一种具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体为一种具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法。

背景技术：

奶牛乳腺炎又称为奶牛乳房炎，是奶牛的三大疾病之一，亦是兽医临床上常见且危害严重的疾病，其每年对农牧业养殖造成巨大的经济损失。曾有报道指出全球每年因各种奶牛乳腺炎疾病导致的损失高达3000亿元人民币。奶牛乳腺炎按照其分类，可以分为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。临床型乳腺炎的主要症状是乳腺有典型的红、肿、热、痛、乳汁中可见血色乳凝块，并且乳腺组织内伴有强烈的炎症反应，炎症基因如tnf-α、il-6、il-1β等急剧升高，其中基因il-1β在炎症的发展过程中发挥重要推动作用，进而加剧炎症反应进程。隐性乳腺炎其临床症状不明显，但是其体细胞数升高，可达到50万～500万之间。

微生物感染是导致奶牛乳腺炎发生的主要病因。大肠杆菌是导致奶牛乳腺炎发生的主要病原微生物，内毒素脂多糖(lps)其主要的毒力成分。以lps诱导的小鼠乳腺炎模型被广泛用于乳腺炎疾病的机制研究和临床候选药物的筛选。因此以lps诱导的小鼠乳腺炎模型为研究基础较为科学合理。

目前抗生素仍然是治疗奶牛乳腺炎的主要办法，但是抗生素会造成牛奶中抗生素残留，容易导致耐药菌的出现，并且抗生素只是杀灭细菌，其并不能有效的控制炎症反应。此外随着国家限抗令的推行，寻找新的治疗奶牛乳腺炎的药物显得十分迫切。近年来中药成分治疗奶牛乳腺炎是一个新兴的方向，其具有来源广、不会引起抗生素残留、不易引起细菌耐药等优点。具栖冬青苷(pedunculoside，pe)提取于冬青科植物的树皮，其具有广泛的药理活性，如清热解毒、消肿止痛的功效。但目前还没有关于具栖冬青苷对奶牛乳腺炎治疗的报道。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

根据目前关于治疗乳腺炎的不足之处，本发明提供了一种具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，本发明具备药物提取材料来源广泛、治疗乳腺的效果明显、不引起牛奶中抗生素残留、不易引起细菌耐药等优点，有利于解决奶牛乳腺炎治疗过程中抗生素残留、耐药细菌的产生以及备选治疗药物不足等问题。

(二)技术方案

为达到上述要求，本专利提供以下实验步骤：一种具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，具体操作如下：

s1、选择8周龄的icr小鼠进行合笼，每笼1公2母，待小鼠分娩后3至7天内完成小鼠乳腺炎症模型的构建，实验分为5组，分别是空白对照组(nt)、单独给药组(pe)、乳腺炎模型组(lps)、药物治疗组(lps+pe)、地塞米松阳性对照组(lps+dex)，每组9只小鼠。

s2、具栖冬青苷以腹腔注射的方式给药2次，给药浓度为10mg/kg，分别在注射lps前1h和注射lps12h后给药。

s3、小鼠经过lps注射24h后收集乳腺样品，一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作，并观察乳腺组织的病理损伤情况。

s4、取一部分乳腺组织用于测定乳腺组织中炎性基因il-1β的表达情况，评估乳腺组织内炎症反应的严重程度。

优选的，所述小鼠乳腺炎模型的构建方法为：用浓度为45mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠，并将其固定。在第四对乳区周围用75％的酒精消毒，用剪刀剪掉乳头约1cm，然后用量程为100μl的微量注射器，注射进乳头50μl且浓度为0.2mg/ml的lps。lps注射24h后收集乳腺样品并保存在-80℃冰箱中。

优选的，所述石蜡切片的制作过程如下：提前用pbs配置好浓度为4％的甲醛溶液。取出新鲜的乳腺组织用pbs涮洗其溢出的乳汁，并用滤纸蘸干，然后放入甲醛溶液中固定48h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、包埋、切片、h&e染色等步骤获取石蜡切片。最后评估乳腺组织的病理损伤情况。

优选的，步骤s4中荧光定量pcr的步骤为：将新鲜的乳腺组织放在1.5ml离心管中研磨并加入trizol，反转录得到cdna。以20μl体系为单位分别加入上游引物1μl、下游引物1μl、10倍稀释的cdna模板8μl、pcrmix10μl并放入荧光定量pcr仪器内。获取数据后分析乳腺组织内炎性基因il-1β的表达情况。

具栖冬青苷能够用于治疗奶牛乳腺炎疾病。

(三)有益效果

1、该具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过乳腺组织石蜡切片、h&e染色的方法，从病理组织学的角度出发，证明了具栖冬青苷减少了小鼠乳腺组织的炎性细胞的浸润、缓解了乳腺腺泡的萎缩、缓解了腺泡间质之间的增厚。有力的证明了具栖冬青苷对lps诱导的小鼠乳腺炎具有良好的治疗作用。

2、该具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过注射的方式给药，以利于药物中有效成分的充分吸收。具有方便携带、抗炎效果明显、不易产生细菌耐药性、不产生抗生素残留等优点。

3、该具栖冬青苷用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过分子生物学-荧光定量pcr的实验方法，检测了乳腺组织中促炎基因il-1β的表达情况。实验结果表明具栖冬青苷有效的降低了炎性基因il-1β的表达。该结果从基因层面上证实了具栖冬青苷对lps诱导的小鼠乳腺炎具有较好的治疗作用。

附图说明

图1、为本专利中具栖冬青苷的分子结构示意图，其分子式为c36h58o10、分子量为650；

图2、为本专利中具栖冬青苷在lps诱导的小鼠乳腺炎模型中对乳腺组织病理损伤影响的结果图；

图3、为具栖冬青苷在lps诱导的小鼠乳腺炎模型中对乳腺组织的病理损伤评分图；

图4、为具栖冬青苷在lps诱导的小鼠乳腺炎模型中对炎性细胞基因il-1β表达影响的示意图；

具体实施方式

结合本专利中所提供的数据，下面将对本发明实施例中的技术方案进行完整、准确的描述。本专业领域内的其他技术人员在没有做出突破性成果的前提下，所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范畴。

具栖冬青苷治疗乳腺炎的实验具体过程包括以下步骤：

s1、选择8周龄的icr小鼠进行合笼，每笼1公2母，待小鼠分娩后3至7天内完成小鼠乳腺炎症模型的构建，实验分为5组，分别是空白对照组(nt)、单独给药组(pe)、乳腺炎模型组(lps)、药物治疗组(lps+pe)、地塞米松阳性对照组(lps+dex)，每组9只小鼠。小鼠乳腺炎症模型的构建方法为：用浓度为45mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠，并将其固定。在第四对乳区周围用75％的酒精消毒，用剪刀剪掉乳头约1cm，然后用量程为100μl的微量注射器，注射进乳头50μl且浓度为0.2mg/ml的lps。lps注射24h后收集乳腺样品并保存在-80℃冰箱中。

s2、具栖冬青苷以腹腔注射的方式给药2次，给药浓度为10mg/kg，分别在注射lps前1h和注射lps12h后给药。

s3、小鼠经过lps注射24h后收集乳腺样品，一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作，并观察乳腺组织的病理损伤情况。石蜡切片的制作过程如下：提前用pbs配置好浓度为4％的甲醛溶液。取出新鲜的乳腺组织用pbs涮洗其溢出的乳汁，并用滤纸蘸干，然后放入甲醛溶液中固定48h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、包埋、切片、h&e染色等步骤获取石蜡切片。最后评估乳腺组织的病理损伤情况。

s4、取一部分乳腺组织用于测定乳腺组织的炎性基因il-1β表达水平。

具体荧光定量pcr的步骤为：将新鲜的乳腺组织放在1.5ml离心管中研磨并加入trizol，反转录得到cdna。以20μl体系为单位分别加入上游引物1μl、下游引物1μl、10倍稀释的cdna模板8μl、pcrmix10μl并放入荧光定量pcr仪器内。获取数据后分析乳腺组织内炎性基因il-1β的表达情况。

通过以上实验操作得到以下实验结果，统计分析如下：

图1为本专利中具栖冬青苷的分子结构示意图，其分子式为c36h58o10、分子量为650；

由图2可以看出，单独给药组(10mg/kg)的乳腺腺泡轮廓清晰完整、腺泡之间的基质厚度正常、腺泡内无炎性细胞浸润其乳腺结构与无处理组相似。而lps显著的促使乳腺腺泡萎缩、促使炎性细胞浸润、破坏了乳腺的正常结构。在注射具栖冬青苷后，这些病理症状得到了明显的改善，该结果证明具栖冬青苷对lps诱导的小鼠乳腺炎具有明显的治疗作用。

图3为依据乳腺组织的病理损伤程度而得到的病理组织损伤评分结果。评分标准为，无损伤为0分、轻度损伤为1分、中度损伤为2分、重度损伤为3分、极度损伤为4分。评分由三位病理评分经验丰富的专业内人员完成。从评分结果我们可以看出，具栖冬青苷可以显著的缓解由lps引起的乳腺组织损伤(**p<0.01)。

由图4的结果我们可以得出，lps显著的引起乳腺组织内炎性基因il-1β的升高(#p<0.01)。表明lps模型组内发生了严重的炎症反应。而具栖冬青苷处理后，乳腺组织内炎性基因的表达水平显著下降，表明炎症反应得到了有效的缓解(**p<0.01)。该结果证明具栖冬青苷通过抑制il-1β基因的表达以达到治疗lps诱导的小鼠乳腺炎的作用。