用于猕猴桃商业品种的性别鉴定的通用分子标记引物及应用的制作方法

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃性别鉴定的分子标记引物及应用。

背景技术：

猕猴桃是公认的维生素c之王，且富含膳食纤维和多种矿物营养，近年来备受消费者欢迎。猕猴桃为功能性雌雄异株植物，具有花形态相似但雌雄器官相异的雌花和雄花。猕猴桃杂交后代的雌雄分离比例约为1：1，鉴于猕猴桃雌雄异株的性别特点，猕猴桃果园通常配置少量授粉雄株，保证果园产量和果实品质，多余雄株会除掉。作为多年生果树，猕猴桃在传统育种中面临童期长、占地面积大等问题。猕猴桃幼苗往往下地种植数年后才能开花，利用猕猴桃花形态结构的差异方能鉴别植株的雌雄性别，因此在开花前的数年内大量的不结果雄株在育种中造成了极大的浪费。由于缺乏可用的猕猴桃雌、雄性别鉴别的分子标记，猕猴桃植株的早期性别鉴定工作一直难以开展。

近年，用于在山梨和中华猕猴桃杂交群体中的性别鉴定标记，稳定性高且操作简单，为种间杂交群体的早期性别鉴定提供了极大帮助，例如申请人早期研发的申请号为2014105250145、201410524999x，2014105230438的相关技术。由于猕猴桃种质的遗传多样性丰富，用于杂交群体的性别标记在其他种内迁移性较差，仍难以满足猕猴桃育种工作的需要。结合遗传学和基因组学研究手段，开展通用性猕猴桃性别鉴定分子标记，高效辅助育猕猴桃育种，已经成为亟待解决的重要问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种通用猕猴桃性别鉴定分子标记引物：f:cgacacaatgcaactcctgc和r：tggtcgaggttaatcaaatag，该分子标记具有普适性，适用于目前大多数商品化的猕猴桃品种。

本发明的另一个目的在于提供了上述分子标记引物的应用，该分子标记引物适用于中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的性别鉴定。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于猕猴桃通用性别鉴定的分子标记引物的获得：申请人通过对中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌、雄样本进行基因组测序，通过序列比对和荧光原位杂交等方法，确定性别决定区段，结合基因结构注释结果，在猕猴桃雌、雄样本差异区段设计特异性引物，开发雌雄性别鉴定的特异标记。利用设计合成的引物，对中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌、雄样本进行pcr扩增，筛选得到分子标记，针对其设计的引物为cgacacaatgcaactcctgc和tggtcgaggttaatcaaatag。

猕猴桃通用性别鉴定的分子标记引物在鉴定猕猴桃商业品种性别中的应用；所述的商业品种属于中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃或黑蕊猕猴桃；

以上所述的应用过程中，利用本发明的分子标记，对上述商业品种的dna进行扩增，均能在雄性样本中扩增出442bp的特异性条带，在雌性样本中则无条带。

与现有技术相比，本发明的优点：

1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。

2.本发明的引物扩增稳定性，能用于进行中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的性别鉴定。

3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可对目前主要商业栽培的猕猴桃品种进行鉴定，利用分子标记引物对中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃进行扩增，可在雄性样本中特异性的获得442bp的条带。

附图说明

图1为实施例2中利用本发明提供的分子标记引物对7种商品化猕猴桃的雌雄鉴定示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。本发明所述的美味猕猴桃为中华猕猴桃美味变种。

实施例1：

用于猕猴桃通用性别鉴定的分子标记引物的获得：

申请人通过对中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌、雄样本进行全基因组测序，通过序列比对和荧光原位杂交等方法，确定性别决定区段，结合基因结构注释结果，在猕猴桃雌雄样本差异区段设计特异性引物，开发雌雄性别鉴定的特异标记。利用设计合成的引物，对中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌雄样本进行pcr扩增，筛选得到分子标记，针对其设计的引物为：f：cgacacaatgcaactcctgc和r：tggtcgaggttaatcaaatag

实施例2：

用于猕猴桃通用性别鉴定的分子标记引物在早期性别鉴定中的应用：

(1)按照ctab法分别提取中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌、雄dna样品。

(2)使用加样器吸取引物、taqpcrmix预混液和水，加入到pcr离心管中。

(3)将离心管置于离心机中，离心500g即停。

(4)在离心管中分别加入各样本dna，每个样品50pg。

(5)参照以下pcr反应体系加入相应试剂到离心管中，振荡，将离心管置于离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行pcr反应。

a.pcr反应体系

25μl体系的配制

所述的引物为cgacacaatgcaactcctgc和tggtcgaggttaatcaaatag

b.pcr反应条件

(6)程序结束后立即将离心管置于冰水混合物上急速冷却，再将离心管置于离心机中，离心2000g即停。

(7)使用biorad电泳仪和凝胶成像系统，检测扩增条带。

(8)利用标记引物扩增中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌、雄dna样本；中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雄性样本扩增得到442bp的特异条带，中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的雌性样本未扩增到特异条带。

序列表

<110>中国科学院武汉植物园

<120>用于猕猴桃商业品种的性别鉴定的通用分子标记引物及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgacacaatgcaactcctgc20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tggtcgaggttaatcaaatag21