一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的方法与流程

本发明涉及茶树分子辅助育种领域，具体而言，涉及一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的方法。

背景技术：

茶树起源于我国，由茶树新梢加工而成的茶叶是世界范围内最受欢迎的三大非酒精饮料之一。提高茶叶中花青素含量有利于提高茶叶的保健功能，因此高花青素茶树品种具有较大的市场潜力和消费需求。因此培育高花青素、高儿茶素的茶树品种成为育种工作者的目标之一。

然而，当前对于高花青素茶树品种的选育方法主是从大量野生型或有性群体中筛选，对资源存量依赖程度高，且筛选过程受环境因素的影响很大，育种周期长。

在常规方法中，要鉴定茶树资源是否含有高花青素，可通过对新梢颜色的观察判断，通常，颜色越紫，花青素含量越高。但该法受到环境条件和生长时期的影响，温度高低、日照时长、紫外线强度、植株营养状况等因素都会较大幅度地改变新梢颜色和花青素含量；同时高花青素茶树品种只有幼嫩新梢花青素含量高，叶片成熟后紫色即退去，花青素含量也降到较低水平。

除了颜色观察外，也可通过化学方法更加准确地测得茶树资源样品的花青素含量，但该方法同样也受环境因素影响，此外需要较多数量的新梢样品和较为复杂的样品制备和分析过程，对于幼龄茶苗的筛选一般需等3-4年待其长大后才能采到足够的样品。

因此，需要一种不受环境影响、更加快捷、准确的筛选高花青素茶树资源的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的方法，旨在改善高花青素茶树筛选时间长，筛选准确率不高的问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物，所述核酸组合物包括(1)～(3)中的至少一种引物对：

(1)用于扩增序列如seqidno.1所示的ssr标记1的引物对1；

(2)用于扩增序列如seqidno.2所示的ssr标记2的引物对2；

(3)用于扩增序列如seqidno.3所示的ssr标记3的引物对3。

第二方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的用于筛选高花青素茶树的核酸组合物在选育高青素茶树中的应用。

第三方面，本发明实施例提供了一种选育高花青素茶树的方法，其包括采用前述实施例所述的核酸组合物对待选育样本的dna进行扩增。

第四方面，本发明实施例还提供了一种用于筛选高花青素茶树的试剂盒，其包括前述实施例所述的用于筛选高花青素茶树的核酸组合物。

本发明的有益效果是：

本发明实施例提供了一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物，该核酸组合物能够对三个ssr分子标记中的至少一种进行扩增，三个ssr分子标记的序列分别如seqidno.1～3所示。通过核酸组合物对待选育样本的扩增产物，可以不受环境和生长时期的影响，能够有效快速从待选育样本中鉴定出高花青素茶树资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明试验例中提供的引物对1～3的部分聚丙烯酰胺电泳图谱；

图2是本发明试验例中引物对1的聚丙烯酰胺电泳图谱；

图3是本发明试验例中引物对2的聚丙烯酰胺电泳图谱；

图4是本发明试验例中引物对3的聚丙烯酰胺电泳图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的方法具体说明。

本发明实施例提供了一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物，所述核酸组合物包括(1)～(3)中的至少一种引物对：

(1)用于扩增序列如seqidno.1所示的ssr标记1的引物对1；

(2)用于扩增序列如seqidno.2所示的ssr标记2的引物对2；

(3)用于扩增序列如seqidno.3所示的ssr标记3的引物对3。

ssr(simplesequencerepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellitedna)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。

优选地，所述核酸组合物包括如(1)～(3)中的至少两种引物对的组合。

优选地，所述核酸组合物包括有引物对1～3。

在可选实施方式中，所述引物对1的上游引物和下游引物分别如seqidno.4～5所示。

优选地，所述引物对2的上游引物和下游引物分别如seqidno.6～7所示。

优选地，所述引物对3的上游引物和下游引物分别如seqidno.8～9所示。

本发明实施例还提供了前述任一实施方式所述的用于筛选高花青素茶树的核酸组合物在选育高青素茶树中的应用。

应当理解，除前述实施方式所述的序列如seqidno.4～9所述的引物对1～3以外，任何将能够扩增上述ssr标记的引物对用于筛选高花青素茶树的应用均属于本申请的保护范围内。

在可选实施方式中，所述应用包括采用所述核酸组合物对待选育样本的dna进行扩增。

在可选实施方式中，所述待选育样本的亲本为‘紫嫣’。

‘紫嫣’是四川农业大学茶树育种团队选育的茶树新品种，于2018年获得中华人民共和国农业农村部品种登记证书，编号为gpd茶树(2018)510007。‘紫嫣’新梢中花青素含量可高达干物重的3.31％，是普通茶树品种的几十倍，具有极大的市场前景。为了更适宜于不同区域的栽培要求，有必要利用‘紫嫣’品种作为亲本，培育更多、更好的高花青素茶树品种。

本发明实施例还提供了一种选育高花青素茶树的方法，其包括采用如前述任一实施方式所述的核酸组合物对待选育样本的dna进行扩增。

在可选实施方式中，所述待选育样本的亲本品种为‘紫嫣’，这里的“品种”说指茶树品种，即采用四川农业大学茶树育种团队选育的茶树新品种‘紫嫣’作为母本所培育的。

需要说明的是，若采用本发明实施方式提供的引物对1、2或3对‘紫嫣’母本进行pcr扩增，会得到2种扩增产物，即在‘紫嫣’母本的基因组中，引物对1、2或3扩增的位点上，均对应一对等位基因。紫嫣子代(采用‘紫嫣’母本培育的子代)从‘紫嫣’母本中获取其中一条等位基因，从父本中获取另一条。

优选地，当采用引物对1进行扩增时，所述方法包括筛选具有大小为120bp的扩增产物的待选育样本。

具体地，当采用所述核酸组合物中的引物对1对‘紫嫣’母本进行扩增时，得到扩增产物1和扩增产物2，扩增产物1的大小为132bp，扩增产物2的大小为120bp，其中，扩增产物1和扩增产物2分别对应该位点上的一对等位基因，筛选具有所述扩增产物2的待选育样本，进一步地，本说明书中的“筛选具有所述扩增产物2的待选育样本”是指保留具有扩增产物2，缺失扩增产物1的待选育样本；由于父本影响，子代可能同时含有扩增产物1和2，筛选无效。

当采用引物对2进行扩增时，所述方法包括筛选具有大小为171bp的扩增产物的待选育样本。

具体地，当所述核酸组合物中的引物对2对‘紫嫣’母本进行扩增时，得到扩增产物3和扩增产物4，扩增产物3的大小为171bp，扩增产物4的大小为175bp，筛选具有所述扩增产物3的待选育样本，本说明书中的“筛选具有所述扩增产物3的待选育样本”是指保留具有扩增产物3，缺失扩增产物4的待选育样本。

当采用引物对3进行扩增时，所述方法包括筛选具有大小为180bp的扩增产物的待选育样本。

具体地，当所述核酸组合物中的引物对3对‘紫嫣’母本进行扩增时，得到扩增产物5和扩增产物6，扩增产物5的大小为174bp，扩增产物6的大小为180bp，筛选具有所述扩增产物6的待选育样本，本说明书中的“筛选具有所述扩增产物6的待选育样本”是指保留具有扩增产物6，缺失扩增产物5的待选育样本。

通过上述任一方式选择的子代同样具有高花青素的潜力。

优选地，当选用引物对1和2进行选育时，采用引物对1和2分别对待选育样本进行扩增，筛选出同时具有所述扩增产物2和扩增产物3的待选育样本。

当选用引物对1和3进行选育时，采用引物对1和3分别对待选育样本进行扩增，筛选出同时具有所述扩增产物2和扩增产物6的待选育样本。

当选用引物对2和3进行选育时，采用引物对2和3分别对待选育样本进行扩增，筛选出同时具有所述扩增产物3和扩增产物6的待选育样本。

当选用引物对1、2和3进行选育时，采用引物对1、2和3分别对待选育样本进行扩增，筛选出同时具有所述扩增产物2、扩增产物3和扩增产物6的待选育样本。

需要说明的是，在采用引物对1和2进行扩增时，选择具有扩增产物2和4的待选育样本的技术方案也在本申请的保护范围内。同理，在采用引物对1和3进行扩增时，选择具有扩增产物2和5的待选育样本的技术方案也在本申请的保护范围内。在采用引物对2和3进行扩增时，选择具有扩增产物3和5的待选育样本的技术方案也在本申请的保护范围内。

采用3种引物对的筛选能力显著>采用任意2种引物对的筛选能力>采用任意一种引物对的筛选能力。

本发明还提供了一种用于筛选高花青素茶树的试剂盒，其包括前述任一实施方式所述的用于筛选高花青素茶树的核酸组合物。

上述引物对1～3存在的前提下，任何含有该引物对的产品均在本发明的保护范围内，例如含有上述引物对的试剂或试剂盒。原因在于，其在应用时利用的是本发明所述引物对的特殊性，且得到的结果取决于本发明所述引物对的特殊性。

在可选实施方式中，该试剂盒还可保护以下至少一种试剂：pcr缓冲液、taq聚合酶和dntp。

以下结合具体实施例对本发明提供的一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的方法进行具体说明。

实施例1

本发明实施例提供了一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物，其包括引物对1～3，引物对1～3的序列如表2所示，引物对相对应的ssr标记的序列如表1所示。

表1ssr标记的序列

表2引物对的序列

实施例2

本实施例提供了一种选育高花青素茶树的方法，其包括采用实施例1提供的核酸组合物对待选育样本的dna和‘紫嫣’母本进行pcr扩增，具体包括以下步骤。

(1)提取样本dna

采用ctab法或商业试剂盒法提取待测样品叶片或干茶样品(‘紫嫣’子代)的基因组dna。

(2)pcr扩增

以步骤(1)提取‘紫嫣’子代的dna和‘紫嫣’母本作为pcr模板，采用实施例1提供的引物对1～3，分布进行pcr扩增。

pcr反应体系为：总体积为15μl，含有1×pcr缓冲液、200μm四种dntps、0.5utaq聚合酶、0.2μm上下游引物和40ngdna模板。

pcr反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变形30sec、58℃退火30sec、72℃延伸30sec，循环35次，③72℃最终延伸10min。

pcr完成后每管加入3μl6×loadingbuffer混匀，然后电泳。

(3)电泳

对步骤(2)中的pcr产物在8％-10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，具体如下：

首先，配制8％聚丙烯酰胺；然后按照8％聚丙烯酰胺：aps：temed＝1000:10:1的比例，配制一定量的凝胶；然后，一长一短两块玻璃板一边对齐，从缝隙缓慢加入胶液。灌胶时应不停摇晃胶液，避免其凝固。灌满胶后，排出气泡，及时插入大小合适的梳子；室温凝聚时间约为1h；玻璃板装载完成后，小心移去梳子，向电泳槽中加入0.5×tbe缓冲液。

每孔加2μlpcr产物混合液，在160v电压下，电泳100min，然后银染显色、拍照记录。

(4)结果分析

引物对1：

‘紫嫣’母本的扩增产物为：扩增产物1和扩增产物2，扩增产物1的大小为132bp(通过与marker比较估计而得，下同)，扩增产物2的大小为120bp，筛选具有所述扩增产物2的待选育样本；

引物对2：

‘紫嫣’母本的扩增产物为：扩增产物3和扩增产物4，扩增产物3的大小为175bp，扩增产物4的大小为171bp，筛选具有所述扩增产物3的待选育样本；

引物对3：

‘紫嫣’母本的扩增产物为：扩增产物5和扩增产物6，扩增产物5的大小为180bp，扩增产物6的大小为174bp，筛选具有所述扩增产物6的待选育样本。

试验例

用‘紫嫣’自然杂交种子培育了128株子代茶苗，将其种植于试验地中。采集三、四年生‘紫嫣’及其128株子代100mg叶片样品，采用实施例2的方法进行选育，选育的结果如图1～4所示。

具体地，图1为引物对1～3的部分电泳结果；图1中，每对引物有8个电泳道，其中，最左边泳道为母本‘紫嫣’，右边7泳道分别为7个不同的候选子代；图中数字编号“1～6”分别代指本文中的“扩增产物”，字母“p”代表来自父本的等位基因。

引物对1的电泳结果请参照附图2，引物对2的电泳结果请参照附图3，引物对3的电泳结果请参照附图4，图3～4中的数字为电泳孔的顺序号(1～90中的任意数字)。

引物对1～3对128份子代群体的分析结果如表3所示。

表3128份子代群体的分析结果

花青素含量测定

为了评估标记筛选对子代花青素含量的效果，且考虑到花青素含量受环境因素影响大，2018、2019连续两年对128株‘紫嫣’子代(三、四年生)采样，采样时间均为6月下旬，采样标准为一芽三叶。采用ph示差法测定花青素含量，用δa＝ph1.0(a524-a700)-ph4.5(a524-a700)差值表示花青素的相对含量。

测定结果：2018年128株的花青素相对含量为0.016～1.389，平均为0.3789；2019年128株的花青素相对含量为0.005～0.87，平均为0.2126。

筛选效果评价请参照表4。

表4筛选结果

由表4可知，引物对1，选择从母本中仅获得扩增产物2的单株(由于父本影响，子代可能同时含有扩增产物1和扩增产物2，这类型的在筛选中进行淘汰，因不能判断其从母本中获取的是扩增产物1还是扩增产物2，如图1中引物对1的第5和第7泳道)，共计44株，这44株花青素含量较筛选前(128珠的平均花青素水平)提高了30％(2018)和43％(2019)。

使用引物对2，选择从母本中仅获得扩增产物4的单株，共计26株，这26株花青素含量较筛选前提高了28％(2018)和36％(2019)。

使用引物对3，选择从母本中仅获得扩增产物5的单株，共计24株，这24株花青素含量较筛选前提高了33％(2018)和27％(2019)。

同时使用引物对1和引物对2，选择从母本中仅获得扩增产物2和扩增产物4的单株，共计10株，这10株花青素含量较筛选前提高了61％(2018)和75％(2019)。

同时使用引物对1和引物对3，选择从母本中仅获得扩增产物2和扩增产物5的单株，共计21株，这10株花青素含量较筛选前提高了60％(2018)和67％(2019)。

同时使用引物对2和引物对3，选择从母本中仅获得扩增产物4和扩增产物5的单株，共计14株，这14株花青素含量较筛选前提高了60％(2018)和57％(2019)。

同时使用引物对1～3，选择从母本中获得仅扩增产物2、扩增产物4和扩增产物5，共计6株，这6株花青素含量较筛选前提高了105％(2018)和117％(2019)。

因此，经本发明提供的3个分子标记及操作方法能够切实从‘紫嫣’子代中筛选出高花青素含量的茶树资源。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>四川农业大学

安徽农业大学

<120>一种用于筛选高花青素茶树的核酸组合物、其应用以及选育高花青素茶树的

方法

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