一种超长大肠杆菌及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种超长大肠杆菌及其制备方法与应用。

背景技术：

在许多科学研究领域内，细菌大小对细菌检测有重要影响，如氧化应激检测、运动性和趋化性研究、抗生素敏感性、单细胞检测和整体成像分析等。因为较大的细菌有更多表面抗原和结合位点，从而可提高检测灵敏度。此外，超长大肠杆菌的形成对活性污泥法处理污水起到重要作用，在活性污泥中超长大肠杆菌可以充当骨架的作用，保证污泥絮体的强度，提高污泥的沉淀性能，影响出水的净化效率。再者，超长大肠杆菌是分裂期缺陷导致的细胞分裂而不断裂产物，具有更强的抗吞噬、抵御不良环境的能力，比正常形态的细菌具有更强摄取食物的能力，存活率比正常细胞高。

据报道，sos反应、dna损伤、高压和脱水等不利环境压力都会导致超长大肠杆菌的形成。已有研究证明，抗生素可以促进大肠杆菌变长，如头孢氨苄。头孢氨苄诱导形成超长大肠杆菌的机制有两种，第一种是通过与细胞壁上的青霉素结合蛋白(pbps)结合来抑制肽聚糖层的交联形成和细胞壁的合成，从而导致细胞壁生长而不分裂；第二种可能的机制是头孢氨苄的抗生素效应引起的sos反应，导致细胞膜和细胞壁不完整。头孢氨苄的浓度也会影响大肠杆菌的延长效果，当头孢氨苄的浓度低于最小抑菌浓度时可以形成超长大肠杆菌，但当浓度较高时则会导致细菌失活。虽然抗生素可诱导形成超长大肠杆菌，但这仅考虑到了抗生素的单方面作用，且仅用抗生素延长大肠杆菌的长度还不能够满足目前科学研究的需求。

uv光照是形成超长大肠杆菌的物理方法，它是通过持续的uv照射破坏或抑制细胞内dna的复制后，激活特定基因并诱导sos反应。sos反应可以抑制细菌分裂，让细菌只生长而不分裂，从而形成超长大肠杆菌。uv光的类型，光照强度、时间及频率等都会影响超长大肠杆菌的形成。通过uv照射所产生的超长大肠杆菌由于dna受到了损伤，所以存活率较低，而且遗传性较差，一旦损伤的dna被修复后，细胞的分裂能力就会慢慢恢复。

因此，本发明制备超长大肠杆菌的方法对于细菌检测、处理废水以及其他对细菌存活率有要求的科学研究均具有重大价值。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种超长大肠杆菌的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的超长大肠杆菌

本发明的再一目的在于提供上述超长大肠杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种超长大肠杆菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)将大肠杆菌接种到培养基中，培养，稀释，再培养；

(2)将步骤(1)再培养后的大肠杆菌接种到含有表面活性剂和头孢氨苄的培养基中，培养，得到超长大肠杆菌。

步骤(1)中所述的大肠杆菌在使用前通过基因工程的方法使其具备除头孢氨苄之外的其他抗生素的抗性，或直接使用具有其他抗生素抗性的大肠杆菌，并且在培养过程中添加适量的该抗生素。

步骤(1)中所述的大肠杆菌优选为e.colitop10、e.colipd1b10、e.colibl21、e.colimg1655中的一种；更优选为e.colitop10。

步骤(1)中所述的培养基为ph值为7.0的lb培养基。

所述的lb培养基的配方：10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨。

步骤(1)中所述的培养为37℃培养12h，至吸光值od＝0.5。

步骤(1)中所述的稀释为稀释1000倍。

步骤(1)中所述的再培养为37℃培养2h。

步骤(2)中所述的头孢氨苄的用量为按其在培养基中浓度为30-120μg/ml配比；优选为60-100μg/ml；更优选为60-90μg/ml。

步骤(2)中所述的表面活性剂优选为阳离子表面活性剂ctab、阴离子表面活性剂sds和非离子表面活性剂tween。

所述的非离子表面活性剂tween优选为tween-20。

所述的表面活性剂为ctab时，其用量为按其在培养基中浓度为质量比0.0005-0.02％配比；优选为按其在培养基中浓度为质量比0.0005-0.002％配比；更优选为按其在培养基中浓度为质量比0.001％配比。

所述的表面活性剂为sds时，其用量为按其在培养基中浓度为质量比0.005-0.5％配比；优选为按其在培养基中浓度为质量比0.1％配比。

所述的表面活性剂为tween-20时，其用量为按其在培养基中浓度为质量比0.02-10％配比；优选为按其在培养基中浓度为1-2％配比。

步骤(2)中所述的培养为37℃培养4-8h；优选为4h。

步骤(1)和(2)的培养、再培养过程中，摇菌采用250ml锥形瓶时，摇菌的速度优选为60rpm。

一种超长大肠杆菌，通过上述制备方法制备得到。

上述超长大肠杆菌在活性污泥法处理废水中的应用。

上述超长大肠杆菌在细菌检测中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

1、本发明的方法制备的超长大肠杆菌在活性污泥中可以充当骨架的作用，保证污泥絮体的强度，提高污泥的沉淀性能，影响出水的净化效率。因此本发明可以广泛应用于活性污泥法处理废水中。

2、细菌大小的增加对细菌检测有重要影响，如氧化应激检测、运动性和趋化性研究、抗生素敏感性、单细胞检测和整体成像分析等。较大的细菌，有更多表面抗原和结合位点，从而可提高检测灵敏度。因此经过本发明的方法获得的超长大肠杆菌可以广泛应用于细菌检测中。

3、超长大肠杆菌比正常形态的细菌具有更强摄取食物的能力，同时还具备更强的抵御外界不良危险、抗吞噬的能力，细菌培养过程中超长大肠杆菌的存活率要比正常细胞高。因此经过本发明的方法获得的超长大肠杆菌可以广泛应用于对细菌存活率有要求的科学研究中。

4、与仅用抗生素产生的超长大肠杆菌相比，表面活性剂与抗生素联合作用产生的超长大肠杆菌更长，最长约为头孢氨苄单独作用时的3倍；同时，本发明技术考虑到了多环境因素的共同作用，比考虑头孢氨苄单独作用更具有现实意义和实际操作性。

5、uv处理法会导致大肠杆菌dna损伤，造成基因突变，而本方法原理上不会造成dna损伤进而降低基因突变的概率。与uv技术产生的超长大肠杆菌相比，表面活性剂与抗生素联合作用产生的超长大肠杆菌具有正常的dna分布状态和更高的存活率。

附图说明

图1是实施例1-3的实验流程图。

图2用不同浓度ctab与90μg/ml头孢氨苄联合处理大肠杆菌得到的10个最长大肠杆菌的长度统计图。

图3用不同浓度sds与90μg/ml头孢氨苄联合处理大肠杆菌得到的10个最长大肠杆菌的长度统计图。

图4是用不同浓度tween-20与90μg/ml头孢氨苄联合处理大肠杆菌得到的10个最长大肠杆菌的长度统计图。

图5是超长大肠杆菌中dna的分布图；其中，a为头孢氨苄和表面活性剂处理后的大肠杆菌dna；b为a中白色方块内区域的放大图像；a的比例尺长度为3μm；b的比例尺长度为5μm。

图6是超长大肠杆菌中细胞膜的分布图；其中，a为头孢氨苄和表面活性剂处理后的大肠杆菌细胞膜；b为a中白色方块内区域的放大图像；a的比例尺长度为3μm；b的比例尺长度为5μm。

图7是未处理、头孢氨苄处理、头孢氨苄和表面活性剂(ctab、sds和tween-20)处理的大肠杆菌的zeta电位统计图。

图8是不同浓度头孢氨苄处理后获得的超长大肠杆菌的长度统计图；其中，细菌的长度显示为黑点，各组数据标准差的平均值用横线表示。

图9为采用浓度为90μg/ml的头孢氨苄培养不同时间的大肠杆菌显微镜图；其中，a为培养0h；b为培养4h；c为培养8h。

图10是头孢氨苄处理后的大肠杆菌电镜图；其中，标尺为60μm。

图11是不同大肠杆菌品系制备超长大肠杆菌所需头孢氨苄的浓度统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。

实施例1ctab制造超长大肠杆菌

ctab为白色或浅黄色固态物质，易溶于异丙醇，可溶于水，具有良好的生物降解和杀菌性能，采用水配制ctab溶液，使其浓度在培养基中依次为0.0005％(w/w)、0.001％(w/w)、0.002％(w/w)、0.005％(w/w)、0.01％(w/w)和0.02％(w/w)。

①将大肠杆菌e.colitop10接种到含有10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨，ph值为7.0的lb培养基中，并在37℃、60rpm有氧条件下过夜培养12h(采用250ml锥形瓶，下同)。

②将培养12h且吸光值为0.5(od＝0.5)的菌液用培养基稀释1000倍，将稀释的大肠杆菌接种到lb培养基中，37℃、60rpm有氧再培养2h。

③将②中再培养后的大肠杆菌分别接种到0.0005％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.001％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.002％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.005％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.01％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄和0.02％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄的培养基中，37℃、60rpm有氧培养4h，培养结束后分别测量细菌长度。对照设置：不添加头孢氨苄和ctab(wt)的阴性对照、添加90μg/ml头孢氨苄(cex)的阳性对照。实验流程图见图1。

实施例2sds制造超长大肠杆菌

sds是一种白色或淡黄色微粘物，易溶于水，具有良好的乳化和去污性能。由于sds在水中的最大浓度受到溶解度的限制，所以使用的浓度都不会很高，采用水配制的溶液使其浓度在培养基中分别为0.005％(w/w)、0.02％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％(w/w)、0.2％(w/w)和0.5％(w/w)。

①将大肠杆菌接种到含有10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨，ph值为7.0的lb培养基中，并在37℃、60rpm有氧条件下过夜培养12h(采用250ml锥形瓶，下同)。

②将培养12h且吸光值为0.5(od＝0.5)的菌液用培养基稀释1000倍，将稀释的大肠杆菌接种到lb培养基中，37℃、60rpm有氧再培养2h。

③将②中再培养后的大肠杆菌分别接种到0.005％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄、0.02％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄、0.05％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄、0.1％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄、0.2％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄和0.5％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄的培养基中，37℃、60rpm有氧培养4h，培养结束后分别测量细菌长度。对照设置：不添加头孢氨苄和sds(wt)的阴性对照、添加90μg/ml头孢氨苄(cex)的阳性对照。

实施例3tween-20制造超长大肠杆菌

tween-20由于分子式含有较多亲水基团，所以具有很强的亲水性能，常作为水包油(o/w)型乳化剂，可与其他乳化剂联用，增强乳化剂的稳定性。由于tween-20的毒性小，所以配制的浓度比ctab和sds都要高(采用水配制)，分别使其在培养基中为0.02％、0.1％、0.2％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)和10％(w/w)这六种浓度。

①将大肠杆菌接种到含有10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨，ph值为7.0的lb培养基中，并在37℃、60rpm有氧条件下过夜培养12h(采用250ml锥形瓶，下同)。

②将培养12h且吸光值为0.5(od＝0.5)的菌液用培养基稀释1000倍，将稀释的大肠杆菌接种到lb培养基中，37℃、60rpm有氧再培养2h。

③将②中再培养后的大肠杆菌分别接种到0.02％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄、0.1％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄、0.2％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄、1％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄、2％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄和10％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄培养基中，37℃、60rpm有氧培养4h，培养结束后分别测量细菌长度。对照设置：不添加头孢氨苄和tween-20(wt)的阴性对照、添加90μg/ml头孢氨苄(cex)的阳性对照。

实施例4超长大肠杆菌表征

(1)超长大肠杆菌平均长度计算

根据以下三种假设：1)表面活性剂不改变大肠杆菌表面的电荷，2)电荷沿大肠杆菌均匀分布，3)大肠杆菌呈棒状柱状，分别计算出头孢氨苄、头孢氨苄和表面活性剂处理过的大肠杆菌样品(实施例1-3)的平均长度。

计算方法：

电泳迁移率与大肠杆菌电荷的关系：q＝6πηrμ(1)

zeta电位z与电泳迁移率的关系为：

(1)式和(2)合并得zeta电位z与大肠杆菌电荷的关系：q＝4πrεzf(ka)(3)

假设大肠杆菌是一个直径为d，长度为l，比值为n＝l/d的圆柱体，扩散系数d为:

根据爱因斯坦-斯托克斯关系：

合并式(4)(5)得：

假设电荷沿着大肠杆菌均匀分布，得：q＝adn(7)

合并式(3)(6)(7)得：

根据式(8)最终得zeta电位z与大肠杆菌长度的关系式：

式中：q是大肠杆菌的净电荷，η是水的粘度，r是大肠杆菌的水动力半径，μ是电泳迁移率。ε是水的介电常数，f(ka)是亨利函数(根据斯莫鲁乔夫斯基近似，它是1.5)。k是玻尔兹曼常数，t是绝对温度。

由最终式可知，zeta电位z与n有关，且n＝l/d，所以其实大肠杆菌细胞表面的zeta电位z与细菌长度成正相关，即细胞表面的zeta电位就越高细菌就会越长

实施例1中制备的大肠杆菌长度见图2，从图可以看出，浓度为0.005％(w/w)和0.02％(w/w)的ctab与头孢氨苄联合制造的大肠杆菌的平均长度比头孢氨苄单独制造的大肠杆菌还要略短，其中0.005％(w/w)ctab的延长效果最不理想。浓度为0.0005％(w/w)、0.001％(w/w)、0.002％(w/w)和0.01％(w/w)的ctab都增强了头孢氨苄延长大肠杆菌的效果，其中0.001％(w/w)增强效果最好，约为头孢氨苄(cex)单独作用时的1.5倍。

实施例2中制备的大肠杆菌长度见图3，由图可得知，五种不同浓度的sds都增强了头孢氨苄延长大肠杆菌的效果，其中0.5％(w/w)的增强效果最不明显，0.1％(w/w)sds的增强效果最好，约为头孢氨苄单独作用时的2倍。同时还可以看出0.05％(w/w)和0.2％(w/w)的延长效果相当约为头孢氨苄单独作用时的1.8倍，且0.005％(w/w)的延长效果要比0.02％(w/w)更明显。

实施例3中制备的大肠杆菌长度见图4，从图中可知，不同浓度tween-20对头孢氨苄延长大肠杆菌都有增强效果，且延长效果存在显著差异。0.02％(w/w)、0.1％和0.2％(w/w)的tween-20增强头孢氨苄延长大肠杆菌的效果相似，且长度分布都较均匀。1％(w/w)和2％(w/w)的tween-20对大肠杆菌的延长效果都很显著，其中1％(w/w)tween-20的延长效果最好，约为头孢氨苄单独作用时的3倍。

(2)超长大肠杆菌细胞膜完整性和dna分布

表面活性剂具有细胞毒性，如诱导革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌裂解、抑制细菌生长和改变细胞壁结构和孔隙率等。同时，头孢氨苄作为抗生素具有一定的抑菌效果。所以需要确定经表面活性剂联合头孢氨苄处理的细菌、经头孢氨苄处理的细菌是否具有正常的细胞活性。

①收集在37℃、60rpm有氧条件下正常培养4h的大肠杆菌菌液。

②收集在37℃、60rpm有氧条件下90μg/ml头孢氨苄暴露4h(lb培养基中添加头孢氨苄)的大肠杆菌

③分别收集经过0.001％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.1％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄和1％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄联合暴露4h(lb培养基中添加表面活性剂和头孢氨苄)的大肠杆菌。

④分别取500μl①②③中细菌样品用200μldapi染色5min，然后以8000rpm离心5min，收集细菌样品。

⑤将④中细菌颗粒分别重新悬浮在200μl的fm4-64溶液中，0℃培养1分钟，再将悬浮液以8000rpm离心5分钟，收集细菌颗粒并分别重新悬浮于蒸馏水中。

⑥分别用荧光显微镜观察⑤中细菌细胞膜和dna。

dna的分布如图5所示，经表面活性剂和抗生素联合作用产生的超长大肠杆菌的dna比正常细胞、头孢氨苄作用产生的超长细菌都要长，且正常分布在细胞中，沿着大肠杆菌纵向均匀分布。

细胞膜的分布如图6所示，经表面活性剂和抗生素联合作用产生的超长大肠杆菌的细胞膜比正常细胞和头孢氨苄作用产生的超长细菌都要长，且连续均匀地分布在大肠杆菌表面，表面形态正常。

因此，经表面活性剂与头孢氨苄联合作用的细菌具有正常的细胞活性。

(3)表面活性剂与细胞相互作用

表面活性剂能与细胞膜相互作用，促进有机物的跨膜运输，提高细胞膜的通透性。表面活性剂与细胞膜上的脂类结构相似，因此表面活性剂很可能通过大量插入细胞膜中与大肠杆菌相互作用，我们通过zeta电位测量来验证这一假设。大肠杆菌的zeta电位与电荷成正比，当表面活性剂大量插入或结合到细胞表面(包括细胞膜和细胞壁)时，zeta电位就会发生变化，对于携带不同电荷的sds和ctab，其产生的zeta电位应该是不同的。

①收集在37℃、60rpm有氧条件下正常培养4h的大肠杆菌菌液。

②收集在37℃、60rpm有氧条件下90μg/ml头孢氨苄暴露4h(lb培养基中添加头孢氨苄)的大肠杆菌。

③分别收集在37℃、60rpm有氧条件下经过0.001％(w/w)ctab+90μg/ml头孢氨苄、0.1％(w/w)sds+90μg/ml头孢氨苄和1％(w/w)tween-20+90μg/ml头孢氨苄联合暴露4h(lb培养基中添加表面活性剂和头孢氨苄)的大肠杆菌。

④将②和③中大肠杆菌样品分别在8000rpm下离心5min，离心结束后收集细菌颗粒并使其重新悬浮在纯水中。

⑤用zeta-pals(zetapals/bi-200sm，brookhaven，usa)分别测量①④中大肠杆菌的细胞膜表面电位，在相同的实验条件下测量三次。

结果如图7所示，无论是经头孢氨苄单独处理的大肠杆菌，还是表面活性剂与头孢氨苄联合处理后的大肠杆菌，它们细胞膜表面的zeta电位都比未经处理的大肠杆菌的zeta电位要低。同时，头孢氨苄单独处理的大肠杆菌的zeta电位发生了明显变化。但是，表面活性剂和头孢氨苄处理的大肠杆菌样品的zeta电位与头孢氨苄单独处理的大肠杆菌样品的zeta电位几乎一致。

以上结果表明，表面活性剂并没有插入或结合在细胞表面，没有改变大肠杆菌的正常功能。

对比例1传统技术制造超长大肠杆菌

①将大肠杆菌接种到含有10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨，ph值为7.0的lb培养基中，并在37℃、60rpm有氧条件下过夜培养12h(采用250ml锥形瓶，下同)。

②将培养12h且吸光值为0.5(od＝0.5)的菌液用培养基稀释1000倍，将稀释的大肠杆菌接种到lb培养基中，37℃、60rpm有氧再培养2h。

③将②中细菌分别接种到80μg/ml头孢氨苄、90μg/ml头孢氨苄和100μg/ml头孢氨苄的lb培养基中，37℃、60rpm有氧培养4h，培养结束测量细菌长度。

④将②中细菌分别接种到80μg/ml头孢氨苄、90μg/ml头孢氨苄和100μg/ml头孢氨苄lb培养基中，37℃、60rpm有氧培养8h，培养结束测量细菌长度。

⑤分别将③和④不同浓度头孢氨苄处理的大肠杆菌每组随机抽取50株，采用电镜测量长度。长度计算方法同实施例4步骤(1)。

结果如图8和9所示，头孢氨苄的最佳处理浓度为90μg/ml，最佳处理时间为4h。由于头孢氨苄具有一定的细胞毒性，导致培养后细胞数量下降。培养时间过长(8小时)，头孢氨苄耗尽，浓度下降，导致延长结果消失(图9c)。说明头孢氨苄的浓度是获得超长大肠杆菌的关键，需要通过精准的培养时间控制，即随着培养时间的延长，大肠杆菌逐渐增长，同时里面的头孢氨苄的量逐渐减少。在头四个小时时间内，头孢氨苄的量还处于亚致死剂量，表现为大肠杆菌仍在不断增长。过了四个小时，随着头孢氨苄的量减少超过了有效浓度，大肠杆菌逐渐恢复。严格控制头孢氨苄的衰减时间，才能最大化获得超长的大肠杆菌。此外我们对传统方法制备的超长大肠杆菌(步骤③所得)进行了电镜测量，测量结果发现，超长大肠杆菌为1微米左右宽的长细丝状，其长度比普通大肠杆菌延长了近百倍(图10)。同时也发现，超长大肠杆菌仅仅占据所有大肠杆菌总量的很少一部分，绝大多数大肠杆菌仍呈未延长状态。

对比例2

将实施例1步骤①②③中摇菌的速度分别改为转数为0、30rpm和200rpm，其余条件完全相同，制备超长大肠杆菌。将实施例1步骤①②③中摇菌的容器分别改为50ml离心管、500ml和1000ml锥形瓶，其余条件完全相同，制备超长大肠杆菌。

结果证明，摇菌时转数不足或者静止培养(转数为0)会导致大肠杆菌生长缓慢，无法得到足够数量的大肠杆菌；另一方面，摇菌速度过快，则导致大肠杆菌最长长度变短。随着盛菌器皿口径的增加，相同的转数产生的机械剪切力效果大不相同。在60rpm左右时，使用250ml锥形瓶摇菌方能达到制备超长大肠杆菌的目的。若使用口径更大的盛菌器，应减少转数，以免过大的机械碰撞导致细菌死亡或者导致超长大肠杆菌断裂；若使用口径更小的盛菌器，应相应增大转数。

对比例3

①将大肠杆菌(e.colipd1b10、e.colibl21、e.colimg1655品系)分别接种到含有10g/l氯化钠、5g/l酵母提取物和10g/l胰蛋白胨，ph值为7.0的lb培养基中，并在37℃、60rpm有氧条件下过夜培养12h(采用250ml锥形瓶，下同)。

②将培养12h且吸光值为0.5(od＝0.5)的菌液用培养基稀释1000倍，将稀释的大肠杆菌接种到lb培养基中，37℃、60rpm有氧再培养2h。

③将②中细菌分别接种到30μg/ml、45μg/ml、60μg/ml、75μg/ml、90μg/ml、105μg/ml、120μg/ml的头孢氨苄的lb培养基中，37℃、60rpm有氧培养4h，培养结束测量细菌长度。

结果如图11所示，不同大肠杆菌品系制备超长大肠杆菌所需使用的头孢氨苄的浓度不同。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。