与豇豆抗豆象QTL位点紧密连锁的SSR分子标记及其在豇豆抗豆象育种中的应用的制作方法

本发明涉及一种豇豆抗豆象qtl位点，同时还涉及与豇豆抗豆象qtl位点连锁的ssr分子标记，以及该qtl位点及ssr分子标记在豇豆抗豆象分子标记辅助育种中的应用。本发明属于分子标记辅助育种技术领域，

背景技术：

豇豆(vignaunguiculata)属于豆科(leguminosae)豇豆属(vigna)，每年全球栽培面积超过500万hm²。在我国，随着产业结构调整，豇豆在干旱贫瘠及山区丘陵地带具有重要作用。但是，豇豆在田间和贮藏期较易受到豆象侵染危害，造成豇豆品质和质量下降，严重影响豇豆产业发展。

目前，国内外一般利用磷化铝熏蒸法防治豆象，该方法容易导致农药残留和环境污染，且对人畜高毒，因此，利用作物本身抗性，培育抗病品种是防治豆象最为经济有效的方法。然而，常规育种方法选择周期长，抗豆象鉴定工作繁琐。因此，需要发掘与抗豆象基因紧密连锁的分子标记，在育种后代苗期进行分子标记辅助选择，从而加速育种进程。

本发明利用引自国际热带农业研究中心(iita)的抗豆象豇豆品种pant-lobia-1，通过构建遗传研究群体、室内抗豆象鉴定，利用多态性ssr标记构建遗传连锁图谱定位豇豆抗豆象基因，为今后豇豆抗豆象分子标记辅助育种及抗豆象基因精细定位奠定基础。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点，通过豇豆抗豆象基因型分析和表现鉴定，定位到1个豇豆抗豆象qtl位点以及与其紧密连锁的2个ssr标记，该位点的效应值较高，可以用于豇豆抗豆象分子标记辅助育种。

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

本发明的一种与豇豆抗豆象qtl位点紧密连锁的ssr分子标记，所述豇豆抗豆象qtl位点命名为vubr5-1，位于第5连锁群xd1-14～cp185标记区间内，对应于豇豆2号染色体，与vubr5-1位点连锁的两个ssr分子标记为xd1-14和cp185，所述的ssr分子标记xd1-14为xd1-14f引物和xd1-14r引物扩增的片段，所述的ssr分子标记cp185为cp185f引物和cp185r引物扩增的片段，xd1-14f引物的核苷酸序列如seqidno：1所示，xd1-14r引物的核苷酸序列如seqidno：2所示；cp185f引物的核苷酸序列如seqidno：3所示，cp185r引物的核苷酸序列如seqidno：4所示。

其中，所述的豇豆抗豆象qtl位点的遗传距离为7.6cm，可解释6.37～6.96％的表型变异，加性效应为-5.30～-3.70。

进一步的，本发明还提出了所述的与豇豆抗豆象qtl位点紧密连锁的ssr分子标记在豇豆抗豆象分子标记辅助选择育种中的应用。

其中，优选的，所述与豇豆抗豆象qtl位点紧密连锁的ssr分子标记xd1-14和cp185分别通过xd1-14f引物和xd1-14r引物以及cp185f引物和cp185r引物在目标豇豆材料中能够扩增出相应片段，则目标豇豆材料含有抗豆象qtl位点。

进一步地，筛选上述豇豆抗豆象qtl位点及ssr分子标记的方法如下：

s1:构建ril群体：以抗豆象豇豆品种pant-lobia-1作父本，以感豆象亲本中豇1号作母本进行杂交，获得f1；f1连续自交，采用单粒传法构建f8代ril群体，该ril群体包括282个单株材料。

s2:抗豆象鉴定：ril群体每个株系分别接种绿豆象和四纹豆象成虫，且设置3次重复，以pant-lobia-1和中豇1号作为对照；当感豆象中豇1号全部籽粒被蛀食时开始调查，计算平均被害率。

s3：豇豆叶片dna提取：采集ril群体各株系和亲本的幼嫩三出复叶，利用改良的ctab法提取dna。

s4:多态性ssr标记筛选：以亲本dna为模板、利用3992个不同来源ssr标记筛选多态性ssr标记；根据上述电泳结果，筛选出182个在亲本间扩增条带稳定、清晰、差异显著的多态性ssr标记。

s5:连锁群的遗传连锁图谱：利用qtlicimapping4.0作图软件对182个多态性标记和282个ril株系基因型分型结果进行遗传连锁分析，以lod值作为标记分组依据，在lod＝10.3情况下，构建了一张包含182个标记、11个连锁群的遗传连锁图谱；

s6：豇豆抗豆象qtl定位：利用qtlicimapping4.0完全区间作图法，结合282个ril群体株系两个处理抗豆象表型鉴定结果和基因分型结果进行qtl定位分析，检测得到一个与抗豆象相关的qtl位点。

优选地，步骤s2中接种用的绿豆象、四纹豆象由河北省粮油作物研究所食用豆研究室繁殖保存。

优选地，步骤s2中，从开始养虫起30-50天时，观察记录各组籽粒材料的被害粒数；

步骤s3中，采集的每个株系幼嫩的三出复叶于-80℃保存备用；采用改良的ctab法提取dna，将提取的dna稀释到10ng/μl后作为pcr扩增的模板。

优选地，步骤s3中，pcr扩增程序中退火温度依ssr标记不同而不同，豇豆ssr标记退火温度为50℃、其他ssr标记退火温度为55℃。

优选地，步骤s5中，基因分型分析过程中，读板时，母本带型记作“0”，父本带型记作“2”，杂合带型记作“1”，空缺或其它带型记作“-1”。

优选地，步骤s3中，所述3992个不同来源ssr标记来自1972个绿豆转录组ssr标记、1100个小豆基因组ssr标记、920个豇豆ssr标记；步骤s4中，用于构建豇豆遗传连锁图谱的所述182个多态性标记中，62个来自绿豆转录组ssr标记、18个来自小豆基因组ssr标记、102个来自豇豆ssr标记。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过“中豇1号×pant-lobia-1”杂交形成稳定的ril作图群体，利用筛选出来的182个多态性标记，构建了一个包含11个连锁群、总长1065.234cm、密度适中的遗传连锁图谱，并定位了一个豇豆抗豆象qtl位点(lod值均大于3.5)，命名为vubr5-1，位于第5连锁群xd1-14～cp185标记区间内，标记间的遗传距离为7.6cm表型变异解释率为6.37～6.96％，加性效应为-5.30～-3.70；该豇豆抗豆象qtl位点及2个分子标记，在苗期就可以筛选材料，大大提高筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。

附图说明

图1为本发明vubr5-1位点在第5连锁群的位置及抗豆象qtl定位图；

图2为ssr分子标记xd1-14、cp185在ril群体部分株系中的扩增结果；“♀”指母本中豇1号，“♂”指父本pant-lobia-1。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1豇豆抗豆象qtl位点及ssr分子标记的筛选

1ril群体构建

以感豆象品种中豇1号作母本，抗豆象品种pant-lobia-1作父本进行杂交，获得f1，并对其进行抗豆象遗传分析。f1连续自交，采用单粒传法构建f8代ril群体，该群体包括282个单株材料，用于构建遗传连锁图谱和抗豆象qtl定位研究。

2亲本及ril群体材料抗豆象鉴定

从ril群体每个株系随机选取120粒正常籽粒，分成6份，每份20粒，形成6套抗豆象鉴定材料，分别接种绿豆象和四纹豆象成虫，即为2个处理，各设3次重复。以亲本作为对照。6套材料分别置于大塑料箱中，养虫室温度30(±1)℃，湿度55％-65％。感豆象亲本全部籽粒被蛀食开始调查(约30-50d)，调查记录鉴定材料的被害粒数，计算平均被害率。调查结果显示2种处理ril群体各株系被害率变异较大，呈连续性分布，符合数量性状遗传的频率分布特点；豇豆ril群体对绿豆象和四纹豆象的抗性均具有单向超亲分离现象，说明控制抗豆象的基因存在单向超亲分离，父本pant-lobia-1含有抗豆象增效基因。

3dna提取

采集两亲本及ril群体每个株系幼嫩的三出复叶置于2.0ml离心管内，采用ctab法提取叶片总dna，-20℃保存。

4ssr标记开发及多态性标记筛选

以亲本dna为模板，利用3992个不同来源ssr标记，进行pcr扩增，以相应的pcr扩增产物的电泳结果为依据，筛选出182个在“pant-lobia-1”和“中豇1号”之间扩增重复稳定，条带清晰，具有多态性的标记(见表1)。以这182个多态性标记构建豇豆遗传连锁图谱。

表1多态性ssr标记分析

5豇豆遗传连锁图谱构建

利用qtlicimapping4.0对182个多态性标记和282个ril株系基因型分型结果进行遗传连锁分析。以lod值作为标记分组依据，在lod＝10.3情况下，182个多态性标记可分成11个连锁群，与豇豆的二倍体染色体数目(2n＝22)相一致。通过前述方法，最终构建了一张包含182个标记、11个连锁群的遗传连锁图谱(见表2)，图谱总长为1065.23cm，标记间平均遗传距离为5.85cm。

表2图谱中连锁群标记及其分布

6豇豆抗豆象qtl定位分析

利用qtlicimapping4.0完全区间作图法(icim-add)，结合282个ril群体株系2个处理抗豆象表型鉴定结果和分子标记分型结果进行qtl定位分析。在2个处理中均能检测到一个与抗豆象相关的qtl位点，命名为vubr5-1(见图1)，位于第5连锁群xd1-14～cp185标记区间内、遗传距离为7.6cm，对应于豇豆2号染色体(见表3)，可解释6.37～6.96％的表型变异，加性效应为-5.30～-3.70，表明增效基因来自父本pant-lobia-1；同时，还筛选得到与vubr5-1位点连锁的两个ssr分子标记为xd1-14和cp185。

所述的ssr分子标记xd1-14为xd1-14f引物和xd1-14r引物扩增的片段，所述的ssr分子标记cp185为cp185f引物和cp185r引物扩增的片段，xd1-14f引物的核苷酸序列如seqidno：1所示，xd1-14r引物的核苷酸序列如seqidno：2所示；cp185f引物的核苷酸序列如seqidno：3所示，cp185r引物的核苷酸序列如seqidno：4所示。

xd1-14f:agaagagcgtctcgtcatta(seqidno：1)，

xd1-14r:ctcatccatctattctccca(seqidno：2)；

cp185f:tcatgggttaaatttgcttcaa(seqidno：3)，

cp185r:aaaccatgtggttgttgcac(seqidno：4)。

利用与vubr5-1位点连锁的两个ssr标记为xd1-14和cp185对ril群体20个株系进行电泳分析，其中第9、13和14株系表现父本基因型(见图2)，与抗豆象鉴定结果一致，这3个株系表现为抗豆象，抗虫率分别为67.5％、65％和87.5。

表3豇豆ril抗豆象qtl定位

注释：cp代表豇豆，br代表豆象，c代表绿豆象，m代表四纹豆象。

序列表

<110>河北省农林科学院粮油作物研究所

<120>与豇豆抗豆象qtl位点紧密连锁的ssr分子标记及其在豇豆抗豆象育种中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

agaagagcgtctcgtcatta20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

ctcatccatctattctccca20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

tcatgggttaaatttgcttcaa22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

aaaccatgtggttgttgcac20