一种同时检测番茄抗病基因Ty-1、Ty-3和Sw-5的引物组合及其多重PCR方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合及其多重pcr方法。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicum)是全球最重要的园艺经济作物之一，也是我国最主要的消费蔬菜。在番茄的种植过程中，会受到多种病害的影响，导致其减产10％-20％甚至绝收，严重威胁番茄产业的发展。

番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)是造成番茄产量和品质下降的一项主要病害，由携带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱进行传播。目前尚没有防治tylcv的特效药物，最好的办法就是选育抗番茄黄化曲叶病的优良品种，其中ty-1和ty-3基因是抗黄化曲叶病的主效基因，因此被广泛应用于抗病品种的选育。

番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus，tswv)是继tylcv之后危害番茄生产的第二大主要病害，一般通过蓟马传播。目前，已发现的抗tswv病的基因主要有8个，包括显性基因sw-1a、sw-1b、sw-5、sw-6和sw-7以及隐性基因sw-2、sw-3和sw-4，其中sw-1a、sw-1b、sw-2、sw-3、sw-4均为分离物专化型，抗性很快被克服，而且对其它番茄斑萎病毒属(tospovirus)病毒无抗性，sw-5基因对tswv不同小种具有很高的广谱抗性，因而被广泛应用于番茄抗斑萎病毒病育种中。

多重pcr技术是将多对引物同时加入反应试管中，在pcr反应过程当中，多对引物分别与其特异dna模板片段结合并延伸，实现对不同dna片段的同时扩增，极大地提高了pcr的反应效率，同时降低了检测成本。但多重pcr技术对引物浓度、taqdna聚合酶浓度、dntp浓度、反应的循环参数(包括退火温度、退火及延伸时间等)等实验条件要求极其严格。例如，引物反应浓度需根据实际扩增效率进行调整，taqdna聚合酶浓度需根据反应需要进行相应的增加。目前多重pcr技术在番茄抗病育种中已有一些研究，但能同时鉴定抗番茄黄化曲叶病基因ty-1、ty-3和番茄斑萎病毒基因sw-5的多重pcr技术体系目前未见报道。同时，现有技术体系中对抗番茄黄化曲叶病基因ty-1检测利用的多为caps分子标记，大都需要扩增后再进行酶切，所需时间长，耗费成本高。

综上，一种缩短检测时间的可同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合及其多重pcr方法有待研究。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一种同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合及其多重pcr方法，本发明的三对分子标记经验证可以很好地对番茄材料的基因型进行区分，不会出现假阳性的情况，本方案不仅可大大缩短检测时间，还可节省检测成本。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合，由三对引物组合而成，所述引物分别如下：

检测番茄抗病基因ty-1的引物为：

正向引物如seqidno:1所示，反向引物如seqidno:2所示；

检测番茄抗病基因ty-3的引物为：

正向引物如seqidno:3所示，反向引物如seqidno:4所示；

检测番茄抗病基因sw-5的引物为：

正向引物如seqidno:5所示，反向引物如seqidno:6所示。

同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合的多重pcr方法，包括如下步骤：

1)取番茄叶片，提取其dna；

2)以提取的dna为模板，利用ty-1、ty-3和sw-5基因的混合引物对，进行多重pcr反应，制得pcr产物；

3)将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断ty-1、ty-3和sw-5基因型。

进一步的，步骤2)中，多重pcr反应体系的配置如下：采用10μl反应体系，包括1μl10×taqbuffer，0.8μl2.5mmdntps，4μl混合引物，0.4μl2.5u/μltaqdnapolymerase，1μldna模板，2.8μlddh2o。

进一步的，步骤2)中，混合引物对包括ty-1引物对、ty-3引物对和sw-5引物对，各引物对在pcr反应体系中的浓度如下：ty-1引物对为100nm，ty-3引物对为70nm，sw-5引物对为150nm。

进一步的，多重pcr反应程序设置如下：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；随后72℃终延伸7分钟，pcr产物于4℃保存。

进一步的，步骤3)中，琼脂糖凝胶电泳包括以下步骤：将pcr产物在添加有0.1‰goldenview的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电压条件为120-140v，电泳时间45分钟，电泳结束后在凝胶成像系统上观察条带。

本发明的有益效果：

本发明采用的是pcr扩增反应后无需继续酶切的一对indel分子标记和两对scar分子标记，根据三对引物的扩增效率调整了引物在pcr反应体系中的浓度，优化了退火温度，调整了taqdna聚合酶浓度，三对分子标记经验证可以很好地对番茄材料的基因型进行区分，不会出现假阳性的情况，因此使用本方法不仅可大大缩短检测时间，还可节省检测成本。

附图说明

图1为三重pcr检测方法特异性测试结果；

图2为单重pcr检测方法特异性测试结果。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实施例对本发明进行具体描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.材料选择：实验所用番茄材料来自四川省农业科学院园艺研究所收集的8份高代纯合自交材料，序号及基因型如下表所示：

2.dna提取：采用ctab法提取植物总dna，具体操作步骤如下：

2.1研磨叶片：选取幼叶1-3片，去离子水洗净后，放入研钵，加入液氮，研磨，转入2ml离心管；

2.2预先配备ctab提取液：称取ctab20g和氯化钠81.9g溶解于100ml蒸馏水中，加入0.5mol·l^-1(摩尔每升)的edta(乙二胺四乙酸)40ml和1mol·l^-1的tris-hcl100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。使用前按体积100比1加入巯基乙醇；

2.3ctab液提取：加入60℃预热的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分钟，每10分钟混匀一次；

2.4去蛋白：加氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)500μl混匀，12000转离心10分钟，取上清液；

2.5沉淀dna：加-20℃冰浴的异丙醇500μl，混匀沉淀30分钟以上，8000转离心10分钟，去上清液，晾干；

2.6dna洗涤：对dna沉淀用75％乙醇清洗，晾干；

2.7dna溶解：加te溶解和稀释，dna浓度稀释至50-250ng·μl^-1，放4℃冰箱保存。

3.多引物对扩增

ty-1、ty-3及sw-5基因的引物序列及扩增片段长度如下：

对ty-1、ty-3、sw-5基因采用10μl反应体系，分别加入1μl10×taqbuffer，0.8μl2.5mmdntps，4μl混合引物，0.4μl2.5u/μltaqdnapolymerase，1μldna模板，2.8μlddh2o，其中，引物在pcr体系中的反应浓度如下：ty-1引物对为100nm，ty-3引物对为70nm，sw-5引物对为150nm。pcr扩增程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；随后72℃终延伸7分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物在添加有0.1‰goldenview的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电压条件为120-140v，电泳时间45分钟，电泳结束后在凝胶成像系统上观察条带。结果如图1所示。

对照例1

1.材料选择和dna提取均与实施例1一致。

2.单引物对pcr扩增

2.1对ty-1基因采用10μl反应体系，分别加入5μl2×taqmastermix，4μl引物工作液，1μldna模板，其中，引物在pcr体系中的反应浓度为200nm。pcr扩增程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；随后72℃终延伸7分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物在添加有0.1‰goldenview的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电压条件为120-140v，电泳时间45分钟，电泳结束后在凝胶成像系统上观察条带。结果如图2所示。

2.2对ty-3基因采用10μl反应体系，分别加入5μl2×taqmastermix，4μl引物工作液，1μldna模板，其中，引物在pcr体系中的反应浓度为200nm。pcr扩增程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，57℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃终延伸7分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物在添加有0.1‰goldenview的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电压条件为120-140v，电泳时间45分钟，电泳结束后在凝胶成像系统上观察条带。结果如图2所示。

2.3对sw-5基因采用10μl反应体系，分别加入5μl2×taqmastermix，4μl引物工作液，1μldna模板，其中，引物在pcr体系中的反应浓度为200nm。pcr扩增程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃终延伸7分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物在添加有0.1‰goldenview的1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电压条件为120-140v，电泳时间45分钟，电泳结束后在凝胶成像系统上观察条带。结果如图2所示。

对供试的8份番茄品种用三对单引物进行pcr扩增后，结果如图2所示。由图2可知，番茄材料t384、t213、t027经扩增后均产生了984bp、650bp和464bp的条带，表明这三份材料的基因型为ty-1纯合抗病、ty-3纯合抗病、sw-5感病；番茄材料t367、t202、2016经扩增后均产生了320bp、510bp的条带，表明这三份材料的基因型为ty-1感病、ty-3感病、sw-5感病；番茄材料t284经扩增后产生了650bp和464bp的条带，表明此材料的基因型为ty-1感病、ty-3纯合抗病、sw-5感病；番茄材料t231经扩增后产生了320bp、574bp的条带，表明此材料的基因型为ty-1感病、ty-3感病、sw-5纯合抗病。

对8份材料进行多重pcr反应的结果(图1)显示，8份番茄品种的多重pcr扩增结果同单基因扩增结果完全一致，且与田间抗病鉴定结果一致，证明多重pcr方法能够一次性对番茄ty-1、ty-3和sw-5基因进行检测，检测方便快速，检测结果可以用于番茄抗病分子标记辅助育种，同时可以通过该方法快速筛选出番茄抗病种质资源，并加以利用。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

序列表

<110>四川省农业科学院园艺研究所

<120>一种同时检测番茄抗病基因ty-1、ty-3和sw-5的引物组合及其多重pcr方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtatgcgtcgtgttagaaggtc23

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aatggtgacagaatcaagatccac24

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggtagtggaaatgatgctgctc22

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctctgcctattgtcccatatataacc27

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aattaggttcttgaagcccatct23

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ttccgcatcagccaatagtgt21