本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取及保存方法。
背景技术：
：脂肪血管基质组分(stromalvascularfraction，svf)是脂肪组织经消化、离心去除成熟的脂肪组织、结缔组织，得到一种含间充质干细胞(6.7％)、内皮前体细胞(2％)和单核细胞/巨噬细胞(10％)等多种细胞的混合物。脂肪组织及骨髓中均可提取出svf细胞，但在脂肪组织中，1％～10％的有核细胞被认为是干细胞，而骨髓中只有0.0001～0.01％的有核细胞是干细胞。可以从一克脂肪组织中获得的干细胞数量约为5000-200000个细胞。svf细胞中的干细胞可分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子和外泌体。这些物质对周围组织器官有积极的影响，如缓解炎症、改善微循环等。植入组织内的干细胞，也可分化成组织特异性细胞。如svf在关节炎治疗方面有较好的治疗效果。2011，pak采用自体svf和富血小板血浆和透明质酸成功地治疗了2例人类膝关节骨关节炎患者。此后临床治疗关节炎越来越广泛，据临床研究资料显示，已有研究人员对1114例关节炎患者予以临床治疗。2013年，pak等人治疗了91位患者，其中65％的人群表述治疗3个月后有效果；bui等人对2级和3级21位关节炎患者予以svf治疗，vas评价及lysholm评价均显示患者在8.5个月关节功能得到改善。目前关节炎治疗主要有药物治疗如非甾体类抗炎药(nsaids)、类固醇和透明质酸(ras)；物理疗法如针灸、职业训练等；手术治疗如关节腔穿刺、关节置换、关节矫形等；免疫及生物治疗如干细胞移植、血浆置换等。药物治疗、物理疗法，都旨在纠正症状，而不是治疗潜在的原因。当药物治疗和物理疗法治疗失败时，患者通常进行全膝关节置换(tkr)或全髋关节置换术(thr)手术。tkr和thr手术均具有较高的发病率和死亡率。全膝关节置换术后的第30天死亡率为0.18％，5.6％的患者出现并发症。全髋关节置换术后30天和90天的死亡率分别为0.24％和0.55％。：svf采用患者自身脂肪组织，回输到体内不会出现任何副作用，且细胞治疗不需对关节进行破坏性处理，通过svf自发迁移至受损部位而生成软骨组织。细胞回输后仅需静养几天即可进行正常的生活、工作。svf还可对关节炎症、肌腱缺失、髌骨软骨软化、半月板缺失等关节部位均有一定的治疗效果。目前svf细胞提取一般将脂肪组织清洗离心后加入等体积的胶原酶以150-280rpm，37℃振荡消化30-60min，离心获得沉淀物，沉淀物清洗离心过滤获得svf细胞。但这种组织消化方式中的酶消化作用过长及振荡产生的剪切力均对细胞活率有较大影响，而且将脂肪细胞提取后进行移植存在最大的问题是脂肪的坏死吸收，其体积最终只能维持在50％左右。技术实现要素：鉴于此，本发明提出一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取及保存方法，解决上述问题。本发明的技术方案是这样实现的：一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取方法：s1、人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂包括以下重量份原料：0.1-1w/w％胶原酶溶液0.3-1.5份、0.5-3w/w％地榆多糖溶液0.2-0.9份，2-10w/w％的海藻糖溶液0.1-0.5份及0.05-0.15w/w％的明胶溶液0.3-1.2份；s2、采集脂肪组织，用ph值为7.2-7.4的pbs清洗2-4遍，去除洗涤液，加入s1步骤的提取试剂，在30-40℃振荡消化30-60min，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；s3、加入生理盐水洗涤沉淀细胞，再加入-2～-10℃消化剂重复洗涤沉淀细胞，于1300～1800rpm离心2～8min去除上清，沉淀加入8～12倍体积量的上述消化剂重悬细胞，80～120μm过滤得到svf细胞；所述消化剂包含山梨酸、卵磷脂、α1抗胰蛋白酶-edta复合体、混合糖电解质注射液，重量比为1：0.3～1.2：0.1～0.5：0.8～1.1。进一步的，所述提取方法的s2步骤的振荡频率为180-320rpm。进一步的，所述提取方法的s3步骤加入5～10倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞。进一步的，权利要求1所述的一种人自体脂肪血管基质成分svf的提取方法提取的svf细胞的保存方法包括以下步骤：s1、将上述提取的svf细胞置于-2～-6℃冷冻室中冻干脱水40-80s；s2、脱水后的svf细胞加入氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液，再于深低温冰箱-70～-80℃保存1～3h；s3、取出s2步骤的svf细胞置于-196～-200℃下液氮储存。进一步的，所述保存方法的s2步骤氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液的加入量为脱水后的svf细胞体积的3～5倍。进一步的，所述保存方法的s2步骤氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液中氯化钠、海藻糖、地榆多糖的质量比为1～3:0.3～0.9:2～3。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种脂肪血管基质组分的提取试剂，由dmem配制的胶原酶、地榆多糖、海藻糖及明胶组成的混合溶液，本发明的海藻糖溶液对细胞膜蛋白有保护作用，地榆多糖溶液促血管内皮细胞、血细胞的生长和分裂而降低组织缺血水平，胶原酶溶液和明胶溶液可促进细胞增殖迁移，可提高溶液粘稠度，降低剪切力对细胞的破坏。svf沉淀细胞用生理盐水洗涤，并用滤网去除细胞液中的块状物质；再使用消化剂重复洗涤，科学配比选择消化剂，其中的消化剂中含有α1抗胰蛋白酶-edta复合体能消化脂肪细胞间的基质蛋白组织，解离细胞间的连接，加速细胞从组织中游离出来；本发明能够减少组织或细胞离心，降低离心转速及离心时间，减少剪切力对细胞的破坏，达到保护细胞，提高脂肪组织中细胞存活率的目的；另外，使用氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液进行低温保存，其中地榆多糖成分能依靠带电荷的水和基团间的氢键在生物分子表面形成保护膜，以代替维护结构中所必须的水分子，使组织在极低水分时仍能保持细胞膜结构的完整性，从而能够将自体脂肪细胞完好的保存。本发明可提供一种临床级脂肪svf提取和保存方法，应用于现有临床治疗技术对骨关节炎、关节软骨缺损、软骨损伤与退变等疾病治疗。具体实施方式为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1(1)人自体脂肪血管基质成分svf的提取方法：s1、人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂包括以下重量份原料：0.1w/w％胶原酶溶液0.3份、0.5w/w％地榆多糖溶液0.2份，2-w/w％的海藻糖溶液0.1份及0.05w/w％的明胶溶液0.3份；s2、采集脂肪组织，用ph值为7.2的pbs清洗2遍，去除洗涤液，加入s1步骤的提取试剂，在30℃振荡消化30min，振荡频率为180rpm，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；s3、加入5倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，再加入-2℃消化剂重复洗涤沉淀细胞，于1300rpm离心2min去除上清，沉淀加入8倍体积量的上述消化剂重悬细胞，80μm过滤得到svf细胞；所述消化剂包含山梨酸、卵磷脂、α1抗胰蛋白酶-edta复合体、混合糖电解质注射液，重量比为1：0.3：0.1：0.8；(2)人自体脂肪血管基质成分svf的保存方法：s1、将上述提取的svf细胞置于-2℃冷冻室中冻干脱水40s；s2、脱水后的svf细胞加入3倍体积的氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液，质量比为1:0.3:2，再于深低温冰箱-70℃保存1h；s3、取出s2步骤的svf细胞置于-196℃下液氮储存。实施例2(1)人自体脂肪血管基质成分svf的提取方法：s1、人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂包括以下重量份原料：1w/w％胶原酶溶液1.5份、3w/w％地榆多糖溶液0.9份，10w/w％的海藻糖溶液0.5份及0.15w/w％的明胶溶液1.2份；s2、采集脂肪组织，用ph值为7.4的pbs清洗4遍，去除洗涤液，加入s1步骤的提取试剂，在40℃振荡消化60min，振荡频率为320rpm，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；s3、加入5～10倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，再加入-10℃消化剂重复洗涤沉淀细胞，于1800rpm离心8min去除上清，沉淀加入12倍体积量的上述消化剂重悬细胞，120μm过滤得到svf细胞；所述消化剂包含山梨酸、卵磷脂、α1抗胰蛋白酶-edta复合体、混合糖电解质注射液，重量比为1：1.2：0.5：1.1；(2)人自体脂肪血管基质成分svf的保存方法：s1、将上述提取的svf细胞置于-6℃冷冻室中冻干脱水80s；s2、脱水后的svf细胞加入5倍体积的氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液，质量比为3:0.9:3，再于深低温冰箱-80℃保存3h；s3、取出s2步骤的svf细胞置于-200℃下液氮储存。实施例3(1)人自体脂肪血管基质成分svf的提取方法：s1、人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂包括以下重量份原料：0.5w/w％胶原酶溶液0.9份、1.8w/w％地榆多糖溶液0.5份，4.0w/w％的海藻糖溶液0.3份及0.15w/w％的明胶溶液0.7份；s2、采集脂肪组织，用ph值为7.2的pbs清洗3遍，去除洗涤液，加入s1步骤的提取试剂，在30℃振荡消化40min，振荡频率为270rpm，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；s3、加入8倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞，再加入-6℃消化剂重复洗涤沉淀细胞，于1500rpm离心5min去除上清，沉淀加入10倍体积量的上述消化剂重悬细胞，100μm过滤得到svf细胞；所述消化剂包含山梨酸、卵磷脂、α1抗胰蛋白酶-edta复合体、混合糖电解质注射液，重量比为1：0.7：0.3：1.0；(2)人自体脂肪血管基质成分svf的保存方法：s1、将上述提取的svf细胞置于-4℃冷冻室中冻干脱水60s；s2、脱水后的svf细胞加入4倍体积的氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液，质量比为2:0.6:2.5，再于深低温冰箱-75℃保存1～3h；s3、取出s2步骤的svf细胞置于-198℃下液氮储存。实施例4本实施例与实施例3的区别在于，所述消化剂的重量比为1：0.1：1：1.5。实施例5本实施例与实施例3的区别在于，所述氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液中氯化钠、海藻糖、地榆多糖的质量比为1:1:1。对比例1本对比例与实施例3的区别在于，所述人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂包括以下重量份原料：0.5w/w％胶原酶溶液1.9份、1.8w/w％地榆多糖溶液0.1份，4.0w/w％的海藻糖溶液0.6份及0.15w/w％的明胶溶液0.2份。对比例2本对比例与实施例3的区别在于，所述人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂中不含有地榆多糖溶液。对比例3本对比例与实施例3的区别在于，所述消化剂不含有α1抗胰蛋白酶-edta复合体。对比例4本对比例与实施例3的区别在于，所述保存方法中s2步骤脱水后的svf细胞加入氯化钠、海藻糖、黄芪多糖的混合溶液，再于深低温冰箱-70～-80℃保存1～3h。一、svf细胞量对比分别按照实施例1～5和对比例1～4的方法提取svf细胞及保存，重复制备svf细胞3个样本，每个样本取5份，分别计算平均细胞数量及用台盼蓝计算细胞成活率。结果如下表：组别平均细胞数(*106)平均活细胞数(*106)活率(％)实施例15.165.0696.8实施例25.265.0997.5实施例35.285.1398.6实施例45.225.1096.3实施例55.135.0395.3对比例14.284.1986.3对比例24.224.1285.5对比例34.314.1984.6对比例44.284.1885.3二、svf中脂肪干细胞的成活率用胰酶消化离心后计算干细胞数量，测算svf细胞中干细胞的成活率。结果见表2。由上表可知，采用本发明的提取方法获取的细胞数量较高，且成活率显著提高，实施例1～5和对比例1比较，提取试剂科学配比，充分将细胞完整提取；实施例1～5和对比例2比较，地榆多糖溶液能促进细胞的生长和分裂提高自体脂肪细胞的存活率；实施例1～5和对比例3比较，消化剂中含有α1抗胰蛋白酶-edta复合体能消化脂肪细胞间的基质蛋白组织，解离细胞间的连接，加速细胞从组织中游离出来；实施例1～3和实施例4、5对比，各溶液之间合理的配比，有助于脂肪的提取。三、测定存活率将上述实施例1～5和对比例1～4提取的svf细胞采用本发明的保存方法，保存两个月后测定svf中脂肪干细胞的成活率，测定结果如下：由上表可知，实施例1～5和对比例4对比，使用氯化钠、海藻糖、地榆多糖的混合溶液进行低温保存，其中地榆多糖成分能依靠带电荷的水和基团间的氢键在生物分子表面形成保护膜，以代替维护结构中所必须的水分子，使组织在极低水分时仍能保持细胞膜结构的完整性，从而能够将自体脂肪细胞完好的保存。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12