卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用。
背景技术：
：哺乳动物的体外受精胚胎、克隆胚胎、孤雌胚胎以及转基因胚胎广泛应用于遗传改良、胚胎早期发育机理研究、表观遗传调控等胚胎工程
技术领域：
，卵母细胞体外培养质量是决定胚胎发育的关键因素，但至今卵母细胞体外培养的成熟效率和质量未得到较大的提升。活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)是影响卵母细胞体外培养的一个重要因素。ros是生物有氧代谢的一种产物，包括氧离子、超氧离子、羟基自由基和过氧化氢等。在平衡状态下，ros作为信号分子在激素信号、细胞内氧化还原调节和胚胎发育等生理过程中发挥着有益的作用。然而，体外培养是一个静态的环境，没有营养物质和代谢产物的更换，容易造成ros的累积，从而改变了它们的功能并损害细胞存活。因此，ros对卵母细胞的活力、基因表达、蛋白质合成和分子信号传导产生负面影响，影响了卵母细胞的成熟和发育能力。技术实现要素：本发明的目的是提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用，以解决上述问题。根据本发明的一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，该添加剂包括铜蓝蛋白。由此，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ros含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量。在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液添加剂的铜蓝蛋白浓度为1.25-10μg/ml。由此，该浓度范围的铜蓝蛋白添加剂，培养的卵母细胞成熟率更高，质量更好。在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液添加剂的铜蓝蛋白浓度为2.5μg/ml。由此，添加2.5μg/ml浓度的铜蓝蛋白体外培养的卵母细胞的成熟率最高，质量最好。根据本发明的另一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，该培养液包括铜蓝蛋白；或包括1.25-10μg/ml的铜蓝蛋白；或包括2.5μg/ml的铜蓝蛋白。由此，使用包括铜蓝蛋白/或1.25-10μg/ml的铜蓝蛋白/或2.5μg/ml的铜蓝蛋白的卵母细胞体外成熟培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mm半胱氨酸、0.91mm丙酮酸钠、10ng/ml表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10iu/ml孕马血清促性腺激素和10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、铜蓝蛋白。由此，该培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mm半胱氨酸、0.91mm丙酮酸钠、10ng/ml表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10iu/ml孕马血清促性腺激素和10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、1.25-10μg/ml铜蓝蛋白。由此，该培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mm半胱氨酸、0.91mm丙酮酸钠、10ng/ml表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10iu/ml孕马血清促性腺激素和10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、2.5μg/ml铜蓝蛋白。由此，该培养液，对提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量的效果最佳。根据本发明的另一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂在体细胞克隆技术上的应用。由此，可以大大提高卵母细胞的体外成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术上，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。在某些实施方式中，应用于体细胞克隆技术的卵母细胞体外成熟培养液添加剂为1.25-10μg/ml铜蓝蛋白。由此，可以大大提高卵母细胞的体外成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。在某些实施方式中，应用于体细胞克隆技术的卵母细胞体外成熟培养液添加剂为2.5μg/ml铜蓝蛋白。由此，可以最佳效果的提高卵母细胞的体外成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术上，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。本发明的有益效果：1、卵母细胞成熟培养液中添加铜蓝蛋白，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ros含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量。2、含铜蓝蛋白的卵母细胞成熟培养液，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ros含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量。3、铜蓝蛋白应用在体细胞克隆技术中，其作为卵母细胞成熟培养液的添加剂，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ros含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术上，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。附图说明图1为对照组处理对卵母细胞ros水平影响的荧光图；图2为1.25μg/ml组铜蓝蛋白处理对卵母细胞ros水平影响的荧光图；图3为2.5μg/ml组铜蓝蛋白处理对卵母细胞ros水平影响的荧光图；图4为5μg/ml组铜蓝蛋白处理对卵母细胞ros水平影响的荧光图；图5为10μg/ml组铜蓝蛋白处理对卵母细胞ros水平影响的荧光图；图6为不同浓度铜蓝蛋白处理对卵母细胞ros水平影响的结果图。具体实施方式下面结合附图对发明作进一步详细的说明。1、卵母细胞收集和成熟培养从屠宰场获取青年母猪的卵巢，放入32℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素的生理盐水冲洗3遍后，用配有18g针头的10ml注射器抽取2-6mm的卵泡，卵泡液收集于50ml锥形离心管，自然沉淀10min后弃上清，将沉淀重新悬浮在含有0.05％(wt/vol)pva的dpbs中，体视显微镜下收集包裹卵丘细胞3层以上且均匀胞质的卵丘-卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplexes,cocs)，在成熟培养液中清洗三次后，将cocs转移到含有500μl成熟培养液且已在39℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中平衡过夜的四孔nunc培养皿中。50个cocs一孔，培养皿放入39℃、5％co2、饱和湿度的培养箱成熟培养44h。成熟培养后的cocs与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吸吐除去卵丘细胞，在体视显微镜下对卵母细胞进行挑选，卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞为成熟卵母细胞，无卵周系、胞质发散视为死亡的卵母细胞。成熟培养液为：tcm-199(gibco)基础液，添加0.6mm半胱氨酸、0.91mm丙酮酸钠、10ng/ml表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10iu/ml孕马血清促性腺激素(pmsg)和10iu/ml人绒毛膜促性腺激素(hcg)。cocs的成熟培养分为五组：对照组(未添加铜蓝蛋白的成熟培养液)、1.25μg/ml组(加入1.25μg/ml铜蓝蛋白的成熟培养液)、2.5μg/ml组(加入2.5μg/ml铜蓝蛋白的成熟培养液)、5μg/ml组(加入5μg/ml铜蓝蛋白的成熟培养液)、10μg/ml组(加入10μg/ml铜蓝蛋白的成熟培养液)。经44h成熟培养后，2.5μg/ml组细胞第一极体的排出率显著提高(p＜0.05)，添加2.5μg/ml铜蓝蛋白(ceruloplasmin,cp)的成熟培养液可显著提高卵母细胞的成熟率(p＜0.05),结果见表1。表1铜蓝蛋白对卵母细胞成熟的影响组别培养卵数卵母细胞死亡率第一极体排出率对照组725126(17.38％)441(60.83％)a1.25μg/ml组53095(20.00％)338(63.77％)ab2.5μg/ml组58987(14.77％)389(66.04％)b5μg/ml组55988(18.60)351(62.79％)ab10μg/ml组599111(21.65％)361(60.27％)a备注：统计分析5次重复试验的数据，同一列的不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，下同。2、成熟卵母细胞ros水平检测使用ros检测试剂盒(sigma-aldrich)检测卵母细胞内ros水平。卵母细胞在含10μmdcfh-da((2,7-dichlorodi-hydrofluoresceindiacetate)的无血清培养液液中避光孵育1h后，用无血清细胞培养液冲洗卵母细胞1-2次，在莱卡荧光显微镜上检测荧光信号并拍照，用imagej软件分析卵母细胞的荧光强度的相对比值。五组卵母细胞检测都遵循相同的程序，包括孵育、冲洗、成像。成熟培养44h后，和对照组相比，添加2.5μg/ml铜蓝蛋白的成熟培养液(2.5μg/ml组)最大程度地降低了胞质内50.44％的ros含量，结果见附图1-6。3、卵母细胞孤雌激活、体外培养与囊胚细胞计数将五组成熟的卵母细胞转移到激活液(0.25mm甘露醇，0.05mmmgcl2，0.05mmcacl2和0.5mmhepes，0.01％pva(w/v))中平衡1min，然后转移到已加满激活液的间隔0.5cm的两个电极之间的腔室内，使用bls融合仪用80kv/cm的直流脉冲电刺激激活卵母细胞80μs。激活后的卵母细胞转移到pzm-3培养液中，在5％co2、5％o2、饱和湿度的培养箱中培养7天。卵裂率和囊胚形成率分别在48h和168h时检测。挑选已发育到囊胚的孤雌胚胎用4％多聚甲醛固定10min，再用10mg/lhoechst33342中染色10min，压片后在荧光显微镜下观察记录囊胚细胞数。成熟培养液中添加2.5μg/ml铜蓝蛋白组培养成熟的卵母细胞，孤雌激活后胚胎囊胚率显著高于对照组(p＜0.05)，结果见表2。表2铜蓝蛋白添加组培养成熟卵母细胞孤雌胚胎的发育和质量以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。当前第1页12