一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法与流程

一种头孢菌素c酰化酶的发酵方法
技术领域
1.本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种头孢菌素c酰化酶的发酵方法。


背景技术：

2.7-氨基头孢氨酸(7-aca)是合成头孢类抗生素的关键性中间体，在其活性基团连接不同的侧链就构成不同性质的头孢类抗生素。世界上医药工业发达的国家均十分重视7-aca的研究和生产。
3.一步酶法是生产7-aca的常用技术。头孢菌素c酰化酶(cpc酰化酶，cca)是一步酶法生产7-aca的关键酶，能够将原料头孢菌素c(cpc)直接催化，脱去7-位的d-d氨基己二酰侧链，生成7-aca。作用分子式如下：
[0004][0005]
头孢菌素c酰化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性，研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株，或者构建基因工程菌株(内源信号肽dse4介导头孢菌素c酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达，华东理工大学学报(自然科学版)，2015)。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道，主要是因为头孢菌素c酰化酶的发酵过程非常复杂，涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、补料种类、补料时机、补料速度等诸多条件相互配合，优化获得一个比较好的发酵方法较为困难。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是，提供一种简单、高效的头孢菌素c酰化酶的发酵工艺，具体技术方案包括：
[0007]
一种头孢菌素c酰化酶的发酵方法，包括：
[0008]
(1)移种：将种子液移入发酵培养基中；
[0009]
(2)发酵：发酵60h，维持ph值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37
±
1℃，第8-60h的发酵温度25
±
1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；
[0010]
步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/1、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；
[0011]
步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；
[0012]
所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤od
600
≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖；
[0013]
所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100
±
1l/h；第8-18h，流加补入甘
油75
±
1l/h；第18-30h，流加补入甘油85
±
1l/h；第30-40h，流加补入甘油90
±
1l/h；第40-50h，流加补入甘油95
±
1l/h；第50-60h，流加补入甘油100
±
1l/h。
[0014]
如前述的方法，步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。
[0015]
如前述的方法，所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤od
600
≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％的乳糖。
[0016]
如前述的方法，所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100l/h；第8-18h，流加补入甘油75l/h；第18-30h，流加补入甘油85l/h；第30-40h，流加补入甘油90l/h；第40-50h，流加补入甘油95l/h；第50-60h，流加补入甘油100l/h。
[0017]
如前述的方法，步骤(1)的菌体接种量为1.25％(v/v)。
[0018]
如前述的方法，步骤(1)之前还包括种子制备步骤，所述摇瓶菌种制备的步骤为：
[0019]
a.制备摇瓶菌悬液：取出甘油管，自然解冻后接种至无菌摇瓶中的培养基，ph7.0-7.2、37℃条件下摇床培养15-17h；
[0020]
b.制备一级种子：将步骤a中的摇瓶菌悬液接种至一级种子罐中的一级培养基，在ph6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
[0021]
c.制备二级种子：将步骤b的一级种子接种至二级种子罐中的二级培养基，在ph6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
[0022]
步骤a所述培养基含有蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l；
[0023]
步骤b所述一级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l；
[0024]
步骤c所述二级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l。
[0025]
如前述的方法，步骤(3)之后还包括酶活检测步骤。
[0026]
如前述的方法，所述酶活检测步骤为：
[0027]
富集发酵菌体，加水定容至原体积，均质后，得到均质液，再使用头孢菌素c作为底物，使用电位滴定的方法测定酶活。
[0028]
现有技术(cn105112392a)中，所得发酵产物中，细胞内头孢菌素c酰化酶的活性为5000u/l，即5u/ml。本发明的发酵方法，得到的发酵菌体的均质液的头孢菌素c酰化酶活性高达170u/ml以上。
[0029]
另外，本发明的方法对应补料工艺无需参考发酵液的od值，节省了由od值实时监测所产生的成本。
[0030]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0032]
实施例中使用的生产菌种为bl21(de3)大肠杆菌表达菌株，是外源基因表达头孢菌素c酰化酶的重组大肠杆菌。该大肠杆菌表达菌株是以t7rna聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，t7rna聚合酶表达受控于de3区的lacuv5启动子，该区整合于bl21
的染色体上。
[0033]
实施例1 cpc酰化酶发酵
[0034]
1.方法
[0035]
(1)制备摇瓶菌悬液
[0036]
摇瓶培养基含有：蛋白胨10g/l酵母膏5g/l氯化钠10g/l，生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在ph7.0-7.2、37℃摇床培养15-17h。
[0037]
(2)制备一级种子
[0038]
一级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在ph6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h。
[0039]
(3)制备二级种子
[0040]
二级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，纯种摇瓶菌悬液接种至二级种子罐，在ph6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h。
[0041]
(4)发酵
[0042]
发酵罐配比：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l。
[0043]
取步骤(3)所得的二级种子，按照1.25％(v/v)的移种量移种至发酵培养基中发酵60h，0-7h37℃，8-60h25℃ph6.80-7.20。
[0044]
期间补入乳糖、甘油。
[0045]
补入乳糖工艺：培养8h且40≤od
600
≤50，时一次性补入1％乳糖，在6-60h随补料流加1％的乳糖。
[0046]
补入甘油工艺：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升至100％，即开始流加补入甘油，流加速度100l/h；从第8h开始，流加甘油的速度为：第8-18h75l/h，第18-30h85l/h，第30-40h90l/h，第40-50h95l/h，第50-60h100l/h。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％；
[0047]
(5)发酵结束取1.5l发酵液，离心机6000rpm，离心25min收集细胞，纯化水定容至原体积后均质机80mpa高压均质，均质2遍，得到头孢菌素c酰化酶均质液。
[0048]
(6)取均质液1ml，10000rpm5min，离心后取适当上清，加入cpc底物，底物浓度为5mmol/i，使用电位滴定仪滴定，用0.1mol/l氢氧化钠标准滴定液滴定7min，滴定过程中始终保持溶液ph，弃去前2min，记录后5min氢氧化钠标准滴定液的消耗量；每消耗0.1mol/l氢氧化钠，相当于产生0.1mol/l的7-aca，对应1u酶活，通过计算得到均质液酶活。
[0049]
2.结果
[0050]
表1展示了本发明补料方式的2组平行实验的发酵结果，本发明对应的放罐均质液酶活可以高达170u/ml以上。
[0051]
表1实施例1发酵结果
[0052]
乳糖用量(kg)甘油加量(kg)放罐od
600
放罐均质液酶活(u/ml)2402500147
±
34.24173
±
7.072402500153
±
34.24187
±
107.07
[0053]
实施例2 cpc酰化酶发酵
[0054]
1.发酵方法
[0055]
(1)制备摇瓶菌悬液
[0056]
摇瓶培养基含有：蛋白胨10g/l酵母膏5g/l氯化钠10g/l，生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在ph7.0-7.237℃摇床培养15-17h。
[0057]
(2)制备一级种子
[0058]
一级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，计料体积30l。纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在ph6.9-7.5、37℃条件下摇床培养5-6h。
[0059]
(3)制备二级种子
[0060]
二级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，计料体积1500l，纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在ph6.9-7.5、37℃条件下摇床培养5-6h。
[0061]
(4)发酵
[0062]
发酵罐配比：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l，计料体积12000l。
[0063]
取步骤(3)制备的二级种子，按照1.25％(v/v)的移种量移种至发酵培养基中发酵60h，0-7h37℃，8-60h25℃ph6.80-7.20。
[0064]
期间补入乳糖、甘油。
[0065]
补入乳糖工艺：培养8h且40≤od
600
≤50时一次性补入1％乳糖(占发酵液体积12000l)，在6-60h随补料(甘油)流加1％的乳糖(占发酵液体积12000l)。
[0066]
补入甘油工艺1：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升至100％，即开始流加补入甘油，流加速度100l/h；从第8h开始，流加甘油的速度为：第8-18h75l/h，第18-30h85l/h，第30-40h90l/h，第40-50h95l/h，第50-60h100l/h。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％。
[0067]
补入甘油工艺2：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升即开始以89l/h的速度流加补入甘油。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％；
[0068]
补入甘油工艺3：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，此时定搅拌转速85rpm，调整补料量，控制溶氧20％-30％，直至第18h。18h至补料结束放罐期间，根据od
600
增长速度调整补料：若每小时增长1.5-2.0，维持前1小时的补料速度；若od
600
增长速度小于1.5时，增加补料3-5l/h。对应调整搅拌转速，控制溶氧在20％-30％范围内。补料完毕即停车放罐。
[0069]
(5)发酵结束取1.5l发酵液，离心机6000rpm，25min离心收集细胞，纯化水定容至原体积后均质机80mpa高压均质，均质2遍，得到cpc酰化酶均质液。
[0070]
(6)取均质液10000rpm5min，取离心后上清，加入cpc底物，底物浓度20mol/l，使用电位滴定仪滴定时间为5min，到达滴定终点，每0.1mol/l氢氧化钠消耗对应1u/ml酶活，通过计算得到均质液酶活。
[0071]
2.结果
[0072]
如表2所示，使用补料工艺三由于严格按照od值调整补料，可以使放罐均质液酶活
达到202u/ml；该过程需要时刻监控od值，且要频繁的调整补料量，从而需要频繁的调整搅拌转速来控制溶氧量，使得溶氧满足工艺要求，该方法对与检测数据要求很高且控制过程精细要求高，过程繁琐，放罐指标不稳定且生产成本较高。
[0073]
而补入甘油工艺1(本发明)可以使放罐均质液酶活达到176u/ml；补料方式相对确定，培养过程简单易操作。综合起来看，该补料工艺更适合工业生产。
[0074]
表2三种补料工艺对比效果
[0075][0076]
综上所述，本发明的发酵方法中，补加甘油和乳糖，并对补加量及补加方式进行特殊选择，可以显著提高cpc酰化酶均质液酶活，降低生产成本，工业应用前景良好。