制备荧光微球的方法及相应的荧光微球与流程

本发明涉及生物检测试剂领域。具体地，本发明涉及荧光微球的制备方法。

背景技术：

荧光微球是一类特殊的功能性微球，其通常具有纳米级至微米级的直径，并且在表面包覆有荧光物质或者在结构内负载有荧光物质，受到外界能量刺激下可以发射出荧光。由于结构稳定以及发光效率稳定等特点，荧光微球现已广泛地应用在标记、示踪、检测、体内成像、免疫医学、高通量药物筛选等领域中。

传统用于制备荧光微球的方法包括吸附法、键合法、包埋法、共聚法、溶胀法等。然而在这些方法中，存在着各种各样的问题，诸如吸附法制得的微球存在稳定性差，染料分子容易脱落等问题；溶胀法存在环境不友好且荧光强度弱等问题；而包埋法和共聚法等则存在微球直径受限、染料干扰聚合反应过程的现象等。在某些特定应用中，需要粒径均一且高荧光强度的荧光微球来进行检测。然而，传统方法难以制备这种粒径均一和高荧光强度的微球。

因此，需要提供一种制备荧光微球的方法，该制备方法简单、环境友好、易于操作且能够有效地提高包埋率，且所得荧光微球粒径均匀可控，荧光强度稳定。

技术实现要素：

本发明旨在改进现有技术中存在的一些缺陷。具体地，本发明提供了一种通过层层包埋来制备荧光微球的方法，通过使荧光染料良好地分散在聚合物单体中来制备种子微球，随后在该种子微球的外部层层包埋荧光染料，由此得到粒径均匀且荧光强度高的微球。

在第一方面，本发明提供一种制备荧光微球的方法，包括：步骤1，提供聚合物单体和能够溶解在所述聚合物单体的荧光染料，随后使所述聚合物单体聚合以得到所述荧光染料分散于其内的种子微球；步骤2，将步骤1得到的种子微球分散在水中，加入含有荧光染料的聚合物单体溶液，随后使加入的聚合物单体在种子微球的表面聚合得到荧光微球；步骤3，可选地，重复一次或多次步骤2；步骤4，可选地，将前一步骤得到的荧光微球分散到水中，加入功能单体，反应后得到功能化的荧光微球。

其中，在步骤1中，首先将所述荧光染料溶解在所述聚合物单体中。在一些实施方式中，步骤1中聚合物单体的聚合可在表面活性剂的存在下通过乳液聚合来完成。在一具体实施方式中，步骤1通过将荧光染料溶解在聚合物单体中并且将表面活性剂溶解在水中，两者混合乳化后，加入引发剂来得到种子微球。

在一些实施方式中，在步骤2中，将步骤1得到的种子微球分散在超纯水中，并且步骤1得到的种子微球在未经纯化下直接用于步骤2。所加入的聚合物单体在不存在表面活性剂的条件下进行聚合。

在一些实施方式中，可选地进行步骤3。其中，步骤3的重复次数根据荧光强度、微球粒径大小等实际需求进行调整。

在一些实施方式中，可选地进行步骤4。当进行步骤3时，则将步骤3得到的荧光微球分散到水中，然后向其中加入功能单体，反应后得到功能荧光微球。当未进行步骤3时，则将步骤2得到的荧光微球分散到水中，然后向其中加入功能单体，反应后得到功能荧光微球。

在本发明的方法的制备种子微球过程中，由于荧光染料通过非共价作用良好地分散在聚合物单体中，因此随着聚合反应的进行，荧光染料有效地分散在微球内。在随后的步骤中，该种子荧光微球作为模板，通过在水性环境下，疏水性单体于固体表面发生聚合，而使得微球的直径可控地增加，且同样地由于荧光染料能够良好地分散聚合物单体中，在聚合过程使微球直径增加的同时，还有效地包埋荧光染料。在该包埋过程中，除了聚合物单体与荧光染料的非共价作用之外，荧光染料与荧光染料也存在非共价作用。因此在本发明的所有合成中，模板内各物质之间的非共价作用以及模板内与模板外荧光染料的非共价键作用，有效且协同地提高荧光染料的包埋率。

在第二方面，本发明提供了一种由本发明的方法得到的荧光微球，该荧光微球具有均匀的直径，且荧光染料分散在整个微球内。更进一步地，本发明提供了通过本发明的方法制备的表面修饰有功能化基团，例如羧基、氨基、环氧基、磺酸基、氯甲基、醛基、羟基的荧光微球。

附图说明

图1示出了本发明的制备荧光微球的方法的示意性流程图；

图2示出了(a)比较例1常规一步法制备的荧光微球和(b)实施例1根据本发明的方法制备的荧光微球的扫描电镜图；

图3示出了(a)比较例2和实施例2在365nm的激光波长下的荧光光谱曲线以及(b)比较例2和实施例2的荧光微球在365nm波长的激发下发出的荧光；

图4示出了荧光微球包埋甲基丙烯酸后的荧光光谱曲线；

图5示出了荧光微球包埋甲基丙烯酸甲酯前后的荧光光谱曲线。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

现将参照图1，对本申请的层层包埋法进行进一步的说明。在步骤1中，制备种子荧光微球。其中，聚合物单体为疏水性聚合物单体，例如为苯乙烯及其衍生物，例如苯乙烯、二乙烯苯、3,4-二氯苯乙烯；丙烯酸类聚合物，例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸异丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等；优选苯乙烯及其衍生物，更优选苯乙烯。荧光染料能够溶解在所使用的聚合物单体中，并且为稀土螯合物荧光染料，例如铕螯合物染料，诸如eu(dbm)3phen，eu(dbm)3bpo；铽(tb)三元配合物，诸如tb(acac)3phen等，但不限于此。表面活性剂选自烷基磺酸盐或烷基硫酸盐，例如十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠。引发剂选自过硫酸盐类，例如过硫酸钾、过硫酸铵、过硫酸钠。

在一具体实施方式中，在步骤1中，将稀土螯合物荧光染料溶解到聚合物单体中得到溶液a，将少量的表面活性剂溶解到超纯水中得到溶液b，然后将溶液a加入到溶液b中，乳化后形成稳定的乳液，搅拌一定时间，例如0.5～6h。在一定温度下，例如60～90℃下加入引发剂，引发聚合来制备种子荧光微球。其中，荧光染料/聚合物单体的质量比：0.005～1，优选0.01～0.8，更优选0.05～0.5；溶液b中表面活性剂的浓度为0.05～2wt％，优选0.08～1wt％；并且搅拌在80～500rpm下进行。

在步骤2中，使种子微球的直径增加且均匀化。种子荧光微球得自于步骤1，聚合物单体可以与步骤1中所使用的单体相同或不同，优选选自苯乙烯及其衍生物。荧光染料可以与步骤1中的相同或不同，优选为稀土螯合物荧光染料，诸如铕螯合物染料。引发剂可与步骤1中的相同或不同，优选选自过硫酸盐类。荧光染料/聚合物单体比可与步骤1中的相同或不同，例如质量比为0.005～1，优选0.01～0.8，更优选0.05～0.5。反应温度60～90℃。该步骤无需表面活性剂。

在一具体实施方式中，在步骤2中，将步骤1得到的荧光微球分散到超纯水中，形成溶液c，再将荧光染料溶解到聚合物单体中形成溶液d，将d加入到c溶液中，搅拌溶胀一定时间，加入引发剂，开始升温聚合，得到荧光微球。其中，溶胀时间为0.5～24h，搅拌在80～500rpm下进行。

在步骤3中，n表示重复次数，可为0至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。应当知晓的是，步骤3重复进行时，每次使用的起始荧光微球均为前一次操作所得到的荧光微球。换句话说，步骤3中的荧光微球是迭代使用的。

在步骤4中，即制备功能荧光微球。功能单体可选自含有羧基、氨基、环氧基、磺酸基、氯甲基、醛基、羟基的单体，其中，含羧基的单体例如为甲基丙烯酸甲酯；含磺酸基的单体例如为3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸、2-磺基乙基(甲基)丙烯酸酯、3-磺基丙基(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物类；含羟基的单体例如选自含硅羟基的单体、纤维素、壳聚糖、聚乙二醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯、丙三醇单(甲基)丙烯酸酯、2-羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-羟基丙基(甲基)丙烯酸酯、2,3-二羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2,3-二羟基丙基(甲基)丙烯酸酯。其中，功能单体的浓度可优选为2～4ml/l。

在一具体实施方式中，在步骤4中，将前一步骤得到的多层荧光微球分散到超纯水中，形成溶液e，将功能单体加入到溶液e中，加入引发剂，开始升温聚合，得到功能荧光微球。其中反应温度通常为60～90℃。

在本发明的方法中，在微球的制备中，利用聚合物单体与荧光染料的相互作用，荧光染料和和荧光染料的相互作用，实现层层包埋，提高微球荧光染料分散度和包埋率，保证微球荧光强度，使得微球中的染料更稳定、更不易泄漏；并且使用层层包埋法制备微球可制备相对于粒径均匀且较大的微球，避免了常规聚合方法在到达一定粒度(通常至多约100nm)时便从反应体系中沉淀出来而无法继续反应；并且微球制备过程中无需有机溶剂，微球结构不会被有机溶剂破坏，内部不会残留有机溶剂，且更加绿色。此外，本发明的制备方法中无需加入任何致孔剂，且仅第一步骤需加入表面活性剂而其他步骤无需表面活性剂，相对成本节约。

以下，在研究了以下形成符合本发明的方法的优选实施方式的非限制性实施例之后，将更好地理解本发明。

除非另有说明，否则本文中的量以质量百分比表示。

实施例1：利用本发明的层层包埋法制备荧光微球

荧光染料的制备

将2mmoleucl3·6h2o溶于10ml无水乙醇。另外量取50ml无水乙醇置于烧瓶中，向其中加入6mmol二苯甲酰基甲烷(dbm)和2mmol1,10-菲啰啉，升温至50℃，然后缓慢加入eucl3·6h2o的乙醇溶液。混合均匀后，使用氢氧化钠溶液将ph调节至6～7，并反应4小时。反应结束后得到沉淀物，用无水乙醇离心清洗沉淀物，真空干燥得到eu(dbm)3phen粉末。

种子荧光微球的制备

称0.024g十二烷基磺酸钠和0.025gnahco3溶于16ml超纯水中得到混合溶液，取0.046geu(dbm)3phen溶于4ml苯乙烯(st)中，将eu(dbm)3phen/st溶液加入混合溶液中，超声乳化30分钟，乳化结束后，于室温搅拌1小时(300rpm)，随后通入n2排氧1小时，将温度升温至70℃，加入0.05g的过硫酸钾(kps)，反应6小时后，得到种子荧光微球。

层层包埋法制备荧光微球

将0.15g所得到的种子荧光微球分散于30ml超纯水中得到混合溶液，称0.075geu(dbm)3phen溶于2ml苯乙烯中，随后将该eu(dbm)3phen/st溶液加入到混合溶液中，于300rpm下搅拌溶胀16小时，随后通n2排氧1小时后，将温度升温至70℃，加入0.03g的kps，反应6小时后，得到荧光微球。

比较例1：常规一步法制备荧光微球

称0.024g十二烷基磺酸钠和0.025gnahco3溶于16ml的超纯水中得到混合溶液，取0.046geu(dbm)3phen溶于4ml的苯乙烯(st)中，将eu(dbm)3phen/st溶液加入混合溶液中，超声乳化30分钟，乳化结束后，室温搅拌1小时(300rpm)，随后通n2排氧1小时后，将温度升温至70℃，加入0.05g过硫酸钾(kps)，反应6小时后，得到荧光微球。

测试例1：评估微球直径

利用sigma500扫描电镜(德国蔡司，zeiss)对实施例1和比较例1得到的荧光微球进行表征。结果如图2中所示。其中，常规包埋法制备的微球粒径在100nm左右，且微球粒径不均一。而通过本发明的层层包埋法制备的荧光微球，粒径为200nm左右，且同时微球均一性较好。由此证实了，通过本发明的方法制备的荧光微球在增加微球粒径的同时，有效地提高微球的均一性，从而提高微球的稳定性和减少批间差。

实施例2：利用本发明的层层包埋法制备荧光微球

种子荧光微球的制备

称0.045g十二烷基磺酸钠和0.045gnahco3溶于30ml超纯水中得到混合溶液，取0.8geu(dbm)3phen溶于4ml的苯乙烯(st)中，将eu(dbm)3phen/st溶液加入混合溶液中，超声乳化30分钟，乳化结束后，于室温下搅拌1小时(300rpm)，随后通入n2排氧1小时，将温度升温至70℃，加入0.03g的过硫酸钾(kps)，反应6小时后，得到种子荧光微球。

层层包埋法制备荧光微球

将0.15g上述微球分散到30ml超纯水中得到混合溶液，称0.4geu(dbm)3phen溶于2ml的苯乙烯，将eu(dbm)3phen/st溶液加入到混合溶液中，于300rpm、室温下溶胀16小时后，通入n2排氧1小时，将温度升温70℃，加入0.03g的kps，反应6小时后，得到荧光微球eups@eups。

比较例2：制备内部有荧光染料，外部为连续相的荧光微球

步骤1：如实施例2中“种子荧光微球”步骤所示，制备种子荧光微球。

步骤2：将0.15g的上述微球分散到30ml的超纯水中，加入2ml的苯乙烯，于300rpm、室温下，溶胀16h后，通入n2排氧1小时，将温度升温70℃，加入0.03g的kps，反应6小时后，得到荧光微球eups@ps。

测试例2：评估微球的荧光强度

通过光谱扫描多功能读数仪(thermofisherscientific，varioskanflash)测试实施例2和比较2所得荧光微球的荧光强度，结果如图3所示。其中，(a)示出了比较例2和实施例2在365nm的激光波长下的荧光光谱曲线，(b)示出了比较例2和实施例2的荧光微球在365nm波长的激发下发出的荧光。从荧光光谱曲线可以看出，在365nm的激发波长下，eups@eups在615nm处的发射峰强度远高于eups@ps的发射峰强度。同时在365nm的激发波长下，如图b所示，eups@ps的荧光非常微弱，而eups@eups的荧光光强。从而证实了，通过本发明的层层包埋法可以提高微球的荧光强度，制备高荧光强度的荧光微球。

实施例3：制备功能化荧光微球

步骤1：如实施例1中所述，制备eu(dbm)3phen荧光染料。

步骤2：称0.0486g十二烷基磺酸钠和0.0506gnahco3溶于32ml超纯水中得到混合溶液，取0.1506geu(dbm)3phen溶于8ml苯乙烯(st)中，将eu(dbm)3phen/st溶液加入混合溶液中，超声乳化30分钟，乳化结束后，室温搅拌1小时(300rpm)，随后通入n2排氧1h，将温度升温至70℃，加入0.0503g过硫酸钾(kps)，反应5h后结束，得到荧光微球。

步骤3：将0.25g上述微球分散于50ml超纯水中得到混合溶液，称0.5007geu(dbm)3phen溶于3.35ml苯乙烯，将eu(dbm)3phen/st溶液加入到混合溶液中，300rpm室温溶胀16h后，通n2排氧1h后，将温度升温70℃，加入0.05gkps，反应6h后，得到荧光微球。

步骤4：取0.5g上述微球加入50ml超纯水中，300rpm搅拌1h后，通n2排氧1h后，加入30μl甲基丙烯酸(maa)，将温度升温至72℃，加入0.02gkps，反应5h后停止反应，得到甲基丙烯酸修饰的荧光微球。

测试例3

通过光谱扫描多功能读数仪(thermofisherscientific，varioskanflash)测试实施例3中的荧光微球，结果如图4所示。从荧光光谱曲线可以看出，在365nm的激发波长下，615nm处出现发射峰，这表明包埋甲基丙烯酸后，微球具有相当的荧光强度，因此，通过本发明的方法能够制备甲基丙烯酸修饰的荧光微球。

实施例4：制备功能化荧光微球

步骤1：如实施例1中所述，制备eu(dbm)3phen荧光染料。

步骤2：称0.0486g十二烷基磺酸钠和0.0506gnahco3溶于32ml超纯水中得到混合溶液，取0.1506geu(dbm)3phen溶于8ml苯乙烯(st)中，将eu(dbm)3phen/st溶液加入混合溶液中，超声乳化30分钟，乳化结束后，于室温搅拌1小时(300rpm)，随后通入n2排氧1小时，将温度升温至70℃，加入0.0503g过硫酸钾(kps)，反应5h后结束，得到荧光微球。

步骤3：将0.25g上述微球分散于50ml超纯水中得到混合溶液，称0.5007geu(dbm)3phen溶于3.35ml苯乙烯中，随后将eu(dbm)3phen/st溶液加入到混合溶液中，于300rpm、室温下溶胀16h后，通入n2排氧1小时，将温度升温70℃，加入0.05gkps，反应6小时后，得到荧光微球。

步骤4：取0.5g步骤3所得到的微球加入50ml超纯水中，于300rpm下搅拌1小时，随后通入n2排氧1h，加入100μl甲基丙烯酸甲酯(mma)，将温度升温至71℃，加入0.02gkps，反应5h后停止反应。冷却到室温过后，加入600μl50wt％naoh水溶液，于40℃下水解24h，制备羧基化荧光微球。

测试例4

同样地，通过光谱扫描多功能读数仪(thermofisherscientific，varioskanflash)测试实施例4中微球的荧光曲线。其中，分别对在步骤3结束后得到的荧光微球和最后所得到的羧基化荧光微球进行测试，结果如图5所示。从荧光光谱曲线可以看出，在365nm的激发波长下，这两者均在615nm处出现发射峰，并且两条荧光曲线重合，表明包埋甲基丙烯酸甲酯前后，微球的荧光强度无变化，并且证实了包埋甲基丙烯酸甲酯后进行的水解，对微球的稳定性及其荧光强度没有影响。由此表明通过层层包埋法能够制备功能化微球。

尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。