一种提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收累积的方法与流程

本发明属于农业类植物生产领域，涉及一种提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收累积的方法，具体涉及一种应用褪黑素来提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收累积的方法。

背景技术：

油菜是我国重要的油料作物，用途广泛，不仅是食用油的主要来源，提供了当前国产油料作物产油量的57％，而且还可以作为蔬菜和饲料等。近年来，我国的油菜种植面积逐年增加，目前已占到世界的30％左右。油菜需肥量大，尤其是对氮肥的需求，而实际生产中，土壤肥力偏低、养分供应不足的情况时常存在，其中氮肥供应不足会严重影响油菜的产量与品质。

我国年氮肥消耗量为2500万吨(纯氮)，为世界之首，但氮肥报酬递减率越来越严重，许多地方出现了氮肥增加、产量不再增加甚至减少的现象，严重违反了低碳经济的要求。而油菜生产化肥投入较多，但肥料利用率较低，不仅造成资源浪费，而且带来农业面源污染潜在风险。此外，氮肥增加使作物体内硝酸盐含量增加已成为制约我国农产品出口创汇的主要因子之一。因此，提高油菜应对低氮胁迫的适应性和抗逆性对油菜的生产具有重要意义。目前，从植物本身出发提高氮肥利用率，挖掘植物高效利用氮素的潜力是近几年来植物营养效率研究的热点之一。

褪黑素(melatonin，mt)是一种广泛存在于高等植物中的一类小分子物质，化学名称为n-乙酰-5-甲氧基色胺，广泛存在于动植物中。褪黑素在植物中具有多种功能，包括调节植物生长发育，如促进侧根的生长、改变花期、参与叶绿素合成和延缓叶片衰老等。目前研究认为，褪黑素对植物抗逆的调节作用主要归因于它参与活性氧的清除。前人研究已经证实mt能够提高植物在干旱、低温等多种逆境下的存活能力，广泛用于提高植物抗逆性，其原理主要通过清除逆境过程中产生的氧自由基，从而保护大分子物质结构不被破坏。但是目前为止，通过外源激素调控油菜低氮胁迫耐受力和氮吸收的技术较为缺乏，而植物激素具有用量少、见效快等优点，对调节植株生长发育、器官建成与产量形成、抗逆等方面都具有重要的作用。

目前，有关外源喷施褪黑素对低氮胁迫下油菜低氮耐受性和氮吸收累积的作用还未见报道。因此，本技术探讨了外源喷施mt对低氮胁迫下油菜低氮耐受性和氮吸收累积的作用，旨在为提高油菜应对低氮胁迫开辟一条新途径。

技术实现要素：

鉴于上述不足，本发明提供了一种采用外源喷施褪黑素以提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收累积的方法，本发明首先确定盆栽条件低氮胁迫下外源喷施褪黑素的适宜浓度；随后再明确通过外源喷施褪黑素提高油菜应对低氮胁迫和氮吸收累积的有效途径。本发明是通过如下手段实现的：

一种提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收累积的方法，包括如下步骤：

(1)盆栽条件下褪黑素适宜浓度优化：

准备8目、10目和40目纯白石英砂，按照1：2：1的比例混匀，用清水冲洗至水不变浑浊，分装至20cm口径的盆栽盒(盒底垫上细孔纱布)，用大托盘盛放，并至于通风良好的地方晾干水分；

往大托盘中加入1/2hoagland营养液，待石英砂被营养液浸透，选取大小一致、饱满的油菜种子，消毒后均匀撒播在石英砂表面，每盆15颗种子，用干净的石英砂覆盖表面，并用保鲜膜封口进行保湿，待种子露尖即可撤除保鲜膜；

继续浇灌1/2hoagland营养液培养，待油菜幼苗长至四叶一心(期间定苗每盆3株)，将预备作低氮胁迫处理的植株浇灌一次清水培养两天后，换用氮源降至正常氮浓度1/20的低氮营养液进行浇灌培养；

同时配置50μm、100μm、300μm浓度的褪黑素进行叶面喷洒(在光照培养间熄灯前一小时内喷洒)，喷洒剂量保证叶面有水珠但不成柱流下即可，每3天喷洒一次，同时，设置低氮不喷施褪黑素作为对照，共计4个处理，处理两周后进行取样；

(2)检测植株地上部和地下部干重和氮含量

干重测定：分别收获不同浓度褪黑素喷施处理两周后油菜植株的地上部和地下部，称取鲜重后105℃杀青30min，75℃烘干至恒重后称取干重。

根冠比：不同处理油菜植株的地下部分与地上部分干重的比值。

氮含量测定：油菜植株地上部和根部样品烘干磨碎后，准确称取0.1500g左右样品，用h2so4-h2o2法消煮后，过滤定容到50ml，用凯氏定氮法测定氮含量，计算氮累积量(naccumulation，mg/plant)＝生物量×氮含量。

(3)利用荧光定量pcr检测不同浓度褪黑素喷施处理油菜硝酸盐转运蛋白nrt2基因家族的表达情况

根据前期研究工作中，采用hmmer(v3.1)软件的hmmbuild根据已知作物nrt2序列比对构建nrt2基因家族蛋白结构域的隐马尔可夫模型文件(hmmprofile)，采用软件hmmer(v3.1)软件的hmmsearch程序将blast比对上的蛋白序列进行结构域搜索并打分，设置阈值0.001进行过滤，筛选出油菜候选nrt2蛋白；将候选nrt2蛋白运用ncbicd-search工具进行蛋白结构域注释，同时对序列进行clustalw2比对，从比对信息中进一步确认序列的结构域，最后确定nrt2家族成员基因17个。

采集不同浓度褪黑素处理两周的油菜叶片和根系，使用magen的rna提取试剂盒(hipureplatrnaminikit)提取rna，按照takara公司的带有去除基因组dna的反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser)的使用说明合成cdna，用rnaase-freeh2o将反转录产物稀释10倍，存放于-20℃备用。

通过ncbi在线设计内参及nrt2家族基因的定量pcr引物，检测引物的特异性。定量pcr使用premixextaqtmⅱ(takara)试剂进行，所有的反应使用cfx-connect(bio-rad，美国)仪器进行，并利用cfx-connect分析各个基因的扩增曲线和溶解曲线确定各个样品中的ct值，从而计算nrt2基因的相对表达量。

本发明的有益效果在于

1、采用本发明的方法可以确定盆栽条件低氮胁迫下外源喷施褪黑素的适宜浓度。

2、本发明能为提高油菜应对低氮胁迫和氮吸收提供有效途径。

3、本发明能为提升大田油菜低氮耐受力提供参考依据。

附图说明

图1为砂培情况展示；

图2a为低氮胁迫下喷施不同浓度褪黑素油菜地上部干物质积累情况；

图2b为低氮胁迫下喷施不同浓度褪黑素油菜地下部干物质积累情况；

图2c为低氮胁迫下喷施不同浓度褪黑素油菜地上部与地下部氮(n)积累情况；

图3为低氮胁迫下喷施不同浓度褪黑素油菜硝酸盐转运蛋白nrt2家族基因的表达情况。jl代表新叶，sl代表老叶，r代表地下部(根)，ln表示低氮处理，而mt后边的数字代表不同褪黑素处理浓度。

具体实施方式

实施例1

一种提高油菜低氮胁迫耐受性和氮吸收的方法：

(1)盆栽条件下褪黑素适宜浓度优化：

准备8目、10目和40目纯白石英砂，按照1：2：1的比例混匀，用清水冲洗至水不变浑浊，分装至20cm口径的盆栽盒(盒底垫上细孔纱布)，用大托盘盛放，并至于通风良好的地方晾干水分；

往大托盘中加入1/2hoagland营养液，待石英砂被营养液浸透，选取大小一致、饱满的油菜种子，消毒后均匀撒播在石英砂表面，每盆15颗种子，用干净的石英砂覆盖表面，并用保鲜膜封口进行保湿，待种子露尖即可撤除保鲜膜；

继续浇灌1/2hoagland营养液培养，待油菜幼苗长至四叶一心(期间定苗每盆3株)，将预备作低氮胁迫处理的植株浇灌一次清水培养两天后，换用氮源降至正常氮浓度1/20的低氮营养液进行浇灌培养；

同时配置50μm、100μm、300μm浓度的褪黑素进行叶面喷洒(在光照培养间熄灯前一小时内喷洒)，喷洒剂量保证叶面有水珠但不成柱流下即可，每3天喷洒一次，同时，设置低氮不喷施褪黑素作为对照，共计4个处理，处理两周后进行取样；

(2)检测植株地上部和根部干重和氮含量

干重测定：分别收获不同浓度褪黑素喷施处理两周后油菜植株的地上部和地下部，称取鲜重后105℃杀青30min，75℃烘干至恒重后称取干重。

根冠比：不同处理油菜植株的地下部分与地上部分干重的比值。

氮含量测定：油菜植株地上部和根部样品烘干磨碎后，准确称取0.1500g左右样品，用h2so4-h2o2法消煮后，过滤定容到50ml，用凯氏定氮法测定氮含量，计算氮累积量(naccumulation，mg/plant)＝生物量×氮含量。

(3)利用荧光定量pcr检测油菜硝酸盐转运蛋白nrt2基因家族的表达情况

根据前期研究工作中，采用hmmer(v3.1)软件的hmmbuild根据已知作物nrt2序列比对构建nrt2基因家族蛋白结构域的隐马尔可夫模型文件(hmmprofile)，采用软件hmmer(v3.1)软件的hmmsearch程序将blast比对上的蛋白序列进行结构域搜索并打分，设置阈值0.001进行过滤，筛选出油菜候选nrt2蛋白；将候选nrt2蛋白运用ncbicd-search工具进行蛋白结构域注释，同时对序列进行clustalw2比对，从比对信息中进一步确认序列的结构域，最后确定nrt2家族成员基因17个。鉴定出来的油菜nrt2家族基因根据：bn+拟南芥中已知同源基因名+一个小写字母，进行命名，例如，bnnrt2.2a与bnnrt2.2b为拟南芥nrt2.2基因在油菜中的两个同源候选基因。

采集不同浓度褪黑素处理两周的油菜叶片和根系，使用magen的rna提取试剂盒(hipureplatrnaminikit)提取rna，按照takara公司的带有去除基因组dna的反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser)的使用说明合成cdna，用rnaase-freeh2o将反转录产物稀释10倍，存放于-20℃备用。

通过ncbi在线设计内参及nrt2家族基因的定量pcr引物，检测引物的特异性。定量pcr使用premixextaqtmⅱ(takara)试剂进行，所有的反应使用cfx-connect(bio-rad，美国)仪器进行，并利用cfx-connect分析各个基因的扩增曲线和溶解曲线确定各个样品中的ct值，从而计算nrt2基因的相对表达量。

对不同处理油菜的地上部与地下部的干物质进行称重，结果表明，50μm、100μm、300μm三个浓度的褪黑素喷施处理，均提高了低氮条件下油菜地上部与根系中的干物质积累，并在100μm浓度处理下有最大的积累量(图2a，b)，进一步对干物质中的氮素进行检测，结果发现，地上部氮素的积累量在喷施褪黑素后，油菜地上部氮素积累量显著提高，而根系中的氮素积累量无明显差异(图2c)。

根据图3的结果表明，除了nrt2家族4个基因(bnnrt2.3a、bnnrt2.3b、bnnrt2.2b和bnnrt2.4a)未被检测到表达量外，褪黑素喷施处理能够提高低氮胁迫下油菜硝酸盐转运蛋白nrt2家族大部分基因的表达，其中，bnnrt2.1s主要在根系中表达，低氮处理下，除bnnrt2.1a外，剩余6个候选基因在mt处理下表达都出现上调，并在mt浓度为100μm时相对表达量最高；bnnrt2.7s主要在叶片中表达，低氮处理时，2个候选基因在褪黑素喷施处理下表达也都出现上调，并在褪黑素喷施浓度为50μm时相对表达量最高；bnnrt2.5s在根系和叶片中均有表达，同样在低氮处理下，表达水平受到褪黑素喷施处理的影响，在50μm时相对表达量最高。

综上所述，喷施褪黑素能够提高油菜的低氮胁迫耐受性，主要表现在提高油菜硝酸盐转运蛋白nrt2家族大部分基因的表达水平，进而使得油菜在有限的氮源供给下，能够获得更多的氮素累积，从而改善低氮胁迫下的油菜生长状况，且在褪黑素喷施浓度为100μm时能够获得最佳效果。