对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素的制作方法

本发明涉及林业害虫的生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素。

背景技术：

在林业上，鞘翅目天牛科墨天牛属昆虫是松材线虫的主要传播媒介（motaetal.,2008;futai,2013），也是主要的蛀干害虫，又被称为次期性害虫，生活在韧皮部或者木质部之中。在韧皮部啃食输导组织，阻止树木对养分的吸收，在木质部啃食边材，对水分的运输造成阻碍，不严重的会造成树木发育不良，严重的导致树木整株坏死。蛀干害虫由于其生活习性，除了成虫会在树外活动，其它虫态几乎都生活在树木的韧皮部或者是木质部中，极其隐蔽，也较难防治。鉴于当前的防治方法效果不佳，其中生物防治具有绿色环保，持效期长的优点，进一步寻找有效的微生物制剂对松墨天牛等墨天牛属昆虫进行生物防治，对于遏制松材线虫病的扩散蔓延具有重要的意义。

苏云金芽胞杆菌（简称bt）是一种昆虫病原微生物，对16个目3000多种害虫有活性，被广泛地应用于农、林和卫生害虫的生物防治中（adangetal.，2014）。bt的杀虫活性主要依赖于其在芽胞期产生的伴孢晶体蛋白（简称icps），主要是cry毒素（deistetal.,2014）。不同类别的cry毒素的杀虫谱表现出显著的特异性，如cry1、cry9、cry15类毒素对鳞翅目昆虫有效，cry3、cry7、cry8和cry34/35类毒素对鞘翅目的幼虫有活性（bravo,1997）。其中，有报道表明，cry3a类毒素对天牛科幼虫有效，但其杀虫活性不高（chenetal.,2005）。因此，为有效防治天牛科墨天牛属昆虫，迫切需要解决cry3a毒素对其弱毒的问题。

在cry3aa毒素作用过程中，当其被昆虫摄取后，原毒素会被昆虫肠道蛋白酶酶解活化出55kda大小的活性片段，该片段对鞘翅目昆虫表现出杀虫活性（walteretal.,2008;lietal.,2011）。然后，单体的活性毒素寡聚化形成的低聚物与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（bbnv）上的受体结合，从而引起膜穿孔并导致细胞死亡（pardo-lópezetal.,2013）。而有研究表明，天牛肠道蛋白酶主要为胰蛋白酶，然而，73kdacry3aa毒素无法被天牛的肠道蛋白酶有效酶解活化出55kda的活性片段，即存在酶解活化障碍。已有研究证明cry3aa原毒素domaini的α-helix3和α-helix4之间的loop区域是被蛋白酶切割释放活性片段的区域，而在该区域缺乏胰蛋白酶的识别位点（oppertetal.,1997）。此外，还发现55kda的cry3aa活性片段很容易被胰蛋白酶过度酶解为较小短肽，从而使得毒素对天牛失去活性。这表明在cry3aa毒素的其他结构域中存在较多的能够被胰蛋白酶识别的位点，从而使得毒素被过度酶解。这些结果表明昆虫肠道蛋白酶对cry3a毒素的酶解活化障碍和过度酶解是造成其对目标昆虫弱毒的主要原因。因此，为解决昆虫肠道蛋白酶对毒素的酶解活化障碍和过度酶解现象，本发明以cry3aa2基因为对象，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型cry毒素，是一项具有重大意义和应用价值的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素，以seqidno.4（cry3aa2）为支架毒素蛋白，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型cry毒素。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

对墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素，所述bt毒素为毒素brc1912蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种编码如所述bt毒素的基因，所述基因其核苷酸序列如seqidno.1所示。

与在seqidno:4所列出的毒素cry3aa2蛋白（其基因序列如seqidno.3所示）的初始氨基酸序列相比，为促进昆虫肠道蛋白酶将毒素酶解活化出更多的55kda大小的活性片段，本发明的brc1912蛋白的结构域i中的α-helix3和α-helix4之间的loop区域“缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸”（第155和第157个氨基酸之间的序列）替换为短肽序列“苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸”，增加了胰蛋白酶的识别位点精氨酸（图1）。

与在seqidno:4所列出的毒素cry3aa2蛋白的初始氨基酸序列相比，为克服昆虫肠道蛋白酶对毒素的过度酶解，本发明的brc1912蛋白中包括了五个位点的氨基酸突变，将五个胰蛋白酶的识别位点突变为不被识别的丙氨酸，分别为：结构域i中在位置65处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置70处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置231处由赖氨酸置换成丙氨酸，结构域ii中在位置468处由赖氨酸置换成丙氨酸，以及结构域iii中在位置596处由赖氨酸置换成丙氨酸（图1）。

结构域i的基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示；

结构域ii基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.7和seqidno.8所示；

结构域iii基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示。

所述的毒素brc1912的三个结构域，这三个结构域中的任意一个结构域均可与bt毒素的其他家族毒素的结构域任意组合获得对鞘翅目具有高毒力的毒素。

所述的bt毒素的其他家族毒素，这些毒素均具有三级结构域，包括但不限于cry3、cry7、cry8类毒素。

所述对墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素在防治天牛科墨天牛属昆虫中的应用。

所述墨天牛属昆虫包括松墨天牛（monochamusalternatusenda、monochamusalternatusalternatus）、云杉花墨天牛（monochamussaltuarius）、云杉小墨天牛（monochamussutor）、卡来罗纳黑天牛（monochamuscarolinensis）、密毛白点墨天牛（monochamusscutellatus）和松墨斑墨天牛（monochamusmutator）和樟子松墨天牛（monochamusgalloprovincialis）。

所述的对墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素在防治鞘翅目害虫中的应用。

所述鞘翅目害虫包括赤拟谷盗（triboliumcastaneum）、红棕象甲（rhynchophorusferrugineus）、椰心叶甲（brontispalongissima）、星天牛（anoplophorachinensis）、光肩星天牛（anoplophoraglabripennis）和云斑天牛（batocerahorsfieldi）。

本发明的brc1912晶体蛋白用于墨天牛属昆虫及其他鞘翅目昆虫的生物测定。在具体实施例中，优选地用于防治松墨天牛（monochamusalternatusalternatus）、云杉花墨天牛（monochamussaltuarius）、云杉小墨天牛（monochamussutor）、光肩星天牛（anoplophoraglabripennis）、云斑天牛（batocerahorsfieldi）和红棕象甲（rhynchophorusferrugineus）。

本发明的优点在于：

本发明的brc1912毒素与seqidno:4所列出的毒素cry3aa2蛋白在体外酶解活化效率、杀虫活性和目标昆虫种类谱相比，brc1912毒素能够克服被昆虫肠道蛋白酶过度酶解的现象，即酶解活化出更多的55kda大小的活性片段，从而提高了对目标昆虫的杀虫活性，且表现出更大的目标昆虫种类谱。

附图说明：

图1为brc1912与cry3aa2蛋白氨基酸序列的比对。

图2为通用载体pgex-6p-1的质粒图谱。

图3为pht304-g穿梭载体图谱。

图4为brc1912晶体的显微镜形态特征图。

图5为brc1912晶体蛋白的sds-page的结果图。其中泳道1为蛋白marker，泳道2为brc1912晶体蛋白。

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。应说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，并不对本发明的范围构成任何限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的情况下，对本发明做出改进，变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明所附权力要求保护范围内。

实施例1brc1912基因的克隆及其工程菌的构建

对cry3aa2基因上五位点进行氨基酸的突变获得brc1912基因序列，分别为：在位置65处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置70处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置231处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置468处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），以及在位置596处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a）。且domaini中的α-helix3和α-helix4之间的loop区域短肽序列“缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸”（“vss”）（第155和第157个氨基酸之间的序列）替换为短肽序列“苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸”（“fmr”）（图1）。生物合成的brc1912基因直接克隆在通用载体pgex-6p-1的bamhi和xohi位点上（图2），将该质粒转入大肠杆菌中进行表达。

另一方面，以克隆在pgex-kg-6p载体上的brc1912基因为模板进行pcr扩增，pcr扩增引物为：

cry3aa2-c-f:5’-ccctcgagatgaatccgaacaatcgaagt-3’

cry3aa2-c-r:5’-cgggatccaagctttcagtcagtcatgga-3’

pcr扩增纯化产物通过xhoi和bamhi酶切位点连入pht304-g载体中。并将该质粒电转入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株hd73^cry-，获得能够表达对松墨天牛幼虫具有高毒力的brc1912晶体蛋白的工程菌cry3aa-c-bt，该菌株已于2020年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类号为苏云金芽孢杆菌（bacillusthuringiensis），保藏编号为cgmccno.19338，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2本发明所述的重组的pht304-g穿梭载体的构建

以苏云金杆菌/大肠杆菌的pht304穿梭载体为基础，设计合成cry3aa2基因的启动子，包括启动cyt1a基因的bti和btii启动序列，stab-sd序列以及多克隆位点序列（xhoi，sphi，xbai，bamhi，kpni和saci）。该合成片段通过hindiii和ecori酶切位点连入pht304质粒中（图3）。

实施例3brc1912毒素在苏云金芽胞杆菌中的表达及纯化

将获得的cry3aa-c-bt工程菌（cgmccno.19338）接入pm培养基（酵母粉2g/l，胰蛋白胨10g/l，kh2po41g/l，feso4•7h2o0.02g/l，mgso4•7h2o0.3g/l，mnso4•7h2o0.02g/l，znso4•7h2o0.02g/l，ph7.0）中30℃培养至晶体释放期（60h），经过受体菌体，晶体蛋白的溶解后，利用盐酸将ph调至4.7获得brc1912晶体蛋白（图4、5）。

实施例4brc1912毒素在大肠杆菌中的表达及纯化

将毒素brc1912转入大肠杆菌的工程菌在lb培养基中37℃培养至对数期并加入iptg至终浓度为0.8nm，恒温培养诱导表达蛋白，依照glutathionesepharose4bgst产品说明书进行蛋白纯化。

实施例5brc1912毒素对松墨天牛（monochamusalternatusalternatus）的生物测定

天牛人工饲料的配方：麸皮60g，虾粉10g，山梨酸2g，苯钾酸钠4g，酵母粉25g，琼脂30g，松树韧皮部100g，松树木质部50g，蔗糖40g，水300ml。

生物测定方法：松墨天牛幼虫分别培养在含有0.1g人工饲料的500µl离心管中。每一支离心管对应一只三龄初期幼虫，分别加入150µl不同浓度梯度的cry3aa2原毒素和brc1912毒素（1000、500、250、125、62.5和6.25µg/ml)。各浓度梯度三组重复，每组含有10只幼虫作为重复（各浓度梯度测试30只）。以单蒸水作为空白对照。所有离心管放置在25℃，75%湿度的环境下培养，并对其进行光周期16:8处理（光照培养16小时，黑暗培养8小时）。观察各组幼虫的生长状况并在两周后计算各组幼虫死亡率，运用概率单位分析计算出致死中浓度（lc50）。brc1912毒素对松墨天牛三龄初期幼虫两周的lc50值为12.3μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了9.5倍（详见表1）。

表1cry3aa2和brc1912毒素对松墨天牛幼虫的杀虫活性

实施例6brc1912毒素对云杉花墨天牛（monochamussaltuarius）的生物测定

实验设计：将纯化的cry3aa2原毒素和brc1912毒素分别稀释成1500、1000、500、250、125、62.5和6.25µg/ml6个梯度，以单蒸水作为空白对照。其他方法同实施例5。brc1912毒素对云杉花墨天牛二龄幼虫两周的lc50值为48.4μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了7.9倍（详见表2）。

表2cry3aa2和brc1912毒素对云杉花墨天牛幼虫的杀虫活性

实施例7brc1912毒素对云杉小墨天牛（monochamussutor）的生物测定

实验设计：将纯化的cry3aa2原毒素和brc1912毒素稀释成1500、1000、500、250、125、62.5和6.25µg/ml6个梯度，以单蒸水作为空白对照。其他方法同实施例5。brc1912毒素对云杉小墨天牛二龄幼虫两周的lc50值为28.9μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了9.9倍（详见表3）。

表3cry3aa2和brc1912毒素对云杉小墨天牛幼虫的杀虫活性

实施例8brc1912毒素对光肩星天牛（anoplophoraglabripennis）的生物测定

实验设计：将纯化的cry3aa2原毒素和brc1912毒素稀释成1500、1000、500、250、125和62.5µg/ml6个梯度，以单蒸水作为空白对照。其他方法同实施例5。brc1912毒素对云杉花墨天牛二龄幼虫两周的lc50值为142.2μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了5.5倍（详见表4）。

表4cry3aa2和brc1912毒素对光肩星天牛幼虫的杀虫活性

实施例9brc1912毒素对云斑天牛（batocerahorsfieldi）的生物测定

实验设计：将纯化的cry3aa2原毒素和brc1912毒素稀释成1500、1000、500、250、125和62.5µg/ml6个梯度，以单蒸水作为空白对照。其他方法同实施例5。brc1912毒素对云杉花墨天牛二龄幼虫两周的lc50值为249.1μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了6.6倍（详见表5）。

表5cry3aa2和brc1912毒素对云斑天牛幼虫的杀虫活性

实施例10brc1912毒素对红棕象甲（rhynchophorusferrugineus）的生物测定

将纯化所得的cry3aa2原毒素和brc1912毒素分别用单蒸水稀释到3.8、1.9、0.95和0.47mg/ml。在24孔板中的人工饲料中分别加入50μl不同浓度的毒素，每个孔放置一只二龄幼虫，各3个重复，每个重复10只幼虫。以单蒸水作为空白对照。放置人工气候箱中进行培养。培养条件：温度为28℃，相对湿度70%以上，光周期为8h/16h（白天/黑夜），观察各组幼虫的生长状况并在一周后计算各组幼虫死亡率，运用概率单位分析计算出致死中浓度（lc50），再通过microsoftexcel2016以及spss18.0进行数据的总结与方差分析。

brc1912毒素对红棕象甲二龄幼虫两周的lc50值为2.7mg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，对红棕象甲表现出了杀虫活性（详见表6）。

表6cry3aa2和brc1912毒素对红棕象甲幼虫的杀虫活性

sequencelisting

序列表

<110>福建农林大学

<120>对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素

<130>

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<213>苏云金杆菌（bacillusthuringiensis）人工合成

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<213>苏云金杆菌（bacillusthuringiensis）

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