子y的探针乙；sbsnac1-382事件可为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。

所述试剂盒乙具体可由上述任一所述探针甲和/或上述任一所述探针乙组成。

上述任一所述引物对x和/或上述任一所述引物对y在鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代中的应用也属于本发明的保护范围；sbsnac1-382事件可为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。

上述任一所述能特异结合dna分子x的探针甲和/或上述任一所述能特异结合dna分子y的探针乙在鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代中的应用也属于本发明的保护范围；sbsnac1-382事件可为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493。

dna片段a和/或dna片段b在鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代中的应用也属于本发明的保护范围；sbsnac1-382事件可为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493；

dna片段a的核苷酸序列可如序列表中序列3所示；

dna片段b的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

本发明还保护dna片段a和/或dna片段b；

dna片段a的核苷酸序列可如序列表中序列3所示；

dna片段b的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

本发明的发明人将sbsnac1基因通过农杆菌介导的方法转入到玉米自交系郑58的基因组中，获得了一个转基因玉米事件sbsanc1-382(简称sbsnac1-382事件)。抗旱性鉴定显示，sbsnac1-382事件较对照玉米(即玉米自交系郑58)的抗旱性显著提高。此外，经检测，t3代-t5代sbsnac1-382事件具有遗传稳定性，可在不同世代间稳定遗传。因此，sbsnac1-382事件有可能进入商业化种植，sbsnac1-382事件已于2019年04月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17493。本发明提供的鉴定植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的方法，可以对sbsnac1-382事件进行特异性检测，更好的对sbsnac1-382事件进行监督管理。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中步骤三的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为实施例1中步骤五2的结果。

图3为实施例1中步骤五3的结果。

图4为实施例1中步骤七的结果。

图5为实施例1中步骤八灌浆期观测结果。

图6为实施例1中步骤八收获后测产结果。

图7为重组质粒35s::sbsnac1的载体示意图。

图8为实施例2中步骤一的实验结果。

图9为实施例2中步骤二的实验结果。

图10为实施例2中步骤三的实验结果。

图11为实施例2中步骤四的实验结果。

图12为实施例3中步骤一的实验结果。

图13为实施例3中步骤二的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

质粒pcambia3301为cambia公司的产品。

实施例1、转sbsnac1基因玉米的获得和抗旱性鉴定

一、sbsnac1基因的克隆

1、取高粱品种xgl-1(由新疆农业科学院粮食作物研究所提供)的叶片和根系，混合，作为材料。

2、完成步骤1后，取所述材料，先提取总rna，再反转录，得到高粱品种xgl-1的cdna。

3、完成步骤3后，以高粱品种xgl-1的cdna为模板，采用5’-tttccatgggattgccggtgat-3’(下划线为限制性内切酶ncoi的识别位点)和5’-tttggtgaccagcctcagaatggccccaac-3’(下划线为限制性内切酶bsteii的识别位点)组成的引物对进行pcr扩增，得到约985bp的pcr扩增产物。

4、将步骤3得到的pcr扩增产物和pmd18-t载体进行连接，得到重组质粒pmd18-sbsnac1。

将重组质粒pmd18-sbsnac1进行测序。测序结果表明，重组质粒pmd18-sbsnac1中含有序列表中序列1自5’末端起第1至966位所示的dna分子。

二、重组质粒35s::sbsnac1的构建

1、用限制性内切酶ncoi和bsteii双酶切重组质粒pmd18-sbsnac1，回收约980bp的dna片段。

2、用限制性内切酶ncoi和bsteii双酶切质粒pcambia3301，回收约9250bp的载体骨架。

3、将步骤1回收的dna片段和步骤2回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒35s::sbsnac1。

将重组质粒35s::sbsnac1进行测序。根据测序结果，对重组质粒35s::sbsnac1进行结构描述如下：将质粒pcambia3301的限制性内切酶ncoi和bsteii识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第5至970位所示的dna分子。重组质粒35s::sbsnac1表达序列表中序列2所示的蛋白质sbsnac1。

三、阳性重组农杆菌的获得

1、采用冻融法将重组质粒35s::sbsnac1转化根癌农杆菌eh105，得到重组农杆菌。

2、完成步骤1后，将各个重组农杆菌的单克隆分别接种至yeb液体培养基，28℃、200rpm培养16h，得到农杆菌菌液。

3、完成步骤2后，分别以各个农杆菌菌液、水和重组质粒35s::sbsnac1为模板，以5'-tttccatgggattgccggtgat-3'和5'-tttggtgaccagcctcagaatggccccaac-3'为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。重组质粒35s::sbsnac1作为阳性对照。水作为阴性对照。

4、完成步骤3后，将pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果某个重组农杆菌的pcr扩增产物中含有约985bp的dna片段，则该重组农杆菌为阳性重组农杆菌。

琼脂糖凝胶电泳见图1(“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，泳道1至7均为重组农杆菌)。

四、t0代拟转sbsnac1基因玉米的获得

1、将步骤三获得的阳性重组农杆菌的单克隆接种至yeb液体培养基，28℃、200rpm培养，得到od550nm为0.3-0.4的农杆菌菌液。

2、完成步骤1后，取农杆菌菌液，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体。

3、取步骤2收集的菌体，加入侵染培养基(含有100μm乙酰丁香酮的ms培养基)进行重悬，得到od550nm为0.3-0.4的侵染液。取授粉11-12天、大小为1.0-1.5mm的玉米自交系郑58的幼胚，在黑暗条件下用侵染液侵染(即浸泡)5min，然后置于共培养培养基上，用透气胶带密封，20℃暗培养3天。

4、完成步骤3后，取玉米自交系郑58的幼胚，置于静息培养基，28℃培养7天。

5、完成步骤4后，取玉米自交系郑58的幼胚，先置于选择培养基1上，28℃培养14天；再置于选择培养基2上，28℃培养14天，得到抗性愈伤。

6、完成步骤5后，取抗性愈伤，置于再生培养基1，25℃暗培养14天，得到成熟的体细胞胚。

7、完成步骤6后，将成熟的体细胞胚转移到再生培养基2上，25℃、光暗交替培养7-10天，得到抗性苗。光暗交替培养即16h光照培养和8h暗培养，光照培养时的光照强度为80-100μe/m2/s。

8、完成步骤7后，将抗性苗移栽土中，得到t0代拟转sbsnac1基因玉米。

共培养培养基、静息培养基、选择培养基1(含1.5mg/l双丙胺膦的选择培养基)、选择培养基2(含3mg/l双丙胺膦的选择培养基)、再生培养基1和再生培养基2均记载于如下文献中：frameetal.，2011。

五、t0代拟转sbsnac1基因玉米的鉴定

1、喷施basta

分别向t0代拟转sbsnac1基因玉米的植株的叶片喷施basta(浓度为2‰)，5-7天后观察叶片。如果某t0代拟转sbsnac1基因玉米的叶片没有出现枯萎，则该t0代拟转sbsnac1基因玉米初步鉴定为t0代转sbsnac1基因玉米。

将通过喷施basta初步鉴定为t0代转sbsnac1基因玉米的7个株系分别命名为sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471和sbsnac1-474。

2、sbsnac1基因的pcr检测

(1)分别提取t0代转sbsnac1基因玉米(sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471或sbsnac1-474)叶片的基因组dna并以其作为模板，采用扩增sbsnac1基因的特异引物对(由sbsnac1-f：5’-gaccgcaagtacccaaacgg-3’和sbsnac1-r：5’-cacccagtcatccagcctgag-3’组成，其中sbsnac1-f跨越两个外显子)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

按照上述步骤，将模板替换为玉米自交系郑58叶片的基因组dna，其它步骤均不变，作为阴性对照。

按照上述步骤，将模板替换为水，其它步骤均不变，作为水对照。

按照上述步骤，将模板替换为重组质粒35s::sbsnac1，其它步骤均不变，作为阳性对照。

反应条件：95℃，5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，34个循环；72℃5min；15℃保存。

(2)将各个pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果某株系的pcr扩增产物中含有约249bp的dna片段，则该株系再次鉴定为t0代转sbsnac1基因玉米。

琼脂糖凝胶电泳结果见图2(marker为dnamarker，1至7依次为sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471和sbsnac1-474)。

3、bar基因的pcr检测

(1)提取t0代转sbsnac1基因玉米(sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471或sbsnac1-474)叶片的基因组dna并以其作为模板，采用扩增bar基因的特异引物对(由5’-gaagtccagctgccagaaac-3’和5’-gtctgcaccatcgtcaacc-3’组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

按照上述步骤，将模板替换为玉米自交系郑58叶片的基因组dna，其它步骤均不变，作为阴性对照。

按照上述步骤，将模板替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

按照上述步骤，将模板替换为重组质粒35s::sbsnac1，其它步骤均不变，作为阳性对照。

反应条件：95℃，5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，34个循环；72℃5min；15℃保存。

(2)将各个pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果某株系的pcr扩增产物中含有约444bp的dna片段，则该株系再次鉴定为t0代转sbsnac1基因玉米。

部分琼脂糖凝胶电泳结果见图3(marker为dnamarker，泳道1至7依次为sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471和sbsnac1-474，泳道11为阳性对照，泳道12为阴性对照)。

上述结果表明，sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471和sbsnac1-474均为t0代转sbsnac1基因玉米。

六、t1代-t5代sbsnac1-382的获得

取t0代转sbsnac1基因玉米的种子，自交，得到t1代转sbsnac1基因玉米的种子。t1代转sbsnac1基因玉米的种子连续自交，依次得到t2代转sbsnac1基因玉米的种子、t3代转sbsnac1基因玉米的种子、t4代转sbsnac1基因玉米的种子和t5代转sbsnac1基因玉米的种子。

选择t1代转sbsnac1基因玉米-t5代转sbsnac1基因玉米进行后续实验。

七、t1代-t5代转sbsnac1基因玉米的温室内抗旱性鉴定

待测玉米为t1代-t5代转sbsnac1基因玉米(sbsnc1-382、sbsnac1-383、sbsnac1-389、sbsnac1-466、sbsnac1-467、sbsnac1-471或sbsnac1-474)或玉米自交系郑58。玉米自交系郑58作为对照。

(1)将3株待测玉米种植于花盆中，每个株系种植5个重复；然后置于温室，常规管理。

(2)完成步骤(1)后，待待测玉米生长至玉米可见叶达到4叶1心时停止浇水，连续干旱21天。观察待测玉米的生长状态。

部分待测玉米的生长状态见图4(sbsnc1-382为t5代sbsnc1-382，郑58为玉米自交系郑58)。结果表明，玉米自交系郑58的叶片卷曲、出现萎蔫现象，而t1代-t5代转sbsnac1基因玉米的叶片伸展、仍然保持绿色。由此可见，与玉米自交系郑58相比，t1代-t5代转sbsnac1基因玉米的抗旱性显著提高。

八、t3代-t5代sbsnc1-382的田间抗旱性鉴定

2015年，将t3代sbsnc1-382和玉米自交系郑58进行田间抗旱性鉴定。

2016年，将t4代sbsnc1-382和玉米自交系郑58进行田间抗旱性鉴定。

2017年，将t5代sbsnc1-382和玉米自交系郑58进行田间抗旱性鉴定。

抗旱性鉴定设置水、旱两个处理，每个材料种植6行，行长5米，重复3次，水处理滴灌7次，水量350方/亩，旱处理浇水150方/亩。

进行抗旱性鉴定的玉米均种植于新疆乌鲁木齐安宁渠试验场。观测灌浆期的生长状态和产量。

试验结果如下：

1、灌浆期观测结果显示(图5，sbsnc1-382为t3代sbsnc1-382)：在旱区，与t3代sbsnc1-382、t4代sbsnc1-382或t5代sbsnc1-382相比，玉米自交系郑58的株高明显下降，叶色明显退绿发黄；

2、收获后测产显示(表1和图6)，在旱区，t3代sbsnc1-382、t4代sbsnc1-382或t5代sbsnc1-382较玉米自交系郑58的产量明显增加。

表1.sbsnac1-382在水区和旱区的平均单株产量

注：表中数据为平均值±标准误差；平均单株产量为籽粒产量(水份14％)。

试验结果表明，与玉米自交系郑58相比，t3代sbsnc1-382、t4代sbsnc1-382或t5代sbsnc1-382的抗旱性显著提高。

实施例2、t3代-t5代sbsnac1-382的遗传稳定性检测

重组质粒35s::sbsnac1的载体示意图见图7。重组质粒35s::sbsnac1的大小为10.24kb，在该载体上只有一个限制性内切酶hindiii和一个ecori的酶切位点，因此分别利用这两个酶进行单酶切，可以得到一个10.24kb的线性片段。另外，该载体上没有限制性内切酶bglii和drai的酶切位点。

分别用限制性内切酶hindiii和ecori对sbsnc1-382事件或玉米自交系郑58的基因组dna进行单酶切，使用sbsnac1基因和bar基因的特异性探针分别进行杂交。结果显示sbsnac1-382事件含有2个拷贝sbsnac1基因和bar基因，并且这两个拷贝在转基因t3、t4和t5代都可以稳定遗传。因此，这2个拷贝很可能插入到玉米基因组的同一个位置。为了验证这个假设，利用插入序列(t-dna)内没有酶切位点的限制性内切酶bglii和drai，分别对sbsnac1-382事件和玉米自交系郑58的基因组dna进行酶切，从而确定插入位点数(玉米基因组内t-dna的整合位点数)。southern杂交结果显示，sbsnac1-382事件(即t3代-t5代sbsnac1-382)中t-dna在玉米基因组上是单一位点插入2个拷贝的sbsnac1和bar基因，并可在不同世代间稳定遗传。具体结果如下：

一、利用sbsnac1基因探针、限制性内切酶hindiii和ecori进行southern杂交的结果

1、以重组质粒35s::sbsnac1为模板，以5’-cgcgtggggtcaagacggactg-3’和5’-gggaacgagtccagctccgggaac-3’为引物进行pcr扩增，得到约386bp的dna片段。该片段即为sbsnac1基因探针。

2、用限制性内切酶hindiii和ecori分别对t3代sbsnac1-382、t4代sbsnac1-382、t5代sbsnac1-382或玉米自交系郑58的基因组dna进行酶切，以步骤1获得的sbsnac1基因探针进行杂交。

用限制性内切酶hindiii对重组质粒35s::sbsnac1进行酶切，以步骤1获得的sbsnac1基因探针进行杂交。作为阳性对照。

实验结果见图8(泳道1为限制性内切酶hindiii酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道2为限制性内切酶hindiii酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道3为限制性内切酶hindiii酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道4为限制性内切酶hindiii酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道5为限制性内切酶ecori酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道6为限制性内切酶ecori酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道7为限制性内切酶ecori酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道8为限制性内切酶ecori酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道9为限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1，泳道10为takaradl15kbdnamarker)。结果表明，用限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1杂交出10.24kb的片段；用限制性内切酶hindiii酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在2.5-5kb之间有2条特异杂交条带，玉米自交系郑58存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于sbsnac1基因探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关，相同的杂交条带在sbsnac1-382事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带；用限制性内切酶ecori酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在2.5-5kb之间有2条特异杂交条带，玉米自交系郑58存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于sbsnac1基因探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关，相同的杂交条带在sbsnac1-382事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带。由于重组质粒35s::sbsnac1中只有一个限制性内切酶hindiii和一个ecori的酶切位点，因此转基因玉米基因组dna分别用这两种酶进行酶切杂交的得到的特异条代数就代表插入的拷贝数。杂交结果显示sbsnac1-382事件的插入序列有2个拷贝的sbsnac1基因。

二、利用bar基因探针、限制性内切酶hindiii和ecori进行southern杂交的结果

1、以重组质粒35s::sbsnac1为模板，以5’-atgagcccagaacgacgcccg-3’和5’-tcaaatctcggtgacgggcaggac-3’为引物进行pcr扩增，得到约552bp的dna片段。该片段即为bar基因探针。

2、用限制性内切酶hindiii和ecori分别对t3代sbsnac1-382、t4代sbsnac1-382、t5代sbsnac1-382或玉米自交系郑58的基因组dna进行酶切，以步骤1获得的bar基因探针进行杂交。

用限制性内切酶hindiii对重组质粒35s::sbsnac1进行酶切，以步骤1获得的bar基因探针进行杂交。作为阳性对照。

实验结果见图9(泳道1为限制性内切酶hindiii酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道2为限制性内切酶hindiii酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道3为限制性内切酶hindiii酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道4为限制性内切酶hindiii酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道5为限制性内切酶ecori酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道6为限制性内切酶ecori酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道7为限制性内切酶ecori酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道8为限制性内切酶ecori酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道9为限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1，泳道10为takaradl15kbdnamarker)。结果表明，用限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1杂交出10.24kb的片段(由于质粒上样量较低，导致杂交条带较弱)；用限制性内切酶hindiii酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382在2.5kb和4kb附近各有一条条带，玉米自交系郑58中没有出现条带；用限制性内切酶ecori酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382在4kb和5kb附近各有一条条带，玉米自交系郑58中没有出现条带；由于重组质粒35s::sbsnac1中只有一个限制性内切酶hindiii和一个ecori的酶切位点，因此转基因玉米基因组dna分别用这两种酶进行酶切杂交的得到的特异条代数就代表插入的拷贝数。杂交结果显示sbsnac1-382事件的插入序列有2个拷贝的bar基因。

三、利用sbsnac1基因探针、限制性内切酶bglii和drai进行southern杂交的结果

1、同步骤一中1。

2、用限制性内切酶bglii和drai分别对t3代sbsnac1-382、t4代sbsnac1-382、t5代sbsnac1-382或玉米自交系郑58的基因组dna进行酶切，以步骤1获得的sbsnac1基因探针进行杂交。

用限制性内切酶drai对重组质粒35s::sbsnac1进行酶切，以步骤1获得的sbsnac1基因探针进行杂交。作为阳性对照。

实验结果见图10(泳道1为限制性内切酶bglii酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道2为限制性内切酶bglii酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道3为限制性内切酶bglii酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道4为限制性内切酶bglii酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道5为限制性内切酶drai酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道6为限制性内切酶drai酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道7为限制性内切酶drai酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道8为限制性内切酶drai酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道9为限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1，泳道10为takaradl15kbdnamarker)。结果表明，用限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1杂交出10.24kb的片段；用限制性内切酶bglii酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在大于15kb位置有1条特异杂交条带，玉米自交系郑58存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于sbsnac1基因探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关，相同的杂交条带在sbsnac1-382事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带；用限制性内切酶drai酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在10-15kb之间有1条特异杂交条带，玉米自交系郑58存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于sbsnac1基因探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关，相同的杂交条带在sbsnac1-382事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带。杂交结果显示sbsnac1-382事件2个拷贝的sbsnac1基因在基因组上是单一位点插入。

四、利用bar基因探针、限制性内切酶bglii和drai进行southern杂交的结果

1、同步骤二中1。

2、用限制性内切酶bglii和drai分别对t3代sbsnac1-382、t4代sbsnac1-382、t5代sbsnac1-382或玉米自交系郑58的基因组dna进行酶切，以步骤1获得的bar基因探针进行杂交。

用限制性内切酶hindiii对重组质粒35s::sbsnac1进行酶切，以步骤1获得的bar基因探针进行杂交。作为阳性对照。

实验结果见图11(泳道1为限制性内切酶bglii酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道2为限制性内切酶bglii酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道3为限制性内切酶bglii酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道4为限制性内切酶bglii酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道5为限制性内切酶drai酶切的t3代sbsnac1-382的基因组dna，泳道6为限制性内切酶drai酶切的t4代sbsnac1-382的基因组dna，泳道7为限制性内切酶drai酶切的t5代sbsnac1-382的基因组dna，泳道8为限制性内切酶drai酶切的玉米自交系郑58的基因组dna，泳道9为限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1，泳道10为takaradl15kbdnamarker)。

结果表明，用限制性内切酶hindiii酶切的重组质粒35s::sbsnac1杂交出10.24kb的片段；用限制性内切酶bglii酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在大于15kb位置有1条特异杂交条带，这与利用sbsnac1基因探针杂交的结果一致(利用sbsnac1基因探针和bar基因探针杂交的特异条带大小一致)；用限制性内切酶drai酶切后，t3代-t5代sbsnac1-382相对于玉米自交系郑58在10-15kb之间有1条特异杂交条带，这与利用sbsnac1基因探针杂交的结果一致(利用sbsnac1基因探针和bar基因探针杂交的特异条带大小一致)。杂交结果显示sbsnac1-382事件2个拷贝的bar基因在基因组上是单一位点插入。

上述southern杂交结果表明，sbsnac1-382事件t-dna片段在玉米基因组上是单一位点插入，插入位点上有2个拷贝的sbsnac1基因和bar基因，并可在不同世代间稳定遗传。

sbsnac1-382事件已于2019年04月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17493。sbsnac1-382事件的全称为玉米zeamayssbsnac1-382cgmccno.17493，简称为sbsnac1-382事件。

实施例3、sbsnac1-382事件插入位点的外源插入片段5’端旁侧序列和3’端旁侧序列的确定

特定的转基因事件其旁侧序列是特异的。因此，应用旁侧序列可以特异的检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行pcr扩增，检测特异性条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’端旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。

一、5’端旁侧序列的获得和验证

1、提取t5代sbsnac1-382叶片的基因组dna并以其作为模板，以特异性引物gsp1:5’-tatccctggctcgtcgccga-3’、特异性引物gsp2：5’-agggcttcaagagcgtggtcgct-3’、特异性引物gsp3：5’-ccgtcaccgagatttgactcgagtttc-3’和随机引物(genomewalkingkit中的组件；genomewalkingkit为takara公司的产品，货号为6108)进行tail-pcr反应，获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界的序列。该序列长933bp，具体如序列表中序列3所示。其中，序列表中序列3自5’末端起第1-451位为玉米基因组序列，第452-933位为载体序列。

根据序列表中序列3自5’末端起第1-451位所示的dna分子，设计并合成特异性上游引物p1：5’-agaatcatacaccagtaacaagcc-3’和p3：5’-ggaatgaacctcatcccaatga-3’。根据序列表中序列3自5’末端起第452-933位所示的dna分子，设计并合成下游鉴定引物p2：5’-cagtacattaaaaacgtccgca-3’和p4：5’-actaaaatccagatcccccgaa-3’。

2、以sbsnac1-382叶片的基因组dna、水、玉米自交系郑58叶片的基因组dna或sbsnac1-383叶片的基因组dna为模板，采用引物对甲(由p1和p2组成)、引物对乙(由p3和p4组成)或引物对丙(由p1和p4组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

反应体系为20μl，由2μl10×pcr缓冲液、0.5μldntp(浓度为10mmol/l)、0.5μltaq酶(浓度为5u/μl)、1.0μl模板(如果为玉米叶片的基因组dna，则浓度为50ng/μl)、0.5μl上游引物(浓度为10μmol/l)、0.5μl下游引物(浓度为10μmol/l)和15μlddh2o。

反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min；15℃保存。

3、将pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳结果见图12(泳道5至8为引物对甲，泳道1至4为引物对乙，泳道9至12为引物对丙，泳道1、5、9为sbsnac1-382叶片的基因组dna，泳道2、6、10为水，泳道3、7、11为玉米自交系郑58叶片的基因组dna，泳道4、8、12为sbsnac1-383叶片的基因组dna)。结果表明，以sbsnac1-382叶片的基因组dna为模板，采用引物对甲可以得到约311bp的dna片段，采用引物对乙可以得到约242bp的dna片段，采用引物对丙可以得到约350bp的dna片段。

二、3’端旁侧序列的获得和验证

1、提取t5代sbsnac1-382叶片的基因组dna构建fosmid文库(takarabiotechnology(dalian)co.,ltd)，然后以sbsnac1基因特异性引物5’-gaccgcaagtacccaaacgg-3’和5’-cacccagtcatccagcctgag-3’进行pcr扩增(反应条件：95℃，5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸5min；15℃保存)，筛选到阳性单克隆，并利用pacbiorsii进行测序(武汉未来组生物科技有限公司)。根据测序结果，获得外源基因在玉米基因组整合位点的右边界的序列。该序列长547bp，具体如序列表中序列4所示。其中，序列表中序列4自5’末端起第1-352位为玉米基因组序列，第353-547位为载体序列。

根据序列表中序列4自5’末端起第1-352位所示的dna分子，设计并合成特异性引物s1：5’-agtgcacattgcaatcctacaagc-3’和s2：5’-cctaagttcatgcaactagaggtttca-3’。根据序列表中序列4自5’末端起第353-547位所示的dna分子，设计并合成s3：5’-ggtttcgctcatgtgttgagc-3’和s4：5’-tccagatcccccgaattaattcg-3’。

2、以sbsnac1-382叶片的基因组dna为模板，采用引物对1(由s1和s3组成)、引物对2(由s2和s3组成)、引物对3(由s1和s4组成)、引物对4(由s2和s4组成)或引物对5(由5’-gaccgcaagtacccaaacgg-3’和5’-cacccagtcatccagcctgag-3’组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

以水为模板，采用引物对5进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。作为阴性对照。

反应体系为20μl，由2μl10×pcr缓冲液、0.5μldntp(浓度为10mmol/l)、0.5μltaq酶(浓度为5u/μl)、1.0μl模板(如果为玉米叶片的基因组dna，则浓度为50ng/μl)、0.5μl上游引物(浓度为10μmol/l)、0.5μl下游引物(浓度为10μmol/l)和15μlddh2o。

反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min；15℃保存。

3、将pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳结果见图13(泳道1至5为sbsnac1-382叶片的基因组dna，泳道6为水，泳道1和6为引物对1，泳道2为引物对2，泳道3为引物对3，泳道4为引物对4，泳道5为引物对5)。结果表明，以sbsnac1-382叶片的基因组dna为模板，采用引物对1可以得到约503bp的dna片段，采用引物对2可以得到约547bp的dna片段，采用引物对3可以得到约392bp的dna片段，采用引物对4可以得到约436bp的dna片段，采用引物对5可以得到约249bp的dna片段。

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种用于鉴定待测植物样品是否来源于sbsnac1-382事件或其后代的方法

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>970

<212>dna

<213>sorghumbicolor（l.）moench

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